用于調(diào)節(jié)toso活性的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于調(diào)節(jié)Toso蛋白的活性的方法和組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋使用包括可溶性Toso蛋白的組合物治療與炎癥、自身免疫性病癥和癌癥相關(guān)的病癥。
【專利說明】用于調(diào)節(jié)TOSO活性的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年3月16提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/612, 183、2012年5月 11日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/646, 143和2012年11月29日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?61/731，428的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，所述臨時(shí)申請的內(nèi)容出于所有目的以引用的方式整體明確地 并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] Toso或Faim3 (Fas細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)分子3)是最初通過Jurkat細(xì)胞（一種T細(xì) 胞白血病家系）中的逆轉(zhuǎn)錄病毒過量表達(dá)篩選而表征的單個(gè)跨膜細(xì)胞表面受體，其作為 Fas-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的介體（Hitoshi，Y.等人，Toso, a cell surface, specific regulator of Fas-induced apoptosis in T cells. Immunity,1998. 8(4) :p. 461-71)。后 續(xù)研究已經(jīng)表明Toso是IgM的難以捉摸的受體。Toso的表達(dá)還似乎與慢性淋巴細(xì)胞性白 血病或CLL的特別侵襲性的形式相關(guān)。
[0005] 需要表征Toso的體內(nèi)作用以便鑒別其作為治療靶標(biāo)和用于包含能夠結(jié)合Toso和 /或調(diào)節(jié)其活性的藥劑的組合物的用途。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 因此，本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)Toso活性和治療與Toso有關(guān)的疾病和病癥的方法和 組合物。
[0008] -方面，本發(fā)明提供一種治療受試者中的自身免疫性病癥的方法，所述方法包括 用含有治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。在示例性實(shí)施方 案中，自身免疫性病癥是但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、狼瘡或I型糖尿病。
[0009] 另一方面，本發(fā)明提供一種治療受試者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括用 包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。
[0010] 一方面，本發(fā)明提供一種治療受試者中的哮喘的方法，所述方法包括用包含治療 有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者的步驟。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供通過向受試者施用具有SEQ ID N0 :5或6的氨基酸序列或 其片段或缺失變體的可溶性多肽來治療所述受試者中的糖尿病、哮喘、多發(fā)性硬化癥或類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。在其它實(shí)施方案中，受試者中的Toso活性在受試者中被降低。在仍 然其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過施用包含SEQ ID N0. 1-25中的任何一個(gè)或多個(gè)的氨基 酸序列的可溶性多肽來治療受試者中的糖尿病、哮喘、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的 方法。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供治療受:試者中的癌癥、過敏癥、C0PD、_ IgM綜合征、狼瘡或 中性白細(xì)胞增多癥相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋 白的組合物治療所述受試者的步驟。
[0013] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括 NP_005440. 1 (人Toso同種型a)的氨基酸殘基氨基酸P21至G251 (參見Shima等人，Int. Immunol.，2010,其特此出于所有目的并且特別是出于涉及Toso的胞外結(jié)構(gòu)域的所有教導(dǎo) 的目的而整體并入）。
[0014] 在仍然其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包 括人Toso蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的可溶性Toso蛋白包括 SEQ ID N0 :7的氨基酸殘基18-253。
[0015] 在仍然其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，用于本發(fā)明的方法中的可溶性 Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :5或6的氨基酸序列。在又其它實(shí)施方案中，可溶性Toso蛋 白包含與SEQ ID N0 :5或6具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在又其它實(shí)施方案 中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID N0:5或6的缺失變體。在仍然其它實(shí)施方案中 并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，用于本發(fā)明的方法中的可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0. 1-25 中的任何一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列。
[0016] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白是多聚 體。在仍然其它實(shí)施方案中，所述多聚體由6個(gè)單體組成。在仍然其它實(shí)施方案中，多聚體 Toso蛋白的每個(gè)單體包含根據(jù)SEQ ID N0 :6的序列。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供用于抑制Toso活性的方法，所述方法包括將可溶性Toso多 肽應(yīng)用至包含膜結(jié)合Toso受體的細(xì)胞。
[0018] 在仍然另一方面，本發(fā)明提供一種包括SEQ ID N0 :5或SEQ ID N0 :6的多肽的組 合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物抑制Toso活性。在另一實(shí)施方案中，所述多肽是多 聚體。在仍然另一實(shí)施方案中，所述多聚體包括6個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含根據(jù)SEQ ID NO :6的序列。
[0019] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種編碼根據(jù)本文所描述的任何蛋白質(zhì)的可溶性 Toso蛋白的分離的核酸。在仍然另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種表達(dá)編碼根據(jù)本文所描 述的任何蛋白質(zhì)的可溶性Toso蛋白的分離的核酸的宿主細(xì)胞。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供一種包含人Toso蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域、Fc區(qū)和多聚化標(biāo)簽的 融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述胞外結(jié)構(gòu)域包含人Toso蛋白的氨基酸21-251。在仍然 另一實(shí)施方案中，所述多聚化標(biāo)簽包含SEQ ID N0 :4。在又另一實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包含SEQ ID N0 :3。
[0021] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種編碼上述融合蛋白的分離的核酸。在仍然另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含編碼上述融合蛋白的核酸的宿主細(xì)胞。
[0022] 另一方面，本發(fā)明提供一種分離的可溶性多肽，所述多肽包含與SEQ ID N0. 8-24 或與包含SEQ ID NO :7的氨基酸殘基18-251的多肽區(qū)具有至少90%序列同一性的氨基酸 序列。
[0023] 另一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生編碼本文所描述的任何可溶性Toso蛋白的多肽 的方法，所述方法包括提供包含編碼所述多肽的核酸的細(xì)胞，將所述細(xì)胞在適于表達(dá)所述 多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種編碼本文所描述的任何可溶 性Toso蛋白的核酸。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖1示出與T〇S〇+小鼠中的炎癥有關(guān)的數(shù)據(jù)。圖1A示出使用數(shù)字測徑器如通過 踝關(guān)節(jié)厚度的變化測量的關(guān)節(jié)炎癥的量度。圖1B示出基于可見腫脹和活動(dòng)性的每個(gè)關(guān)節(jié) 的疾病嚴(yán)重程度得分。圖1C示出引流淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0026] 圖2示出來自關(guān)于T〇S〇f小鼠和野生型小鼠的OVA誘導(dǎo)的哮喘模型的數(shù)據(jù)。圖 2A示出哮喘模型的誘導(dǎo)的示意性圖解。圖2B示出如通過DifQuik染色評(píng)定的關(guān)于嗜酸性 粒細(xì)胞遷移至支氣管肺泡空間中的數(shù)據(jù)。圖2C示出通過對每個(gè)載玻片至少200個(gè)白細(xì)胞 進(jìn)行計(jì)數(shù)量化的關(guān)于嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)據(jù)。
[0027] 圖3A-C示出如通過ELISA評(píng)定的關(guān)于BALF中0VA誘導(dǎo)的TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-5 和IL-13的數(shù)據(jù)。圖3D示出關(guān)于BALF中的嗜酸性細(xì)胞活化趨化因子（Eotaxin)( -種嗜 酸性粒細(xì)胞虜獲C-C趨化因子）的數(shù)據(jù)。圖3E示出響應(yīng)于平滑肌細(xì)胞中的TNF a治療產(chǎn) 生的嗜酸性細(xì)胞活化趨化因子的水平。
[0028] 圖4示出關(guān)于Toso+小鼠中的IgE的數(shù)據(jù)。圖4A和B示出Toso+小鼠中的總 IgE水平和特異性IgE水平，并且圖4C示出野生型小鼠與TOSO+小鼠之間的IgGl水平。
[0029] 圖5示出與野生型對照相比T〇S〇+小鼠的Penh值。
[0030] 圖6示出野生型小鼠和Toso+小鼠中的M0G誘導(dǎo)的模型中的EAE得分。
[0031] 圖7A示出關(guān)于響應(yīng)于霧化的0VA，野生型動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液（BALF)中的細(xì) 胞因子產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，所述野生型動(dòng)物之前已氣管內(nèi)安裝有Tosc^樹突細(xì)胞和野生型樹突細(xì) 胞。圖7B示出源自用負(fù)載M0G 35_55的Tosof樹突細(xì)胞培養(yǎng)的2d2小鼠的T細(xì)胞的增殖。圖 7C示出靜脈內(nèi)注射負(fù)載GP的T 〇S〇f樹突細(xì)胞和野生型樹突細(xì)胞的RIP-GP動(dòng)物中的血糖 水平，和注射負(fù)載GP肽的野生型樹突細(xì)胞和TOSO+樹突細(xì)胞的RIP-GP小鼠的卡普蘭-邁 耶曲線（Kaplan-Meier plot)。RIP-GP小鼠是在大鼠胰島素啟動(dòng)子（RIP)的控制下表達(dá)來 自淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)的主要糖蛋白（GP)的小鼠-這種小鼠發(fā)展糖尿 病，如通過增加的血清葡萄糖水平所評(píng)定。
[0032] 圖8A是Toso可溶性受體的示意性圖解。圖8B示出關(guān)于所述可溶性受體的ELISA 數(shù)據(jù)。圖8C示出通過蛋白質(zhì)印跡（圖8Ci)和通過考馬斯藍(lán)染色（圖8Cii)獲得的Toso 可溶性受體分泌的數(shù)據(jù)確認(rèn)。圖8D示出Toso可溶性受體與脾細(xì)胞的結(jié)合數(shù)據(jù)。圖8E示 出指示Toso-Fc最顯著地結(jié)合脾中的⑶llc+MHChi成熟樹突細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和B220+B細(xì) 胞的進(jìn)一步數(shù)據(jù)。圖8F示出與板結(jié)合的人IgM結(jié)合的Toso-Fc的ELISA結(jié)果。圖8G示出 用每日50iig Toso-Fc治療的小鼠的正常重量增加。
[0033] 圖9A是用于0VA誘導(dǎo)的哮喘的鼠類模型的治療方案的示意性圖解。圖9B示出關(guān) 于BALF中的Th2細(xì)胞因子的數(shù)據(jù)，并且圖9C示出BALF中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，其均為疾病嚴(yán) 重程度的量度。
[0034] 圖10提供本發(fā)明的實(shí)施方案的序列，包括可溶性Toso蛋白（圖10A)、IL-2信號(hào) 序列（圖l〇B)、Fc結(jié)構(gòu)域（圖10C)以及六聚化（hexamerization)標(biāo)簽（圖10D)的序列。
[0035] 圖11A提供包含六聚體標(biāo)簽、允許表達(dá)所述可溶性受體的多聚體形式的可溶性 Toso蛋白的實(shí)施方案的序列。圖11B提供人Toso蛋白NP_005440. 1 (SEQ ID N0 :7)的序 列。
[0036] 圖12示出粒細(xì)胞上的T0S0表達(dá)。a :RNA是從野生型（WT)小鼠和Toso+小鼠的 脾和肝分離的。使用RT-PCR對Toso RNA進(jìn)行分析并且將其表示為每18S RNA的表達(dá)（n = 4)。b :將來自C57BL/6小鼠和TOSO+小鼠的脾細(xì)胞針對CD19 (B細(xì)胞）和CD3 (T細(xì)胞）進(jìn) 行染色并且用大鼠抗小鼠Toso抗體或同種型對照進(jìn)行共染色。灰色區(qū)域指示同種型對照， 粗線指示用抗Toso抗體染色。示出CD19陽性細(xì)胞（B細(xì)胞）和CD3陽性細(xì)胞（T細(xì)胞）的 一個(gè)代表性條帶圖。c :將來自C57BL/6小鼠和TOSO+小鼠的脾細(xì)胞和血液白細(xì)胞針對Grl 連同大鼠抗小鼠Toso抗體或同種型對照進(jìn)行染色?；疑珔^(qū)域指示同種型對照，粗線指示用 Toso染色。示出Grl陽性細(xì)胞的一個(gè)代表性條帶圖。d :將來自野生型小鼠和TOSO+小鼠 的血液白細(xì)胞通過前向和側(cè)向散射針對粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。示出每yl淋巴細(xì)胞 數(shù)目（n = 4)。e :將淋巴細(xì)胞針對⑶4T細(xì)胞（⑶3+CD8-細(xì)胞）、⑶8T細(xì)胞（⑶3+⑶8+細(xì)胞） 和B細(xì)胞（B220+細(xì)胞，n = 4)進(jìn)行分析。f :對來自野生型小鼠和TOSO+小鼠的脾重量進(jìn) 行分析（n = 4)。g :將脾淋巴細(xì)胞針對⑶4T細(xì)胞（⑶3+⑶8_細(xì)胞）、⑶8T細(xì)胞（⑶3+CD8+細(xì) 胞）和B細(xì)胞（B220+細(xì)胞，n = 4)進(jìn)行分析。
[0037] 圖13示出活化閾值在T0S0缺陷小鼠的粒細(xì)胞中被降低。13a :將來自野生型小鼠 或TOSO+小鼠的血液與不同濃度的fMLP在37°C下孵育30分鐘。如方法中所描述通過R0S 產(chǎn)生（二氫羅丹明染色）和脫粒（側(cè)向散射）來測量粒細(xì)胞的活化。示出在粒細(xì)胞上門控 的細(xì)胞的一個(gè)代表性點(diǎn)陣圖。門設(shè)置在活化的粒細(xì)胞上。給出活化的粒細(xì)胞的百分比（n =6)。13b :將來自WT小鼠和TOSO+小鼠的血液與不同濃度的TNF-a -起孵育。給出活 化的粒細(xì)胞的百分比（n = 6)。13c :將來自WT小鼠和T〇S〇f小鼠的血液與不同濃度的脂 多糖一起孵育。給出活化的粒細(xì)胞的百分比（n = 6)。13d :將來自WT小鼠和T〇S〇+小鼠 的血液與不同濃度的GM-CSF(作為來自X630細(xì)胞的上清液的百分比給出）一起孵育。給 出活化的粒細(xì)胞的百分比（n = 6)。13e:將來自野生型小鼠和T〇S〇+小鼠的血液用10% GM-CSF上清液或500ng/ml LPS引發(fā)。在30分鐘之后，將細(xì)胞用2 ii M fMLP刺激15分鐘。 給出活化的粒細(xì)胞的百分比（n = 6)。13f :將來自WT小鼠和TOSO+小鼠的血液在不同溫 度下孵育30分鐘。使用側(cè)向散射來測量脫粒。給出脫粒的細(xì)胞的百分比（n = 6)。
[0038] 圖14示出粒細(xì)胞中的活化閾值被內(nèi)在地調(diào)控。將C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行輻射 處理并且如方法中所描述用來自攜帶CD45基因中的點(diǎn)突變的野生型小鼠（CD45. 1，組1)、 Tosof小鼠（CD45. 2,組2)或野生型（CD45. 1)骨髓與TOSO+骨髓細(xì)胞的1 : 1混合物 (⑶45.2,組3)的骨髓進(jìn)行重構(gòu)。在骨髓移植之后30天，將外周血用fMLP進(jìn)行刺激并且針 對活化的粒細(xì)胞進(jìn)行分析。14a :示出針對Grl門控的并且針對⑶45. 1、⑶45. 2和二氫羅丹 明（R0S)染色的細(xì)胞的代表性FACS圖。14b:量化三組不同的骨髓嵌合體的粒細(xì)胞百分比 (n = 8)。14c :對根據(jù)圖3a中的門通過側(cè)向散射和R0S產(chǎn)生測量的活化的粒細(xì)胞的百分比 進(jìn)行分析（n = 8)。14d :針對總粒細(xì)胞和活化的粒細(xì)胞分析側(cè)向散射和二氫羅丹明（R0S) 的平均熒光強(qiáng)度（n = 8)。
[0039] 圖15示出Toso缺陷小鼠中李斯特氏菌的控制受損。15a :將Tosof小鼠和相應(yīng) 野生型小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。監(jiān)測存活率（n = 8-15)。15b :將TOSO+小鼠 和相應(yīng)野生型小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在感染后第0天和第2天測量血液粒細(xì) 胞中的粒細(xì)胞活化（R0S形成）（n = 4-5)。15c :將WT和TOSO+小鼠用1x106CFU的李斯特 氏菌感染。對天然WT小鼠和感染后六小時(shí)的李斯特氏菌感染的WT小鼠和Toso^小鼠的 血漿中的髓過氧化物酶進(jìn)行分析（n = 4)。15d :將Tosof小鼠和相應(yīng)WT小鼠用1x106CFU 的單核細(xì)胞增生李斯特菌感染。在20小時(shí)之后分析肝組織學(xué)。示出一個(gè)代表性載玻片（n =4)。比例尺=50 ii m。15e :將T0S0+小鼠和相應(yīng)WT小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感 染。在一天之后，測量脾和肝的粒細(xì)胞中的R0S產(chǎn)生（n = 3)。f :將TOSO+小鼠和相應(yīng)WT 小鼠用1x104CFU的李斯特氏菌感染。在感染后第3和第4天，分析脾、肝和腦中的李斯特 氏菌滴度（n = 6)。
[0040] 圖16示出CDllb和CD18的表達(dá)受Toso影響。16a :將來自Toso+小鼠和相應(yīng)WT 小鼠的血液粒細(xì)胞進(jìn)行福爾馬林固定并且然后針對CDlla、CDllb和CD18進(jìn)行染色。示出平 均突光表達(dá)（n = 6)。p值源自配對的學(xué)生t檢驗(yàn)。16b :將來自野生型小鼠和Tos〇f小鼠 的血液用不同濃度的GM-CSF和LPS進(jìn)行刺激。示出粒細(xì)胞上的CDllb的平均熒光表達(dá)（n =6)。16c :將來自Cdllb+小鼠和相應(yīng)野生型小鼠的血液粒細(xì)胞用2 ii M fMLP或用40% GM-CSF上清液還有2 ii M fMLP進(jìn)行刺激。給出⑶lib和⑶18的平均熒光強(qiáng)度（n = 4)。 16d :將來自Cdllb+小鼠和相應(yīng)野生型小鼠的血液粒細(xì)胞用2iiM fMLP或用40% GM-CSF 上清液還有2 yM fMLP進(jìn)行刺激。給出活化的粒細(xì)胞的百分比（n = 4)。給出總粒細(xì)胞以 及活化的粒細(xì)胞的R0S染色的平均熒光強(qiáng)度（n = 4)。
[0041] 圖17示出Toso+粒細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。將來自TOSO+-的血液在37°C下在有或 沒有GM-CSF(10%)的情況下孵育。在一小時(shí)和七小時(shí)之后用Annexin V和7AAD測量細(xì)胞 凋亡（n = 4)。
[0042] 圖18示出在TOSO+小鼠感染之后的李斯特氏菌菌血癥。將TOSO+-小鼠和相應(yīng) 野生型小鼠用1x106CFU的單核細(xì)胞增生李斯特菌感染。在感染后一小時(shí)和20小時(shí)評(píng)定血 液李斯特氏菌滴度（n = 4)。
[0043] 圖19示出來自在開始高脂肪飲食之后的野生型小鼠和TOSO+小鼠的數(shù)據(jù)。圖19A 示出野生型和T 〇S〇+雄性小鼠的體重，自開始于5周大的高脂肪飲食開始監(jiān)測體重。圖19B 示出在高脂肪飲食后14周時(shí)兩組小鼠中的食物攝取的測量值。
[0044] 圖20A示出來自在開始高脂肪飲食之后的野生型小鼠和TOSO+小鼠的葡萄糖耐 量試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。圖20B示出來自同一組小鼠的胰島素耐量試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
[0045] 圖21示出說明用常規(guī)食物（非高脂肪）飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠和TOSO+小鼠展 示出類似水平的葡萄糖耐量（圖21A)和胰島素耐量（圖21B)的數(shù)據(jù)。
[0046] 圖22示出關(guān)于在用可溶性Toso蛋白治療之前（圖22A)和治療之后（圖22B)的 葡萄糖耐量的數(shù)據(jù)。
[0047] 圖23示出與用可溶性Toso蛋白治療的小鼠（Toso-Fc-實(shí)心正方形）相比，用PBS 治療的小鼠（實(shí)心圓）中的EAE臨床得分。
[0048] 圖24A示出比較用對照媒介物治療的小鼠（實(shí)現(xiàn)圓）和用可溶性Toso蛋白治療的 小鼠（Toso-Fc-空心正方形）治療的小鼠中的累加關(guān)節(jié)炎得分的關(guān)節(jié)炎小鼠模型。圖24B 示出如與對照（媒介物-實(shí)心圓）相比，來自比較Toso-Fc治療的小鼠（Toso-Fc-空心正 方形）中的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率百分比的關(guān)節(jié)炎小鼠模型的數(shù)據(jù)。
[0049] 圖25示出對用Toso-Fc治療的脾細(xì)胞中的膠原減少的增殖應(yīng)答。
[0050] 圖26示出如與對照（媒介物-實(shí)心圓）相比，可溶性Toso蛋白（Toso-Fc-空心 正方形）在關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的治療作用。
[0051] 圖27A-C提供本發(fā)明的可溶性Toso蛋白的不同實(shí)施方案的序列。
[0052] 發(fā)明詳述
[0053] 除非另外指示，否則本發(fā)明的實(shí)踐可以采用本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)的有機(jī)化學(xué)、聚 合物技術(shù)、分子生物學(xué)（包括重組技術(shù)）、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù) 和描述。這類常規(guī)技術(shù)包括聚合物陣列合成、雜交、連接、噬菌體展示和使用標(biāo)記檢測雜 交。適合的技術(shù)的具體說明可以參考本文以下實(shí)施例。然而，當(dāng)然還可以使用其它等 效常規(guī)程序。這類常規(guī)技術(shù)和描述可在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊中找到，如Genome Analysis :A Laboratory Manual Series (第 I-IV 卷），Using Antibodies ：A Laboratory Manual, Cells ：A Laboratory Manual, PCR Primer ：A Laboratory Manual 和 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (全部來自冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社），Stryer, L. (1995) Biochemistry(第 4 版)Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis ： A Practical Approach，'1984, IRL Press, London, Nelson 和 Cox(2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 第 3 版，W.H. Freeman Pub.，New York, N.Y?和 Berg 等人 (2002)Biochemistry，第 5 版，W.H.Freeman Pub.，New York，N. Y?，所述文獻(xiàn)全部出于所有 目的以引用的方式整體并入本文。
[0054] 應(yīng)注意，除非上下文另外明確地規(guī)定，否則如在本文和所附權(quán)利要求書中所使用， 單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述"包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及"一種聚合酶"是指 一種試劑或這類試劑的混合物，并且提及"所述方法"包括提及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效 步驟和方法等等。
[0055] 除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng) 域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。出于描述和公開描述于本公布中并且可能 與目前所描述的發(fā)明結(jié)合使用的裝置、組合物、制劑以及方法學(xué)的目的，本文所提及的所有 公布均以引用的方式并入本文。
[0056] 如果提供一定范圍的值，那么應(yīng)理解除非上下文另外清楚地規(guī)定，否則本發(fā)明內(nèi) 包涵所述范圍的上限與下限之間的各插入值（至下限單位的十分之一）和在所陳述的范圍 中的任何其它陳述值或插入值。本發(fā)明內(nèi)還包涵可以獨(dú)立地包括于這些較小范圍中的所述 較小范圍的上限和下限，從屬于所陳述的范圍中的任何具體排除的限值。如果所陳述的范 圍包括一個(gè)或兩個(gè)限值，那么排除任一個(gè)或兩個(gè)所包括的限值的范圍也包括于本發(fā)明中。
[0057] 在以下描述中，闡述大量具體細(xì)節(jié)以便提供本發(fā)明的更詳盡的理解。然而，對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員將是清楚的：可以在無一種或多種這些具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)踐本發(fā)明。在其 它情況下，并未描述本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的熟知特征和程序，以便避免混淆本發(fā)明。
[0058] 如本文所用，術(shù)語"包含"意圖意味組合物和方法包括所述要素，但不排除其它要 素。"基本上由……組成"在用于定義組合物和方法時(shí)將意味排除具有為組合物或方法所必 需的任何意義的其它要素。"由……組成"將意味排除超過所要求保護(hù)的組合物的其它成 分的痕量元素和實(shí)質(zhì)性方法步驟。由這些過渡術(shù)語的各者定義的實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。因此，意圖所述方法和組合物可包括另外步驟和組分（包含）或可替代地包括不具有 意義的步驟和組合物（基本上由……組成）或可替代地，意圖僅包括所陳述的方法步驟或 組合物（由......組成）。
[0059] 所有數(shù)字標(biāo)識(shí)，例如pH、溫度、時(shí)間、濃度和分子量（包括范圍）是以0.1的增量 (+)或（_)變化的近似值。應(yīng)理解，雖然并非總是明確地說明，但是所有數(shù)字標(biāo)識(shí)都應(yīng)在前 面加上術(shù)語"約"。術(shù)語"約"除"X"的較小增量如"X+0. 1"或"X-0. 1"之外還包括精確值 "X"。還應(yīng)理解，雖然并非總是明確地說明，但是本文所描述的試劑僅是示例性的并且所述 試劑的等效物是本領(lǐng)域已知的。
[0060] "組合物"可包括包含藥劑或化合物的任何物質(zhì)，并且還意圖涵蓋藥劑或化合物與 其它物質(zhì)（包括載體）（例如，惰性（例如，可檢測藥劑或標(biāo)記）或活性的化合物或組合物） 的任何組合，所述載體如佐劑、稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐 劑等。載體還包括藥物賦形劑和添加劑、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物（例如，糖， 包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖）；衍生的糖，如糖醇、醛糖酸、酯化的糖等；以及多糖或 糖聚合物），所述載體可單獨(dú)地或組合存在，獨(dú)自或組合占1-99. 99重量％或體積％。示例 性蛋白質(zhì)賦形劑包括血清白蛋白如人血清白蛋白（HSA)、重組人白蛋白（rHA)，明膠，酪蛋 白等。還可在緩沖能力中起作用的代表性氨基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、 甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、 苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物賦形劑也意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其實(shí)例包括但不限于 單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖 維二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露醇、木糖 醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
[0061] 可與術(shù)語生物相容的載體或介質(zhì)互換使用的術(shù)語藥學(xué)上可接受的載體（或介質(zhì)） 是指不僅與有待治療性使用的細(xì)胞和其它藥劑相容，而且在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適合用 于與人和動(dòng)物組織相接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其它并發(fā)癥、與合理的益處/ 風(fēng)險(xiǎn)比相稱的試劑、細(xì)胞、化合物、材料、組合物和/或劑型。適合用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接 受的載體包括液體、半固體（例如，凝膠）和固體材料（例如，細(xì)胞支架和基質(zhì)、管材片材和 如本領(lǐng)域已知和本文更詳細(xì)地描述的任何這類材料）。這些半固體和固體材料可被設(shè)計(jì)成 抵抗身體內(nèi)的降解（不可降解的）或它們可被設(shè)計(jì)成在身體內(nèi)降解（生物可降解的、生物 可侵蝕的）。生物可降解的材料可進(jìn)一步是可生物再吸收的或生物可吸收的，即，它可以被 溶解并且吸收至體液（水可溶性移植物是一個(gè)實(shí)例）中或通過轉(zhuǎn)化成其它材料或通過天然 途徑分解并且消除來降解并且最終從身體消除。
[0062] 如本文所用，術(shù)語"患者"或"受試者"意指動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或更進(jìn)一步人患者。僅 出于說明目的，哺乳動(dòng)物包括但不限于人、猿猴、鼠類、牛、馬、豬或綿羊。
[0063] 如本文所用，術(shù)語"寡核苷酸"或"多核苷酸"是指由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸 或其任何組合組成的短聚合物。寡核苷酸的長度通常為至少約10、15、20、25、30、40、50、60、 70、80、90、100或更多個(gè)核苷酸。寡核苷酸可用作引物或用作探針。
[0064] 術(shù)語"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似 的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那 些，以及稍后被修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和鄰-磷酸絲氨酸。 氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)（即，結(jié)合氫的a碳、羧 基、氨基和R基），例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物具有 經(jīng)過修飾的R基團(tuán)（例如，正亮氨酸）或經(jīng)過修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相 同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、但以類 似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化學(xué)化合物。
[0065] 如本文所用的術(shù)語"分離的"是指基本上不含其它材料的分子或生物材料或細(xì)胞 材料（例如，大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98% )。一方面，術(shù)語"分離的" 是指核酸，如分別與其它DNA或RNA、或蛋白質(zhì)或多肽、或細(xì)胞或細(xì)胞器、或組織或器官分離 的DNA或RNA、或蛋白質(zhì)或多肽、或細(xì)胞或細(xì)胞器、或組織或器官，其存在于天然來源中并且 允許操作所述材料以便實(shí)現(xiàn)在存在于其天然或自然狀態(tài)的情況下不可獲得的結(jié)果（例如， 重組復(fù)制或通過突變操作）。術(shù)語"分離的"還指當(dāng)化學(xué)合成時(shí)在通過重組DNA技術(shù)或化學(xué) 前體或其它化學(xué)品產(chǎn)生時(shí)基本上不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基的核酸或肽。此外，"分 離的核酸"意味包括并非以片段形式天然存在并且將不能以天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的核酸片段。術(shù) 語"分離的"在本文還用于指從其它細(xì)胞蛋白分離的多肽并且意味涵蓋純化的多肽和重組 多肽兩者，例如，具有大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、98%、或99%的純度。術(shù) 語"分離的"在本文還用于指從其它細(xì)胞或組織分離的細(xì)胞或組織并且意味涵蓋培養(yǎng)的細(xì) 胞或組織和工程化的細(xì)胞和組織兩者。
[0066] "重組"核酸是指通過組合通常不一起存在的兩個(gè)或更多個(gè)序列而形成的人工核 酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，它是通過將相關(guān)DNA引入現(xiàn)有生物體DNA (如細(xì)菌的質(zhì)粒）中以便 編碼或改變不同性狀以用于具體目的（如抗生素抗性）來形成。"重組"多肽是衍生自重組 核酸的多肽。
[0067] 如本文所用，術(shù)語"啟動(dòng)子"是指足以指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。還包括于本發(fā)明 中的是足以使啟動(dòng)子依賴性基因表達(dá)可針對細(xì)胞類型特異性、組織特異性控制或可通過外 部信號(hào)或藥劑誘導(dǎo)的那些啟動(dòng)子元件。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或離散啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可通過 化學(xué)或物理?xiàng)l件如溫度或光開啟?；瘜W(xué)啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于醇調(diào)控的、四環(huán)素調(diào) 控的、類固醇調(diào)控的、金屬調(diào)控的和發(fā)病機(jī)制調(diào)控的啟動(dòng)子。離散啟動(dòng)子的實(shí)例可在例如 Wolfe 等人 Molecular Endocrinology 16(3) :435_49 中找到。
[0069] 如本文所用，術(shù)語"調(diào)控元件"是指足能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。調(diào)控元件的 非限制性實(shí)例包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列。調(diào)控元件可存 在于天然基因的5'或3'區(qū)或內(nèi)含子內(nèi)。
[0070] 各種蛋白質(zhì)也在本文公開，具有針對其人蛋白和編碼序列的其GenBank登錄號(hào)。 然而，蛋白質(zhì)不限于源自人的具有由所公開的GenBank登錄號(hào)表示的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)，但可具有源自其它動(dòng)物，具體地說溫血?jiǎng)游铮ɡ?，大鼠、豚鼠、小鼠、雞、兔、豬、免疫、 牛、猴等）的氨基酸序列。
[0071 ] 如本文所用，術(shù)語"Toso"、"FAM3"或"Fas細(xì)胞凋亡抑制分子3"是指具有 與代表性Toso序列中的任一種基本上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，包括GenBank登錄 號(hào) NP_001135945(人同種型 b)、NP_001180267(人同種型 c)、NP_005440(人同種型 a)、 NP_081252 (小鼠）或NP_001014843 (大鼠）的任何和所有型式。編碼Toso的合適的cDNA 在 GenBank 登錄號(hào) NM_001142473、NM_001193338、NM_005449、NM_026976 和 NM_001014843 提供。
[0072] 如本文所用，術(shù)語"Toso的生物活性"或"Toso活性"是指與全長天然Toso蛋白 相關(guān)的任何生物活性。在一些實(shí)施方案中，Toso的生物活性是指結(jié)合IgM抗體。在其它實(shí) 施方案中，Toso的生物活性是指抑制⑶lib或⑶18活性。在仍然其它實(shí)施方案中，Toso的 生物活性是指增加粒細(xì)胞的活化閾值?？赏ㄟ^來自骨髓的活化的粒細(xì)胞的數(shù)目測量活化閾 值。在其它實(shí)施方案中，Toso的生物活性包括樹突細(xì)胞的活化和其將抗原呈遞至T細(xì)胞的 能力。在其它實(shí)施方案中，Toso的生物活性包括抑制細(xì)胞凋亡或增強(qiáng)TNF信號(hào)傳導(dǎo)。在一 些實(shí)施方案中，Toso生物活性等效于具有由GenBank登錄號(hào)NP_001135945、NP_001180267、 NP_005440、NP_081252或NP_001014843表示的氨基酸序列（包括這些登錄號(hào)的任何和所 有型式）的蛋白質(zhì)的活性。
[0073] 如本文所用，術(shù)語"⑶1 lb"、" ITGAM"或" ITGAM整聯(lián)蛋白，a M(補(bǔ)體組分3受體3 亞基）"是指具有與GenBank登錄號(hào)NP_000623的代表性⑶1 lb序列基本相同的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。編碼⑶lib的合適的cDNA在GenBank登錄號(hào)NP_000632提供。
[0074] 如本文所用，術(shù)語"⑶lib的生物活性"是指與全長天然⑶lib蛋白相關(guān)的任何 生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，⑶lib的生物活性是指與02鏈（ITGB2)組合以形成白細(xì) 胞特異性整聯(lián)蛋白。在合適的實(shí)施方案中，⑶lib生物活性等效于具有由GenBank登錄號(hào) NP_000623表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的活性。轉(zhuǎn)錄活性的測量可使用任何已知的方法進(jìn) 行，如免疫組織化學(xué)、報(bào)告基因測定或RT-PCR。
[0075] 如本文所用，術(shù)語"CD18"、"ITGB2"或"ITGB2整聯(lián)蛋白，@ 2(補(bǔ)體組分3受體3 和4亞基）"是指具有與GenBank登錄號(hào)NP_000202的代表性⑶18序列基本相同的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)。編碼⑶18的合適的cDNA在GenBank登錄號(hào)NP_000211提供。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"治療"是指出于通過減輕、緩解、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防疾病或病癥的至少 一種不良作用或癥狀來改善患者的狀況的目的而施用藥物組合物。
[0077] 如本文所用，術(shù)語"預(yù)防"是指鑒別受試者（即，患者）對疾病具有增加的易感性 但尚未表現(xiàn)出所述疾病的癥狀，并且施用根據(jù)本公開的原理的療法。預(yù)防性療法被設(shè)計(jì)成 降低易感受試者稍后將變成癥狀性或所述疾病將比它在不存在所述預(yù)防性療法的情況下 所將會(huì)的更緩慢地延遲發(fā)作或進(jìn)展的可能性。受試者可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ǎòɡ缤?過鑒別疾病的家族病史或其它退行性腦部病癥）被鑒別為具有發(fā)展所述疾病的增加的可 能性，或具有指示疾病或?qū)膊〉囊赘行缘囊环N或多種診斷標(biāo)志物。
[0078] 如本文所用，術(shù)語"樣本"或"測試樣本"是指含有核酸的任何液體或固體材料。在 合適的實(shí)施方案中，測試樣本是從生物來源獲得的（即，"生物樣本")，如培養(yǎng)物中的細(xì)胞或 來自動(dòng)物、更優(yōu)選人的組織樣本。
[0079] 如本文所用，術(shù)語"基本上相同"當(dāng)提及蛋白質(zhì)或多肽時(shí)意味與參考氨基酸序列具 有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的氨基酸序列。比較的長度優(yōu)選是所述多 肽或蛋白質(zhì)的全長，但通常是至少10、15、20、25、30、40、50、60、80或100或更多個(gè)連續(xù)氨基 酸。"基本上相同的"核酸是與參考核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98 %或99 %序列同一性的核酸序列。比較的長度優(yōu)選是所述核酸的全長，但通常是至少20 個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、75個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、125個(gè)核苷 酸、或更多。
[0080] 如本文所用，"氨基酸取代"或"取代"是指起始多肽序列中特定位置處的氨基酸被 另一氨基酸替換。例如，取代M23Y是指位置23處的蛋氨酸被酪氨酸替換的變異多肽。
[0081] 蛋白質(zhì)或核酸的"生物等效物"是指與所述蛋白質(zhì)或核酸在氨基酸或核酸序列方 面基本相同或具有等效生物活性的蛋白質(zhì)或核酸。
[0082] 如本文所用，術(shù)語"有效量"是指以足以向患者提供醫(yī)學(xué)益處的頻率遞送的化合物 (例如，Toso蛋白或其生物活性片段）的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的有效量是足以治 療或改善疾病的癥狀的量。
[0083] 細(xì)胞的群體意圖指在表型和/或基因型方面完全相同（克?。┗虿煌耆嗤亩?于一個(gè)細(xì)胞的合集。
[0084] "基本上同質(zhì)"描述其中多于約50%或可替代地多于約60%、或可替代地多于 70 %、或可替代地多于75 %、或可替代地多于80 %、或可替代地多于85 %、或可替代地多于 90%、或可替代地多于95%的細(xì)胞具有相同或相似表型的細(xì)胞群體。表型可通過預(yù)選選擇 的細(xì)胞表面標(biāo)志物或其它標(biāo)志物來確定。
[0085] 術(shù)語自體轉(zhuǎn)移、自體移植、自身移植物等是指其中細(xì)胞供體也是細(xì)胞替代療法的 受體的治療。術(shù)語同種異體轉(zhuǎn)移、同種異體移植、同種異體移植物等是指其中細(xì)胞供體具有 與細(xì)胞替代療法的受體相同的物種，但不是同一個(gè)體的治療。供體的細(xì)胞已經(jīng)與受體組織 相容性匹配的細(xì)胞轉(zhuǎn)移有時(shí)被稱為同系轉(zhuǎn)移。術(shù)語異種轉(zhuǎn)移、異種移植、異種移植物等是指 其中細(xì)胞供體具有與細(xì)胞替代療法的受體不同物種的治療。
[0086] 如本文所用，"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段或單鏈。因此，術(shù)語"抗 體"包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任何蛋白質(zhì)或肽。這種的實(shí)例包 括但不限于重鏈或輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈 或輕鏈恒定區(qū)、框架（FR)區(qū)或其任何部分，或結(jié)合蛋白的至少一部分。通常，術(shù)語"抗體"包 括任何多肽，所述多肽包括至少一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，包括但不限于CHI、CH2、CH3以及CL。適 用于本發(fā)明中的抗體可采取如本文所描述的多種形式，包括傳統(tǒng)抗體以及抗體衍生物、片 段和模擬物
[0087] 所述抗體可以是多克隆的或單克隆的并且可分離自任何合適的生物來源，例如， 鼠類、大鼠、綿羊和犬。
[0088] 單克隆抗體是由細(xì)胞或雜交瘤的單個(gè)克隆產(chǎn)生的抗體，并且因此是單一純同質(zhì)類 型的抗體。
[0089] 雜交瘤是在實(shí)驗(yàn)室中由產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞與不產(chǎn)生抗體的癌細(xì)胞（通常是骨 髓瘤或淋巴瘤）的融合產(chǎn)生的細(xì)胞。雜交瘤增殖并且產(chǎn)生特定單克隆抗體的連續(xù)供應(yīng)。 [0090] 如本文所用的術(shù)語"人抗體"意圖包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū) 和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘 基（例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變）。然而，如 本文所用的術(shù)語"人抗體"不意圖包括其中源自另一種哺乳動(dòng)物物種（如小鼠）的種系的 CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。因此，如本文所用，術(shù)語"人抗體"是指其中蛋白 質(zhì)的基本上每一部分（例如，⑶R、框架、Q、C H結(jié)構(gòu)域（例如，CH1、CH2、CH3)、鉸鏈、（VL，VH)) 在人中基本上無免疫原性、僅具有較小序列變化或變異的抗體。類似地，指定為靈長類動(dòng)物 (猴、狒狒、黑猩猩等）、嚙齒類動(dòng)物（小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠等）和其它哺乳動(dòng)物的抗體 指定這類物種、亞屬、屬、亞科、科特異性抗體。此外，嵌合抗議包括上述的任何組合。相對 于非修飾的抗體，這類變化或變異任選地和優(yōu)選地保留或減少在人或其它物種中的免疫原 性。因此，人抗體不同于嵌合或人源化抗體。應(yīng)指出人抗體可由能夠表達(dá)功能性重排的人 免疫球蛋白（例如，重鏈和/或輕鏈）基因的非人動(dòng)物或原核生物或真核細(xì)胞產(chǎn)生。此外， 當(dāng)人抗體是單鏈抗體時(shí)，它可包含未在天然人抗體中發(fā)現(xiàn)的接頭肽。例如，F(xiàn)v可包含連接 重鏈的可變區(qū)與輕鏈的可變區(qū)的接頭肽，如兩個(gè)至約八個(gè)甘氨酸或其它氨基酸殘基。這類 接頭肽被認(rèn)為具有人起源。
[0091] 如本文所用，如果人抗體是從使用人免疫球蛋白序列的系統(tǒng)，例如通過對攜帶人 免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫獲得，那么所述 抗體是"源自"特定種系序列。"源自"人種系免疫球蛋白序列的人抗體可通過將人抗體的 氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較這樣來鑒別。所選擇的人抗體與 由人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上通常是至少90%同一的，并且 當(dāng)與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列（例如，鼠類種系序列）相比時(shí)，包含鑒別所述 人抗體為人的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體與由所述種系免疫球蛋白基因編碼的氨 基酸序列在氨基酸序列上可以是至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一的。通 常，源自具體人種系序列的人抗體將展示出與由所述人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸 序列不多于10個(gè)氨基酸的差異。在某些情況下，所述人抗體可以展示出與由所述種系免疫 球蛋白基因編碼的氨基酸序列不多于5個(gè)，或甚至不多于4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)氨基酸的差 異。
[0092] 如本文所用，術(shù)語"重組人抗體"包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所 有人抗體，如從動(dòng)物（例如，小鼠）分離的抗體，所述動(dòng)物對于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因 的或轉(zhuǎn)染色體的，或自所述動(dòng)物制備的雜交瘤；從被轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述抗體的宿主細(xì)胞（例 如，從轉(zhuǎn)染瘤）分離的抗體；從重組、組合人抗體文庫分離的抗體；以及通過任何其它手段 制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，所述手段涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序 列。所述重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí) 施方案中，所述重組人抗體可經(jīng)受體外誘變（或當(dāng)使用針對人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，經(jīng) 受體內(nèi)體細(xì)胞誘變），并且因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是雖然來源于并且相 關(guān)于人種系VH和VL序列，但可能不天然地存在于體內(nèi)人抗體種系譜系內(nèi)的序列。本文描 述了用于制備這些抗體的方法。
[0093] 如本文所用的"同種型"意指通過其恒定區(qū)的化學(xué)特征和抗原特征來定義的任何 免疫球蛋白的亞類。應(yīng)了解，治療性抗體也可包含同種型和/或亞類的雜交體。
[0094] 如本文所用的術(shù)語"多克隆抗體"或"多克隆抗體組合物"是指源自不同B細(xì)胞系 的抗體制劑。它們是針對特異性抗原分泌的免疫球蛋白分子（各自識(shí)別不同表位）的混合 物。
[0095] 如本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗 體分子的制劑。單克隆抗體組合物針對具體表位展示出單一結(jié)合特異性和親和性。
[0096] 如本文所用，術(shù)語"標(biāo)記"意指直接或間接地綴合至待檢測的組合物的直接或間接 可檢測的化合物或組合物，例如，N末端組氨酸標(biāo)簽（N-His)、磁活性同位素（例如，115Sn、 117Sn和119Sn)、非放射性同位素（如13C和15N)、多核苷酸或蛋白質(zhì)（如抗體），以便產(chǎn)生"標(biāo) 記的"組合物。所述術(shù)語還包括綴合至多核苷酸、將在表達(dá)插入序列時(shí)提供信號(hào)的序列，如 綠色熒光蛋白（GFP)等。所述標(biāo)記本身是可檢測的（例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記）， 或在酶標(biāo)記的情況下，可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。所述標(biāo)記可適 合于小規(guī)模檢測或更適合于高通量篩選。如此，合適的標(biāo)記包括但不限于磁活性同位素、非 放射性同位素、放射性同位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光化合物、染料以及蛋白質(zhì)，包括酶。標(biāo)記 可以被簡單地檢測或它可以被量化。被簡單地檢測的應(yīng)答通常包括僅確認(rèn)其存在的應(yīng)答， 而被量化的應(yīng)答通常包括具有可量化的（例如，可數(shù)字上報(bào)告的）值強(qiáng)度、極化和/或其它 特性的應(yīng)答。在發(fā)光或熒光測定中，可檢測的應(yīng)答可使用與實(shí)際參與結(jié)合的測定組分締合 的發(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)直接產(chǎn)生，或使用與另一種（例如，報(bào)告基因或指示劑）組分締合的發(fā)光 團(tuán)或熒光團(tuán)間接產(chǎn)生。
[0097] 產(chǎn)生信號(hào)的發(fā)光標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光?？蓹z測的發(fā)光 應(yīng)答通常包含發(fā)光信號(hào)的變化或出現(xiàn)。用于熒光地標(biāo)記測定組分的合適的方法和熒光團(tuán) 是本領(lǐng)域已知的并且描述于例如 Haugland，Richard P. (1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第6版）中。發(fā)光探針的實(shí)例包括但不限于水母蛋白和 螢光素。
[0098] 合適的熒光標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、曙紅、藻紅、 香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀綠、芪、熒光黃、Cascade Blue?以及德克薩斯紅。其它合 適的光學(xué)染料描述于 Haugland，Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第 6版）中。
[0099] 另一方面，熒光標(biāo)記進(jìn)行功能化以便有助于共價(jià)附接至存在于細(xì)胞或組織的表面 中或上的細(xì)胞組分，如細(xì)胞表面標(biāo)志物。合適的官能團(tuán)包括但不限于異硫氰酸酯基團(tuán)、氨 基、鹵代乙?；?、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基酯以及磺?；u化物，其全部可用于將熒光標(biāo) 記附接至第二分子。熒光標(biāo)記的官能團(tuán)的選擇將取決于與接頭、藥劑、標(biāo)志物或第二標(biāo)記劑 附接的位點(diǎn)。
[0100] 雖然主要參照具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但還預(yù)想在閱讀本公開后其它實(shí)施方 案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是清楚的，并且意圖這類實(shí)施方案包含于本發(fā)明的方法內(nèi)。
[0101] I.發(fā)明綜沭
[0102] 本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)Toso蛋白（其在本文還可互換地被稱為"Toso"或"Toso受 體"或"Faim3"或"FCMR"）的活性的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和 組合物增加Toso蛋白的活性。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物抑制Toso蛋白 的活性。在一些實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)Toso蛋白的活性的組合物包括結(jié)合Toso蛋白或結(jié) 合Toso蛋白的配體的藥劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含可溶性Toso蛋白。如 將在本文進(jìn)一步詳細(xì)地討論，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括Toso受體的全部或部分胞外 結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的可溶性Toso蛋白可進(jìn)一步包括信號(hào)肽和/或Fc結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的可溶 性Toso蛋白可進(jìn)一步包括Toso蛋白的變體胞外結(jié)構(gòu)域，包括缺失變體（其中全胞外結(jié)構(gòu) 域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失的變體）和包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的變體。
[0103] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過向受試者施用可溶性Toso蛋白（或其變體）來治療病癥 和疾病的方法。如將在本文進(jìn)一步詳細(xì)地討論，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白可用于治療患有 但不限于以下各項(xiàng)的受試者：自身免疫性病癥（包括但不限于1型或2型糖尿病、多發(fā)性硬 化癥或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、哮喘、過敏癥、慢性阻塞性肺?。?C0PD"）、高-IgM綜合癥、CLL、狼 瘡或中性白細(xì)胞增多癥相關(guān)的病癥（包括但不限于中性粒細(xì)胞減少癥、重度先天性中性粒 細(xì)胞減少癥、環(huán)狀中性粒細(xì)胞減少癥、抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞減少癥、網(wǎng)狀發(fā)育不良、白細(xì) 胞粘附缺陷、常見骨髓增生性疾病、慢性髓細(xì)胞性白血病、常見感冒蕁麻疹和白細(xì)胞增多以 及慢性肉芽腫病）。
[0104] II.可溶件Toso蛋白
[0105] 本發(fā)明的組合物包括調(diào)節(jié)Toso活性的藥劑。如將在下文進(jìn)一步詳細(xì)地討論，這類 組合物包括但不限于可溶形式的Toso蛋白。
[0106] 本發(fā)明的可溶性Toso蛋白（在本文還可互換地被稱為"可溶性Toso受體"、 "Toso-Fc"和"可溶性Toso多肽"）包括Toso受體的全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施 方案中本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括信號(hào)結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域。如將在本文進(jìn)一步詳 細(xì)地討論，可溶性Toso蛋白的這些組分可以任何方式在有或沒有另外組分和/或修飾的情 況下組合以便提供本發(fā)明的可溶性Toso蛋白。
[0107] 一方面，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含Toso的胞外結(jié)構(gòu)域。在仍然另一實(shí)施方 案中，所述可溶性Toso蛋白包含人Toso同種型a的胞外結(jié)構(gòu)域。人Toso的胞外結(jié)構(gòu)域 預(yù)計(jì)跨越NP_005440. 1 (人Toso同種型a)的氨基酸P21至G251 (參見Shima等人，Int. Immunol.，2010,其特此出于所有目的并且特別是出于涉及Toso的胞外結(jié)構(gòu)域的所有教導(dǎo) 的目的而整體并入）。為清楚起見，本文的大多數(shù)討論涉及包含人Toso蛋白的全部或部分 胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性Toso蛋白。然而，應(yīng)理解來自任何物種的Toso蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可 用于產(chǎn)生根據(jù)本文描述的可溶性Toso蛋白，并且鑒別對應(yīng)于本文所討論的人Toso蛋白的 區(qū)的來自另一物種的Toso蛋白的區(qū)將是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :1的胞外結(jié)構(gòu)域序 列（其在圖10中示出）。在另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白與SEQ ID NO: 1具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性。在仍然另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有SEQ ID N0 :1中 的 1-75、2-70、3-65、4-60、5-55、6-50、7-45、8-40、9-35、10-30、11-25、12-20、13-15、5-20、 6-18、8-16、10-14個(gè)氨基酸取代的多肽。在又另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含 具有 SEQ ID N0 :1 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)氨基酸取代的多肽。
[0109] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :8的胞外結(jié)構(gòu)域序 列（其在圖27中示出）。在另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白與SEQ ID N0 :8具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性。在仍然另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含具有SEQ ID N0 :8中 的 1-75、2-70、3-65、4-60、5-55、6-50、7-45、8-40、9-35、10-30、11-25、12-20、13-15、5-20、 6-18、8-16、10-14個(gè)氨基酸取代的多肽。在又另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含 具有 SEQ ID N0 :8 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)氨基酸取代的多肽。
[0110] 在另一實(shí)施方案中并且根據(jù)上述任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO :7的氨基酸18至253。在仍然另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO :7的氨基酸21至253。在仍然另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括SEQ ID NO: 7的氨基酸21至251。在又另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括來自SEQ ID NO :7 的任何以下范圍的氨基酸：1-255、5-245、10-235、15-225、20-215、25-205、30-195、35-185、 40-175、45-165、50-155、45-145、40-135、35-125、30-115、35-105、40-95、45-85、50-75、 55-65。在仍然另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID N0 :7的氨基酸18至 253 或 21 至 253 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %和100 %的序列同一性的序列。
[0111] 在仍然另一實(shí)施方案中并且根據(jù)上述任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括圖 27中描繪的SEQ ID NO :8的全部或一部分。在仍然其它實(shí)施方案中，所述可溶性Toso 蛋白包括 SEQ ID NO :8 的氨基酸 1-231、6-221、11-211、16-201、21-191、26-181、31-171、 36-161、41-151、46-141、51-131、56-121、61-111、66-101、71-91、76-81。在仍然其它實(shí)施方 案中，所述可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID NO :8的氨基酸區(qū)1-231、6-221、11-211、16-201、 21-191、26-181、31-171、36-161、41-151、46-141、51-131、56-121、61-111、66-101、71-91、 76-81 具有至少 70 %、75 %、80%、85 %、90 %、91 %、92 %、93%、94%、95 %、96%、97 %、 98%、99%和100%序列同一性的多肽。
[0112] 在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0:8、9、ll、13、15、 17、19、21和23中的任一個(gè)。在仍然另一實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID NO :8、9、11、13、15、17、19、21 和 23 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。這些序列包括1'〇8〇受體 的胞外結(jié)構(gòu)域的缺失變體。
[0113] 在仍然其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包 含Toso蛋白的全胞外結(jié)構(gòu)域的缺失變體。在示例性實(shí)施方案中，為本發(fā)明的可溶性Toso 蛋白的組分的缺失變體包括以下氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)從SEQ ID NO :8缺失的多肽： 1-21、1-35、1-87、區(qū)1-21和區(qū)211-231兩者、211-231、154-231、105-231 以及 93-231。在 其它示例性實(shí)施方案中，為本發(fā)明的可溶性Toso蛋白的組分的缺失變體包括與以下氨基 酸區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)缺失的根據(jù)SEQ ID N0:8的多肽具有約70%、75%、80%、85%、90%、 91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一'注的多肽：1_21、1-35、 1-87、區(qū) 1-21 和區(qū) 211-231 兩者、211-231、154-231、105-231 以及 93-231。
[0114] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)以上中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括包 含與Toso受體的配體結(jié)合的區(qū)的胞外結(jié)構(gòu)域組分。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶 性Toso蛋白包括與IgM結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域組分。在仍然另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性 Toso蛋白包括SEQ ID N0 :8的氨基酸35至87。在其它示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶 性Toso 蛋白包括SEQ ID N0 :8 的氨基酸25-100、29-95、33-90、37-85、41-80、45-75、49-70、 53-65 或 57-60。
[0115] 在另一方面并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包括如以上所 討論的胞外結(jié)構(gòu)域組分并且進(jìn)一步包括信號(hào)序列。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所述信號(hào)序 列增強(qiáng)從宿主細(xì)胞的分泌。在又另一實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列包括但不限于選自以下各 項(xiàng)的成員：IL_2信號(hào)序列、來自釀酒酵母的a-交配因子前序列、來自黑曲霉的a-淀粉酶 信號(hào)序列、來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶信號(hào)序列、來自智人的血清白蛋白信號(hào)序列、來自馬 克思克魯維酵母的菊粉酶信號(hào)序列、來自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列、來自釀酒酵母的殺 傷蛋白信號(hào)序列、來自原雞的溶菌酶信號(hào)序列。在仍然另一實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列包含 根據(jù)SEQ ID N0 :2的序列（其在圖10中示出）。在仍然另一實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列包 含與 SEQ ID N0:2 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%和100%的序列同一性的序列。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso 蛋白包含3￡〇10勵(lì) ：1、8、9、11、13、15、17、21和23中的任一個(gè)或作為與5￡〇10勵(lì)：2或 與同 SEQ ID N0:2 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %和100 %的同一性的序列的融合蛋白的那些序列的變體。
[0116] 在另一方面并且根據(jù)以上中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含Toso受體 的胞外結(jié)構(gòu)域和Fc結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白是包含人Toso 蛋白的同種型A的胞外結(jié)構(gòu)域和Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu) 域包括如與無Fc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相比增強(qiáng)所述蛋白質(zhì)的半衰期的任何結(jié)構(gòu)域。在仍然另 一實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域包括如與無Fc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相比改善所述蛋白質(zhì)的藥物 代謝動(dòng)力學(xué)曲線的任何結(jié)構(gòu)域。在仍然另一實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域源自C末端處的人 IgGl，在又另一實(shí)施方案中所述Fc結(jié)構(gòu)域包括減弱或消除抗體依賴性和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞 毒性的突變。在仍然另一實(shí)施方案中，這類突變包括單獨(dú)地或以任何組合的以下突變中的 一個(gè)或多個(gè)：E233P ;L234V ;L235A ; AG236 ;A327G ;A330S ;P331S。在又另一實(shí)施方案中，所 述Fc結(jié)構(gòu)域包含根據(jù)SEQ ID NO :3的序列（其在圖10中示出）。在仍然另一實(shí)施方案中， 所述 Fc 結(jié)構(gòu)域包含與 SEQ ID N0:3 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的序列同一性的序列。
[0117] 在其它示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含含有胞外結(jié)構(gòu)域組分 和Fc結(jié)構(gòu)域組分兩者的融合蛋白。在仍然其它示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso 蛋白包含3￡〇10勵(lì) ：1、8、9、11、13、15、17、21和23或作為與5￡〇10勵(lì)：3或與同5￡〇10 N0 :3 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99 %和100 %的同一性的序列的融合蛋白的那些序列的變體。
[0118] 在一方面并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含細(xì)胞外Toso 結(jié)構(gòu)域、信號(hào)序列和Fc結(jié)構(gòu)域一那些組分各自可包含以任何組合的這些組分的任何上述 型式。在仍然另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :5的序列 (其在圖8中示出）。在仍然另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID N0: 5 具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和100 %的序列同一性的序列。
[0119] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含根 據(jù)SEQ ID N0. 10、12、14、16、18、20、22和24中的任一個(gè)的序列，其包含胞外結(jié)構(gòu)域組分、信 號(hào)序列和Fc結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO. 10、 12、14、16、18、20、22、和24具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列問一性的序列。
[0120] 在其它方面并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白可進(jìn)一步包括 在Toso胞外結(jié)構(gòu)域組分與Fc結(jié)構(gòu)域之間、在Toso胞外結(jié)構(gòu)域組分與信號(hào)序列之間或在 Toso胞外結(jié)構(gòu)域組分與Fc結(jié)構(gòu)域之間和Toso胞外結(jié)構(gòu)域組分與信號(hào)序列兩者之間的接 頭。在示例性實(shí)施方案中，這種接頭可以是可有效于將兩個(gè)氨基酸序列連接在一起的氨基 酸接頭、聚合物接頭或本領(lǐng)域已知任何其它接頭。在其它示例性實(shí)施方案中，所述接頭是氨 基酸接頭。在仍然其它實(shí)施方案中，所述接頭是氨基酸序列：ISAMVRS(SEQ ID N0:25)。在 又其它實(shí)施方案中，所述接頭是含有1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸取代的SEQ ID N0:25的變 體。
[0121] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白的變體 可通過本文所討論的任何可溶性Toso蛋白的氨基酸序列（包括SEQ ID N0. 5、6或8-24)的 修飾來制備?？墒褂帽绢I(lǐng)域中的任何已知技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變或基于PCR的誘變來實(shí)現(xiàn)這 類修飾。這類技術(shù)例如描述于 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. , 1989 和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York, N.Y.，1989 中，所述文獻(xiàn)各自出于所 有目的并且特別是出于涉及形成蛋白質(zhì)變體的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0122] 在仍然其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白可 以呈單體形式或多聚體形式，其中多聚體的每個(gè)單體包含單個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域序列。在其它實(shí) 施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白是呈2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)單體的多聚體形 式。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可溶性Toso蛋白是6個(gè)單體的多聚體。在另一實(shí)施方案中， 六聚Toso多聚體是由包含六聚化標(biāo)簽的單體形成。在另一實(shí)施方案中，六聚化標(biāo)簽包含來 自人IgAa重鏈恒定區(qū)的21氨基酸尾片段，如Hirano等人，Blood(2006)中所描述，所述 文獻(xiàn)特此出于所有目的并且特別是出于涉及六聚化標(biāo)簽或其它多聚化標(biāo)簽的所有教導(dǎo)的 目的而以引用的方式并入。在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的六聚化標(biāo)簽包括根據(jù)圖10中所 不的SEQ ID N0 :4的序列。
[0123] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白進(jìn)行修 飾以便改變所述蛋白的一種或多種功能特性。在示例性實(shí)施方案中，所述可溶性Toso進(jìn) 行化學(xué)修飾。例如，所述可溶性Toso蛋白可用一種或多種聚合物進(jìn)行修飾以便改進(jìn)其體 內(nèi)穩(wěn)定性和/或改變其藥物代謝動(dòng)力學(xué)曲線。這類聚合物包括但不限于以美國專利號(hào) 4,640,835 ;4, 496, 689 ;4, 301，144 ;4, 670, 417 ;4, 791，192 ;或 4, 179,337 中列出的方式的 多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種或多種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述專利全部 特此出于所有目的并且特別是出于涉及將蛋白質(zhì)連接至聚合物的所有教導(dǎo)的目的而以引 用的方式整體并入。
[0124] 本發(fā)明的范圍內(nèi)包括的Toso可溶性蛋白質(zhì)的修飾包括使根據(jù)以上所討論的任何 序列和可溶性Toso蛋白的Toso多肽的祀向氨基酸殘基與能夠與Toso多肽的選定側(cè)鏈或 N或C末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化試劑反應(yīng)。常用的交聯(lián)劑包括例如1，1_雙（重氮乙酰 基）-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸的酯；同質(zhì)雙官 能亞氨酸酯（homobifunctional imidoester)，包括二琥拍酰亞氨基酯，如3, 3'-二硫代 雙（琥珀酰亞氨基丙酸酯）；雙官能馬來酰亞胺，如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷；以及 劑如甲基 -3-[(p-疊氮基苯基）二硫代]丙亞氨酸酯。
[0125] 其它修飾包括谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢謩e脫酰胺成相應(yīng)谷氨?；?天冬氨?；鶜埢彼岷唾嚢彼岬牧u基化、絲氨酰基或蘇氨?；鶜埢牧u基的磷酸化， 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的氨基的甲基化[T.E. Creighton, Proteins :Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco,第 79-86 頁（1983)]，N-末 端胺的乙?；腿魏蜟-末端羧基的酰胺化。
[0126] 本發(fā)明的范圍內(nèi)包括的可溶性Toso蛋白的另一種類型的修飾包括改變多肽的天 然糖基化模式。"改變天然糖基化模式"在本文為此意圖意指缺失在天然序列Toso多肽中 發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分和/或添加未存在于所述天然序列Toso多肽中的一個(gè) 或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
[0127] 添加糖基化位點(diǎn)至Toso可溶性蛋白質(zhì)可通過改變其氨基酸序列來完成。改變可 例如通過向所述可溶性Toso蛋白的天然序列中添加一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基或取 代所述可溶性Toso蛋白的天然序列的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行（針對0-連 接糖基化位點(diǎn)）。可溶性Toso蛋白氨基酸序列可任選地通過DNA層次上的變化來改變，尤 其通過使編碼所述Toso可溶性蛋白質(zhì)的DNA在預(yù)選的堿基處突變以使得產(chǎn)生將翻譯成所 需氨基酸的密碼子。
[0128] 增加Toso可溶性蛋白質(zhì)上的碳水化合物部分的數(shù)目的另一手段是通過使糖苷化 學(xué)或酶偶聯(lián)于多肽。這類方法在本領(lǐng)域中進(jìn)行描述，例如描述于1987年9月11日公布的 W0 87/05330 中以及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem?，第 259-306 頁（1981)中， 所述文獻(xiàn)特此出于所有目的并且特別是出于涉及改變蛋白質(zhì)上的碳水化合物部分的所有 教示的目的而以引用的方式整體并入。
[0129] 去除存在于可溶性Toso蛋白上的碳水化合物部分可化學(xué)地或酶促地完成或通過 編碼充當(dāng)糖基化靶標(biāo)的氨基酸殘基的密碼子的突變?nèi)〈鷣硗瓿??；瘜W(xué)去糖基化技術(shù)是本領(lǐng) 域已知的并且例如由 Hakimuddin 等人，Arch. Biochem. Biophys.，259 :52 (1987)和由 Edge 等人，Anal. Biochem.，118 :131 (1981)描述。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通過 使用如由Thotakura等人，Meth. Enzymol.，138 :350(1987)所描述的多種內(nèi)糖苷酶和外糖 苷酶來實(shí)現(xiàn)，所述文獻(xiàn)特此出于所有目的并且特別是出于涉及改變蛋白質(zhì)上的碳水化合物 部分的所有教示的目的而以引用的方式整體并入。
[0130] 本發(fā)明的可溶性Toso蛋白還可以形成包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合 的蛋白質(zhì)的嵌合分子的方式進(jìn)行修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種嵌合分子包含可溶性Toso 多肽與提供抗標(biāo)簽抗體可選擇性地結(jié)合的表位的標(biāo)簽多肽的融合。表位標(biāo)簽通常位于Toso 多肽的氨基或羧基末端處?？墒褂冕槍?biāo)簽多肽的抗體來檢測Toso多肽的這類表位標(biāo)記 形式的存在。此外，提供表位標(biāo)簽使能夠使用抗標(biāo)簽抗體或與所述表位標(biāo)簽結(jié)合的另一種 類型的親和力基質(zhì)通過親和純化來容易地純化所述Toso多肽。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，嵌 合分子可包含Toso多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區(qū)的融合。對于所述嵌合分子 的二價(jià)形式來說，這種融合可以是與IgG分子的Fc區(qū)的融合或GST融合。
[0131] 各種標(biāo)簽多肽及其對應(yīng)抗體是本領(lǐng)域中熟知的。實(shí)例包括聚_組氨酸（聚-his) 或聚-組氨酸-甘氨酸（聚-his-gly)標(biāo)簽；流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5[Field 等人，Mol. Cell Biol.，8 :2159-2165(1988)] ;c-myc 標(biāo)簽及其上的 8F9、3C7、6E10、G4、 B7 和 9E10 抗體[Evan 等人，Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985)]; 以及單純皰疫病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體[Paborsky等人，Protein Engineering, 3 (6) :547-553 (1990)]。其它標(biāo)簽多肽包括 Flag-肽[Hopp 等人，BioTechnology，6 : 1204-1210(1988)] ;KT3 表位肽[Martin 等人，Science，255:192-194 (1992)];微管蛋白表 位肽[Skinner 等人，J. Biol. Chem.，266 :15163-15166(1991)];以及 17 基因 10 蛋白質(zhì)肽 標(biāo)簽[Lutz-Freyermuth 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87 ;6393_6397 (1990)]。
[0132] 在其它實(shí)施方案中并且根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白是與細(xì) 胞穿透肽融合。
[0133] 在其它方面，本發(fā)明涵蓋編碼一種或多種可溶性Toso蛋白的核酸以及包含這類 核酸的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的宿主細(xì)胞包括但不限于J1EK293F、 HEK298T、Cos7、HeLa和CH0-DHFR缺陷的細(xì)胞。在仍然其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性 Toso蛋白在已進(jìn)行修飾以便在不含血清的懸浮液中生長的細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。
[0134] 在其它方面，本發(fā)明的組合物可包含本文所討論的任何可溶性Toso蛋白連同添 加劑和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，"藥學(xué)上可接受的載體"包括當(dāng)與綴合物組合時(shí) 保留所述綴合物的活性并且不與受試者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任何材料。實(shí)例包括但不限于任 何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳劑（如油/水乳劑），以及各種類型的潤 濕劑。其它載體還可包括無菌溶液，片劑（包括糖衣片劑）和膠囊。通常這類載體包含賦 形劑，如淀粉、奶、某些類型的白土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物 油脂或油、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。這類載體還可包括調(diào)味劑和顏色添加劑或其 它成分。包含所述載體的組合物是通過熟知的常規(guī)方法進(jìn)行配制。
[0135] III. Toso 的抗體
[0136] 一方面，本發(fā)明提供結(jié)合Toso蛋白的抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體增 加Toso活性。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體減少Toso活性。
[0137] 制備抗體的方法通常是本領(lǐng)域中已知的。例如，美國專利號(hào)6, 727, 350公開了針 對Toso的抗體，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及針對Toso蛋白的抗體的 所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0138] 本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或其衍生物 或片段，如以下所定義。一方面，片段包含抗體的CDR或可替代地基本上由抗體的CDR的組 成或更進(jìn)一步由抗體的CDR組成。一方面，本發(fā)明的抗體是可檢測地標(biāo)記的或進(jìn)一步包含 與它綴合的可檢測標(biāo)記。還提供一種產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本文進(jìn)一 步提供包含上述實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)的組合物。
[0139] 還提供包含一種包含所述抗體和載體的組合物。進(jìn)一步提供所述抗體的一種生物 活性片段或一種包含所述抗體片段的組合物。合適的載體在上文中定義。
[0140] 進(jìn)一步提供一種包含所述抗體和與所述抗體特異性地結(jié)合的多肽、或可替代地基 本上由所述抗體和與所述抗體特異性地結(jié)合的多肽組成或還可替代地由所述抗體和與所 述抗體特異性地結(jié)合的多肽組成的抗體-肽復(fù)合物。一方面，所述多肽是針對其產(chǎn)生所述 抗體的嵌合多肽。
[0141] 本發(fā)明還提供一種能夠與Toso特異性地形成復(fù)合物的抗體，所述抗體適用于本 發(fā)明的治療性方法中。本發(fā)明的抗體包括但不限于小鼠、大鼠和兔或人抗體。抗體可在細(xì)胞 培養(yǎng)物中、在噬菌體中或在各種動(dòng)物中產(chǎn)生，所述動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大 鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩、猿等。所述抗體還適用于鑒別和純化治療性多肽。
[0142] 本發(fā)明還提供一種包含上述抗體和與所述抗體特異性地結(jié)合的多肽、或可替代地 基本上由上述抗體和與所述抗體特異性地結(jié)合的多肽組成或還可替代地由上述抗體和與 所述抗體特異性地結(jié)合的多肽組成的抗體-肽復(fù)合物。一方面，所述多肽是針對其產(chǎn)生所 述抗體的多肽。一方面，所述抗體-肽復(fù)合物是分離的復(fù)合物。另一方面，所述復(fù)合物的抗 體是但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體或本文所描述的抗體衍生物。所述抗 體-肽復(fù)合物的抗體或肽中的任一者或兩者可被可檢測地標(biāo)記或進(jìn)一步包含與它綴合的 可檢測標(biāo)記。一方面，本發(fā)明的抗體-肽復(fù)合物可用作診斷測定或篩選測定中的對照或參 比樣本。
[0143] 本發(fā)明的多克隆抗體可使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)來產(chǎn)生并且在文獻(xiàn)中進(jìn)行 了充分描述。存在一些方法學(xué)用于產(chǎn)生多克隆抗體。例如，多克隆抗體通常通過適合哺乳 動(dòng)物的免疫來產(chǎn)生，所述哺乳動(dòng)物如不限于雞、山羊、豚鼠、倉鼠、馬、美洲駝、小鼠、大鼠和 兔?？乖蛔⑸渲了霾溉閯?dòng)物中，所述抗原誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對所述抗原具有特異性 的IgG免疫球蛋白。這種IgG是從哺乳動(dòng)物的血清純化的。這種方法學(xué)的變化形式包括佐 齊U、施用途徑和部位、每部位注射體積和每動(dòng)物部位的數(shù)目的修改以獲得動(dòng)物的最佳產(chǎn)生 和人性化治療。例如，佐劑通常用于改進(jìn)或增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答。大多數(shù)佐劑提供注射 部位抗原儲(chǔ)庫，其允許抗原緩慢釋放至引流淋巴結(jié)中。其它佐劑包括促進(jìn)蛋白質(zhì)抗原分子 在較大表面面積上的和免疫刺激分子的濃縮的表面活性劑。用于多克隆抗體產(chǎn)生的佐劑 的非限制性實(shí)例包括弗氏佐劑、Ribi佐劑系統(tǒng)和Titermax。多克隆抗體可使用美國專利 號(hào) 7, 279, 559 ;7, 119, 179 ;7, 060, 800 ;6, 709, 659 ;6, 656, 746 ;6, 322, 788 ;5, 686, 073 ;和 5, 670, 153中描述的方法來產(chǎn)生，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體的 所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0144] 本發(fā)明的單克隆抗體可使用本領(lǐng)域中已知的和文獻(xiàn)中充分描述的常規(guī)雜交瘤技 術(shù)來產(chǎn)生。例如，雜交瘤是通過使合適的無限增殖細(xì)胞系（例如，骨髓瘤細(xì)胞系如但不限 于5?2/0、5?2/0-六614、呢0、呢1、呢2、六￡-1、1.5、> 243、？3父63六§8.653、5?2 5六3、5?2嫩1、Sp2 SSl、Sp2 SA5、U397、MLA 144、ACT IV、M0LT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、C0S、RAJI、 NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEUR0 2A、CH0、PerC.6、YB2/0)或類似物、或雜合骨髓 瘤、其融合產(chǎn)物、或源自其的任何細(xì)胞或融合細(xì)胞、或如本領(lǐng)域中已知的任何其它適合的細(xì) 胞系（參見，例如在2007年11月26日最后一次訪問的www. atcc. org，www. lifetech. com. 等）與以下各項(xiàng)融合來產(chǎn)生：產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，如但不限于分離的或克隆的脾細(xì)胞、外周血 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、扁桃體細(xì)胞、或其它免疫細(xì)胞或含有B細(xì)胞的細(xì)胞；或表達(dá)重鏈或輕鏈恒 定區(qū)或可變序列或框架序列或CDR序列的任何其它細(xì)胞來產(chǎn)生，作為內(nèi)源或異源核酸、作 為重組或內(nèi)源病毒、細(xì)菌、藻類、原核生物、兩棲動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、魚、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng) 物、馬、綿羊、山羊、綿羊、靈長類動(dòng)物、真核生物、基因組DNA、cDNA、rDNA、線粒體DNA或RNA、 葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、單鏈、雙鏈或三鏈、雜合的等或其任何組合。產(chǎn)生抗 體的細(xì)胞還可從已用目標(biāo)抗原進(jìn)行免疫的人或其它合適的動(dòng)物的外周血或優(yōu)選地脾或淋 巴結(jié)獲得。任何其它合適的宿主細(xì)胞還可用于表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體、其特定片段或變體 的異源或內(nèi)源核酸。融合的細(xì)胞（雜交瘤）或重組細(xì)胞可使用選擇性培養(yǎng)條件或其它合適 的已知方法進(jìn)行分離，并且通過有限稀釋或細(xì)胞分選或其它已知方法進(jìn)行克隆。
[0145] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的抗體可使用多抗原肽（MAP)系統(tǒng)來產(chǎn)生。MAP系統(tǒng) 使用三個(gè)或七個(gè)徑向分支的賴氨酸殘基的肽基核心，可使用標(biāo)準(zhǔn)固相化學(xué)在所述肽基核心 上構(gòu)建目標(biāo)抗原肽。取決于通常占總分子量的小于10%的內(nèi)核，賴氨酸核心產(chǎn)生攜帶肽表 位的約4至8個(gè)拷貝的MAP。所述MAP系統(tǒng)不需要用于綴合的載體蛋白。MAP中的抗原表 位的多個(gè)拷貝的高摩爾比和致密填充已經(jīng)顯示產(chǎn)生強(qiáng)免疫原性應(yīng)答。這一方法描述于美國 專利號(hào)5, 229, 490中并且出于所有目的且特別是出于涉及MAP系統(tǒng)的所有教導(dǎo)的目的而以 引用的方式整體并入本文。
[0146] 可以使用產(chǎn)生或分離具有所需特異性的抗體的其它合適的方法，包括但不 限于使用本領(lǐng)域已知的方法從肽或蛋白質(zhì)文庫（例如但不限于，噬菌體、核糖體、寡 核苷酸、RNA、cDNA等展示文庫；例如，如從各種商業(yè)銷售商如Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg, Del.)、 Biovation (Aberdeen，Scotland，UK)、Bioinvent (Lund，Sweden)可獲得）選擇重組抗體 的方法。參見美國專利號(hào) 4, 704, 692 ;5, 723, 323 ;5, 763, 192 ;5, 814, 476 ;5, 817, 483 ; 5, 824, 514 ;5, 976, 862,所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉及與抗體有關(guān)的方 法的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。替代方法依賴于如本領(lǐng)域中已知和/或 如本文所描述的能夠產(chǎn)生人抗體的譜系的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的免疫（例如SCID小鼠，Nguyen等 人（1997)Microbiol. Immunol. 41 :901_907 ;Sandhu等人（1996)Crit. Rev. Biotechnol. 16 : 95-118 ;Eren等人（1998) Immunol. 93 :154-161)。這類技術(shù)包括但不限于核糖體展示 (Hanes 等人（1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 ;Hanes 等人（1998)?1~〇。. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135);產(chǎn)生單細(xì)胞抗體的技術(shù)（例如，選擇的淋巴細(xì)胞 抗體方法（"SLAM"）（美國專利號(hào) 5, 627, 〇52, Wen 等人（I987) J. Immunol. I7 :887-892 ; Babcook 等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848);凝膠微滴和流式細(xì)胞術(shù) (Powell 等人（1990)Biotechnol.8 :333_337 ;單個(gè)細(xì)胞系統(tǒng)（Cambridge，Mass) ;Gray 等人 (1995) J. Imm.Meth. 182 :155-163 ;和 Kenny 等人（1995) Bio. Technol. 13 :787-790) ;B 細(xì)胞 選擇（Steenbakkers 等人（1994)Molec.Biol. Reports 19:125-134,其特此出于所有目的 并且特別是出于涉及用于產(chǎn)生抗體的方法的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0147] 本發(fā)明的抗體衍生物還可通過將編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸遞送至適合的宿 主以便提供在其奶中產(chǎn)生這類抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或哺乳動(dòng)物（如山羊、牛、馬、綿羊等）來 制備。這些方法是本領(lǐng)域中已知的并且描述于例如美國專利號(hào)5, 827, 690 ;5, 849, 992 ; 4,873,316 ;5, 849, 992 ;5, 994, 616 ;5, 565, 362 ;和 5,304,489 中，所述專利特此出于所有 目的并且特別是出于涉及產(chǎn)生抗體的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0148] 術(shù)語"抗體衍生物"包括對抗體或片段的線性多肽序列的翻譯后修飾。例如，美國 專利號(hào)6, 602, 684 B1 (其特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體的修飾的所有教導(dǎo)的 目的而以引用的方式整體并入）描述了一種用于產(chǎn)生修飾的二醇形式的抗體的方法和如 此產(chǎn)生的糖蛋白，所述抗體包括完整抗體分子、抗體片段或融合蛋白（其包括等效于免疫 球蛋白的Fc區(qū)的區(qū)）、具有增強(qiáng)的Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
[0149] 抗體衍生物還可通過遞送本發(fā)明的多核苷酸以便提供在植物部分中或在自其 培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生這類抗體、指定部分或變體的轉(zhuǎn)基因植物和培養(yǎng)的植物細(xì)胞（例如但 不限于煙草、玉蜀黍和浮萍）來制備。例如，Cramer等人（1999)Curr.Top.Microbol. Immunol. 240 :95-118和在其中引用的參考描述了例如使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子產(chǎn)生表達(dá)大量 重組蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草葉。轉(zhuǎn)基因玉蜀黍已經(jīng)用于以商業(yè)生產(chǎn)水平表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)， 所述蛋白質(zhì)具有等效于在其它重組系統(tǒng)中產(chǎn)生或從天然來源純化的那些的生物活性。參 見，例如Hood等人（1999)Adv. Exp. Med. Biol. 464 :127-147和在其中引用的參考文獻(xiàn)?？?體衍生物還已經(jīng)自包括抗體片段如單鏈抗體（scFv' s)的轉(zhuǎn)基因植物種子，包括煙草種子 和馬鈴薯塊莖大量產(chǎn)生。參見，例如Conrad等人（1998) Plant Mol. Biol. 38 :101-109和在 其中引用的參考文獻(xiàn)。因此，本發(fā)明的抗體還可根據(jù)已知方法使用轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生。
[0150] 抗體衍生物還可例如通過添加外源序列以便修飾免疫原性或減少、增強(qiáng)或修飾結(jié) 合、親和力、結(jié)合速率（〇n-rate)、解離速率（off-rate)、親合力、特異性、半衰期或任何其 它合適的特征來產(chǎn)生。通常部分或全部非人或人CDR序列被維持，而可變區(qū)和恒定區(qū)的非 人序列被人或其它氨基酸置換。
[0151] 一般來說，CDR殘基（抗體片段的實(shí)例）直接并且最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。 本發(fā)明的抗體的人源化或工程化可使用任何已知方法來進(jìn)行，所述方法如但不限于美國專 利號(hào) 5, 723, 323 ;5, 976, 862 ;5, 824, 514 ;5, 817, 483 ;5, 814, 476 ;5, 763, 192 ;5, 723, 323 ; 5, 766, 886 ；5, 714, 352 ；6, 204, 023 ；6, 180, 370 ；5, 693, 762 ；5, 530, 101 ；5, 585, 089 ； 5, 225, 539 ;和4, 816, 567中所描述的那些，所述專利特此出于所有目的并且特別是出于涉 及抗體的人源化或工程化的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0152] 用于制備部分至完全人抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且可使用任何這類技 術(shù)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在已經(jīng)工程化以便表達(dá)人重鏈和輕鏈抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中 制備完全人抗體序列。已經(jīng)制備了可產(chǎn)生不同類別的抗體的這類轉(zhuǎn)基因小鼠的多種品 系?？扇诤蟻碜哉诋a(chǎn)生所希望的抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞以便制備用于持續(xù)產(chǎn)生 所需抗體的雜交瘤細(xì)胞系。（參見例如，Russel等人（2000)Infection and Immunity 68(4) :1820-1826;Gallo 等人（2000)European J. of Immun. 30:534-540 ;Green(1999) J. of Immun.Methods 231:11-23 ;Yang 等人（1999A)J. of Leukocyte Biology 66: 401-410 ；Yang (1999B)Cancer Research 59(6) ：1236-1243 ；Jakobovits (1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31 ：33-42 ；Green&Jakobovits(1998)J. Exp.Med. 188 (3)： 483-495 ;Jakobovits(1998)Exp. Opin. Invest. Drugs7(4) :607_614;Tsuda 等人（1997) Genomics 42 :413_421 ;Sherman_Gold(1997)Genetic Engineering News 17(14) ；Mendez 等人（1997)Nature Genetics 15:146-156 ;Jakobovits(1996)Weir，s Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System 第 IV 卷，194.1-194. 7 ; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology6:561_566;Mendez 等人（1995) Genomics 26:294-307 ;Jakobovits(1994)Current Biology 4(8) :761_763;Arbones 等人（1994) Immunityl (4) :247-260; Jakobovits (1993) Nature 362 (6417) :255-258; Jakobovits 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6) :2551-2555;以及美國專利號(hào) 6, 075, 181。）
[0153] 本發(fā)明的抗體還可以進(jìn)行修飾以便產(chǎn)生嵌合抗體。嵌合抗體是其中抗體的重鏈 和輕鏈的不同結(jié)構(gòu)域由來自多于一種物種的DNA編碼的那些抗體。參見，例如美國專利號(hào) 4, 816, 567。
[0154] 或者，本發(fā)明的抗體還可以進(jìn)行修飾以便產(chǎn)生貼面化（veneered)抗體。貼面化抗 體是其中一種物種的抗體的外部氨基酸殘基被審慎地置換或被第二物種的氨基酸殘基"貼 面化"以使得所述第一物種的抗體在所述第二物種中將不是免疫原性的，從而減少所述抗 體的免疫原性的那些抗體。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的抗原性主要依賴于其表面的性質(zhì)，所以抗體的免 疫原性可通過置換與通常在另一哺乳動(dòng)物物種抗體中發(fā)現(xiàn)的那些殘基不同的所暴露的殘 基來減少。外部殘基的這種審慎置換應(yīng)對內(nèi)部結(jié)構(gòu)域或?qū)Y(jié)構(gòu)域間接觸具有很少作用或不 具有作用。因此，配體結(jié)合特性應(yīng)不受局限于可變區(qū)框架殘基的改變的結(jié)果影響。所述過 程被稱為"貼面化"，因?yàn)閮H抗體的外表面或外皮被改變，支持殘基保持未受干擾。
[0155] 用于"貼面化"的程序利用由 Kabat 等人（1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版，Bethesda，Md.，國立衛(wèi)生研究院匯編的人抗體可變結(jié)構(gòu) 域的可供使用的序列數(shù)據(jù)、對這一數(shù)據(jù)庫的更新以及其它可訪問的美國和外國數(shù)據(jù)庫（核 酸和蛋白質(zhì)兩者）。用于產(chǎn)生貼面化抗體的方法的非限制性實(shí)例包括EP 519596 ;美國專利 號(hào) 6,797,492;并且描述于？3(11311等人（1991)]\1〇1.1臟1111〇1.28(4-5):489-498 中。
[0156] 術(shù)語"抗體衍生物"還包括為具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段的"雙鏈抗體"， 其中片段包含在同一多肽鏈中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)。（參 見，例如 EP 404,097 ;W093/11161 ;和 Hollinger 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci.USA90 : 6444-6448。）通過使用太短而不允許在同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，迫使所述 結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并建立兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。（還參見，Chen等人的美國 專利號(hào)6, 632, 926,所述專利公開了具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入親本抗體的高變區(qū)中并且 對靶抗原具有的結(jié)合親和力比所述親本抗體對所述抗原的結(jié)合親和力強(qiáng)至少約兩倍的抗 體變體。）
[0157] 術(shù)語"抗體衍生物"進(jìn)一步包括"線性抗體"。用于制備線性抗體的程序是本領(lǐng)域 中已知的并且描述于Zapata等人（1995) Protein Eng. 8(10) : 1057-1062中。簡言之，這些 抗體包含一對串聯(lián)Fd區(qū)段（Vh-Ch1-VH-Ch1)，所述區(qū)段形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以 是雙特異性的或單特異性的。
[0158] 本發(fā)明的抗體可通過已知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收并且純化，所述方法包括但 不限于蛋白質(zhì)A純化、硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸 纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石色譜法和凝集素色譜法。高 效液相色譜法（"HPLC"）也可以用于純化。
[0159] 本發(fā)明的抗體包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成程序的產(chǎn)物以及通過重組技術(shù)從真 核宿主（包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）或可替代地從如上描述的原核細(xì) 胞產(chǎn)生的產(chǎn)物。
[0160] 如果所測試的單克隆抗體與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合，那么所測試的抗體和由本發(fā)明的 雜交瘤提供的抗體是等效的。還有可能在無過度實(shí)驗(yàn)的情況下確定抗體是否具有與本發(fā)明 的單克隆抗體相同的特異性，方法是通過確定所測試的抗體是否防止本發(fā)明的單克隆抗體 結(jié)合所述單克隆抗體通常與其反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。如果所測試的抗體與本發(fā)明的單克隆 抗體競爭，如通過由本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的減少所示，那么很可能兩種抗體結(jié)合相同 或密切相關(guān)的表位?；蛘撸蓪⒈景l(fā)明的單克隆抗體與它通常與其反應(yīng)的蛋白質(zhì)一起預(yù)孵 育，并且確定所測試的單克隆抗體是否在其結(jié)合抗原的能力方面受到抑制。如果所測試的 單克隆抗體受到抑制，那么很可能它與本發(fā)明的單克隆抗體具有相同或密切相關(guān)的表位特 異性。
[0161] 術(shù)語"抗體"還意圖包括所有同種型的抗體。單克隆抗體的具體同種型可直接通過 從初次融合選擇來制備，或使用描述于Steplewski等人（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8653 或 Spira 等人（1984) J. Immunol. Methods 74 :307 中的程序通過使用同胞（sib) 選擇技術(shù)以便分離類別轉(zhuǎn)換變體來從分泌不同同種型的單克隆抗體的親本雜交瘤繼發(fā)地 制備。
[0162] 分泌具有本發(fā)明的單克隆抗體的特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤的分離還可 通過產(chǎn)生抗個(gè)體基因型抗體由本領(lǐng)域技術(shù)普通技術(shù)人員完成。Herlyn等人（1986) Science 232 :100?？箓€(gè)體基因型抗體是識(shí)別存在于由目標(biāo)雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體上的獨(dú)特決定 簇的抗體。
[0163] 兩個(gè)雜交瘤的單克隆抗體之間的個(gè)體基因型同一性證明所述兩種單克隆抗體是 相對于其識(shí)別相同表位決定簇來說相同的。因此，通過使用單克隆抗體上的表位決定簇的 抗體，有可能鑒別表達(dá)相同表位特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤。
[0164] 還有可能使用抗個(gè)體基因型技術(shù)來產(chǎn)生模擬表位的單克隆抗體。例如，針對第一 單克隆抗體制備的抗個(gè)體基因型單克隆抗體將在高變區(qū)中具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其是由所述第 一單克隆抗體結(jié)合的表位的鏡像。因此，在這種情況下，抗個(gè)體基因型單克隆抗體可用于免 疫以產(chǎn)生這些抗體。
[0165] 在本發(fā)明的一些方面，可檢測地或治療性地標(biāo)記所述抗體將是有用的。用于使抗 體綴合至這些藥劑的方法是本領(lǐng)域中已知的。僅出于說明的目的，可使用可檢測部分如放 射性原子、生色團(tuán)、熒光團(tuán)等標(biāo)記抗體。這類標(biāo)記的抗體可用于診斷技術(shù)，體內(nèi)抑或在分離 的測試樣本中。
[0166] 抗體與低分子量半抗原的偶聯(lián)可增加抗體在測定中的靈敏度。半抗原然后可通 過二次反應(yīng)特異性地檢測。例如，通常使用半抗原如與抗生物素蛋白反應(yīng)的生物素或二 硝基酚、吡哆醛和熒光素，所述半抗原能夠與特異性抗半抗原抗體反應(yīng)。參見，Harlow和 Lane (1988)同上。
[0167] 本發(fā)明的抗體還可與許多不同的載體結(jié)合。因此，本發(fā)明還提供含有所述抗體和 另一種物質(zhì)（活性或惰性）的組合物。熟知載體的實(shí)例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙 烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。出于本發(fā)明的 目的，載體的性質(zhì)可以是可溶性的或不溶性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解用于結(jié)合單克隆抗 體的其它合適的載體，并且將能夠使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定所述載體。
[0168] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括在恒定區(qū)中的突變，如與無這類突變的抗 體相比，所述突變改進(jìn)所述抗體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。這類抗體將在某些實(shí)施方案中包 括源自C末端處的人IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域，所述抗體在又其它實(shí)施方案中包括減弱或消除抗 體依賴性和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的突變。在仍然另一實(shí)施方案中，這類突變包括單獨(dú)地 或以任何組合的以下突變中的一個(gè)或多個(gè)：E233P ;L234V ;L235A ; AG236 ;A327G ;A330S ; P331S。在又另一實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域包含根據(jù)SEQ ID NO :3的序列（其在圖10中 示出）。在仍然另一實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID N0:3具有約70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一 性的序列。
[0169] 在其它實(shí)施方案中，在抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中進(jìn)行一種或多種氨基酸修飾。一般來說，任何單個(gè)⑶R中僅取代1或2或3個(gè)氨基酸，并且通常一組⑶R內(nèi)進(jìn)行不超過4、5、 6、7、8、9或10個(gè)改變。然而應(yīng)理解，任何⑶R中沒有取代、有1、2或3個(gè)取代的任何組合可 獨(dú)立地且任選地地與任何其它取代相組合。
[0170] 在一些情況下，⑶R中的氨基酸修飾被稱為"親和力成熟"。"親和力成熟的"抗體 是一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一個(gè)或多個(gè)改變從而導(dǎo)致抗體對抗原的親和力相較于不具有那 些一個(gè)或多個(gè)改變的親本抗體得到改進(jìn)的抗體。在一些情況下，盡管很少見，可能需要減小 抗體對其抗原的親和力，但這通常并不是優(yōu)選的。
[0171] 可進(jìn)行親和力成熟以使抗體對抗原的結(jié)合親和力相較于"親本"抗體增加至少約 10%至50-100-150%或更多，或1至5倍。優(yōu)選的親和力成熟抗體將對靶抗原具有納摩爾 級(jí)或甚至皮摩爾級(jí)親和力。親和力成熟抗體通過已知的程序產(chǎn)生。參見，例如Marks等人， 1992, Biotechnology 10 :779-783,其描述通過可變重鏈（VH)和可變輕鏈（VL)結(jié)構(gòu)域改 組的親和力成熟。⑶R和/或框架殘基的隨機(jī)誘變描述于：例如Barbas等人1994, Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91 :3809-3813 ;Shier 等人，1995, Gene 169 :147-155 ;Yelton 等人， 1995, J. Immunol. 155 :1994-2004 Jackson 等人，1995, J. Immunol. 154(7) :3310-9 ;以及 Hawkins 等人，1992, J. Mol. Biol. 226 :889-896 中。
[0172] 或者，可在本發(fā)明的抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中進(jìn)行"沉默的"氨基酸修飾，例如不 顯著改變抗體對抗原的親和力的修飾。這些修飾可出于許多原因進(jìn)行，包括使表達(dá)最佳化 (如可對編碼本發(fā)明的抗體的核酸所做的修飾）。
[0173] 因此，本發(fā)明的⑶R和抗體的定義內(nèi)包括變異⑶R和抗體；也就是說，本發(fā)明的抗 體可包括Ab79和Abl9的一個(gè)或多個(gè)⑶R中的氨基酸修飾。此外，如以下概述，氨基酸修飾 也可獨(dú)立地并且任選地地在⑶R以外的任何區(qū)，包括框架區(qū)和恒定區(qū)中進(jìn)行。
[0174] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與藥物綴合以形成抗體-藥物綴合物（ADC)。一 般來說，ADC用于腫瘤學(xué)應(yīng)用中，在所述應(yīng)用中使用抗體-藥物綴合物用于局部遞送細(xì)胞毒 性或細(xì)胞生長抑制劑允許靶向遞送藥物部分至腫瘤，這可以允許更高的功效、更低的毒性 等等。這種技術(shù)的綜述提供于Ducry等人，Bioconjugate Chem.，21 :5_13 (2010)、Carter等 人，Cancer J. 14(3) : 154 (2008)和 Senter，Current Opin.Chem. Biol. 13 :235-244 (2009) 中，所述文獻(xiàn)特此出于所有目的并且特別是出于涉及抗體藥物綴合物的所有教導(dǎo)的目的而 以引用的方式整體并入。
[0175] 因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與藥物綴合的Toso抗體。通常，綴合是通過 共價(jià)附接至抗體來進(jìn)行，并且通常依賴于接頭，經(jīng)常是肽鍵聯(lián)（如本領(lǐng)域中所已知，肽鍵聯(lián) 可被設(shè)計(jì)成對靶位點(diǎn)處的蛋白酶裂解敏感或不敏感）。另外，如上所述，可通過附接至抗體 內(nèi)的半胱氨酸來進(jìn)行接頭-藥物單元（LU-D)的鍵聯(lián)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，每個(gè)抗體 的藥物部分的數(shù)量可取決于反應(yīng)的條件而變化，并且可在1 : 1至10 : 1藥物：抗體之間 變化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，實(shí)際數(shù)量是平均值。
[0176] 提供了可以是任何數(shù)量的藥劑的ADC的藥物，所述藥劑包括但不限于細(xì)胞毒性 齊U，如化學(xué)治療劑、生長抑制劑、毒素（例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或 其片段），或放射性同位素（即，放射性綴合物）。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了 使用所述ADC的方法。
[0177] 用于在本發(fā)明的抗體-藥物綴合物中使用的藥物包括細(xì)胞毒性藥物，特別是用于 癌癥治療的那些。所述藥物通常包括：DNA損傷劑、抗代謝物、天然產(chǎn)物以及它們的類似物。 細(xì)胞毒性劑的示例性類別包括：酶抑制劑，如二氫葉酸還原酶抑制劑和胸苷酸合酶抑制劑； DNA嵌入劑、DNA裂解劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蒽環(huán)霉素（anthracycline)家族的藥物、長春 藥物、絲裂霉素（mitomycin)、博來霉素（bleomycin)、細(xì)胞毒性核苷、蝶陡（pteridine)家 族的藥物、烯二炔、鬼臼毒素、多拉司他?。╠olastatin)、類美登醇（maytansinoid)、分化 誘導(dǎo)劑、以及紫杉醇（taxol)。
[0178] 這些類別的成員包括，例如：甲氨蝶呤（methotrexate)、甲蝶呤 (methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿啼陡（5-fluorouracil)、6_巰基噪呤、阿糖胞 苷（cytosine arabinoside)、美法侖（melphalan)、長春羅新（leurosine)、長春羅新 地新（leurosideine)、放線菌素（actinomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)、阿霉素 (doxorubicin)、絲裂霉素 C、絲裂霉素 A、卡柔比星（caminomycin)、氨蝶呤（aminopterin)、 他利霉素（tallysomycin)、鬼臼毒素以及鬼臼毒素衍生物（如依托泊苷（etoposide)或磷 酸依托泊苷）、長春堿（vinblastine)、長春新堿（vincristine)、長春地辛（vindesine)、紫 杉燒（taxane)(包括紫杉醇（taxol)、泰索帝（taxotere)視黃酸、丁酸、N8-乙?；鶃喚?、 喜樹喊（camptothecin)、卡奇霉素（calicheamicin)、埃斯波霉素（esperamicin)、烯二塊、 多卡米新（duocarmycin)A、多卡米新SA、卡奇霉素、喜樹堿、類美登醇（包括DM1)、甲基澳瑞 他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)、甲基澳瑞他汀F(MMAF)以及類美登醇（DM4)以及 它們的類似物。
[0179] 毒素可以用作抗體-毒素綴合物，并且包括細(xì)菌毒素，如白喉毒素；植物毒素， 如菌麻毒素；小分子毒素，如格爾德毒素（861(^1^1115^;[11)(1&111(1161'等人（2000)]\似1:. Cancer Inst.92(19) :1573-1581 ;Mandler 等人（2000)Bioorganic&Med.Chem. Letters 10 :1025-1028 ;Mandler 等人（2002)Bioconjugate Chem. 13 :786-791);類美登醇（EP 1391213 ;Liu 等人（1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618-8623)，以及卡奇霉素（Lode 等人（l"8) Cancer Res. 58 :2928 ;Hinman 等人（I993) Cancer Res. 53 :3336-3342)。毒素 可通過包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制的機(jī)制來施加它們的細(xì)胞毒性作用 和細(xì)胞生長抑制作用。
[0180] 涵蓋Toso抗體與一種或多種小分子毒素（如類美登醇、多拉司他汀、澳瑞他汀、單 端孢霉烯、卡奇霉素以及CC1065)和具有毒素活性的這些毒素的衍生物的綴合物。
[0181] 根據(jù)上述中的任一項(xiàng)，可對本發(fā)明的抗體進(jìn)行的另一種類型的修飾是糖基化中的 改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的抗體可被修飾以便包括一種或多種工程化糖型 (glycoform)。如本文所用的"工程化糖型"意思是共價(jià)附接至抗體的碳水化合物組成，其 中所述碳水化合物組成在化學(xué)上不同于親本抗體的碳水化合物組成。工程化糖型可適用于 多種目的，包括但不限于增強(qiáng)或減弱效應(yīng)子功能。工程化糖型的示例性形式是無巖藻糖基 化（afucosylation)，其已被證實(shí)與ADCC功能的增加相關(guān)，這可能是通過與Fc Y Rllla受體 的較緊密結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。在這種情形下，"無巖藻糖基化"意思是宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的大多數(shù)抗 體大致上不含巖藻糖，例如90-95-98%的所產(chǎn)生抗體中沒有可觀量的巖藻糖作為抗體的碳 水化合物部分的組分（通常附接在Fc區(qū)中的N297處）。功能上定義的無巖藻糖基化抗體 通常表現(xiàn)出對FcyRIIla受體至少50%或更高的親和力。
[0182] 工程化糖型可通過本領(lǐng)域中已知的各種方法產(chǎn)生（Umana等人，1999, Nat Biotechnol 17:176-180 ;Davies 等人，2001，Biotechnol Bioeng74:288_294;Shields 等人，2002, J Biol Chem 277:26733-26740 ;Shinkawa 等人，2003, J Biol Chem 278: 3466-3473 ;美國專利號(hào)6, 602, 684 ;美國序列號(hào)10/277, 370 ;美國序列號(hào)10/113, 929 ;PCT W000/61739A1 ;PCT TO 01/29246A1 ;PCT TO 02/31140A1 ;PCT TO02/30954A1，它們?nèi)砍?于所有目的并且特別是出于涉及工程化糖型的所有教導(dǎo)的目的以引用的方式整體并入。這 些技術(shù)中的許多技術(shù)是基于控制共價(jià)附接至Fc區(qū)的巖藻糖基化和/或平分型寡糖的水 平，例如通過于各種工程化的或其它生物體或細(xì)胞系（例如Lec-13CH0細(xì)胞或大鼠雜交瘤 YB2/0細(xì)胞）中表達(dá)IgG、通過調(diào)控涉及糖基化途徑的酶（例如FUT8[a 1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶]和/或0 1-4-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶111[0111'111])、或通過在1§6被表達(dá)之后修飾 一種或多種碳水化合物來進(jìn)行控制。例如，Seattle Genetics的"糖工程化抗體"或"SEA 技術(shù)"通過添加抑制產(chǎn)生期間的巖藻糖基化的修飾的糖而起作用；參見例如20090317869， 其特此以引用的方式整體并入本文。工程化糖型通常是指不同碳水化合物或寡糖；因此抗 體可包括工程化糖型。
[0183] 或者，工程化糖型可指包含不同碳水化合物或寡糖的變體。如本領(lǐng)域中所已知，糖 基化模式可取決于蛋白質(zhì)的序列（例如存在或不存在以下所論述的特定糖基化氨基酸殘 基）或產(chǎn)生蛋白質(zhì)所處的宿主細(xì)胞或生物體兩者。具體表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的并且在 本文進(jìn)行了論述
[0184] 多肽的糖基化通常是N-連接的糖基化或0-連接的糖基化。N-連接的是指碳水化 物部分附接至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬 酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是碳水化物部分酶促附接至天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序 列。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任一者都會(huì)產(chǎn)生潛在糖基化位點(diǎn)。0-連接的糖基 化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者附接至羥基氨基酸，最通常是絲氨酸或 蘇氨酸，但也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
[0185] 向抗體（或向任何其它多肽，如以上所論述的可溶性Toso蛋白）添加糖基化位點(diǎn) 宜通過改變氨基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一個(gè)或多個(gè)來完成（針對N-連接 的糖基化位點(diǎn)）。改變也可通過向起始序列中添加一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基或取代 起始序列的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行（針對〇-連接的糖基化位點(diǎn)）。為方便 起見，抗體氨基酸序列優(yōu)選通過DNA層次上的變化來改變，尤其通過使編碼靶多肽的DNA在 預(yù)選的堿基處突變以使得產(chǎn)生將翻譯成所需氨基酸的密碼子。
[0186] 增加抗體上的碳水化合物部分的數(shù)目的另一手段是通過使糖苷化學(xué)或酶促偶聯(lián) 至蛋白質(zhì)來達(dá)成。這些程序是有利的，因?yàn)樗鼈儾恍枰诰哂蠳-連接的糖基化和0-連接 的糖基化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。取決于所使用的偶聯(lián)模式，一種或多種 糖可附接至（a)精氨酸和組氨酸，（b)游離羧基，（c)游離硫氫基，如半胱氨酸的游離硫氫 基，（d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的游離羥基，（e)芳族殘基，如苯丙氨酸、 酪氨酸或色氨酸的芳族殘基，或（f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法描述于W0 87/05330及 Aplin和 Wriston，1981，CRC Crit. Rev. Biochem?，第 259-306 頁中，兩者全部出于所有目的 并且特別是出于涉及將碳水化合物部分偶聯(lián)至蛋白質(zhì)的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式 整體并入。
[0187] 起始抗體上存在的碳水化合物部分的去除（例如翻譯后）可用化學(xué)方法或酶方法 實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)去糖基化需要蛋白質(zhì)暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。這種處理導(dǎo)致 除連接糖（N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺）之外的大多數(shù)或全部糖裂解，同時(shí)保持 多膚完整?；瘜W(xué)去糖基化由 Hakimuddin等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 :52和Edge 等人，1981，Anal. Biochem. 118 :131描述，兩者以引用的方式整體并入。多肽上的碳水化合 物部分的酶裂解可通過如由Thotakura等人，1987, Meth. Enzymol. 138 :350所描述使用各 種內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶來實(shí)現(xiàn)，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入。可通過如由Duskin 等人，1982, J. Biol. Chem. 257 :3105所描述使用化合物衣霉素（tunicamycin)來防止?jié)撛?糖基化位點(diǎn)處的糖基化。衣霉素阻斷蛋白質(zhì)-N-糖苷鍵聯(lián)的形成。
[0188] 另一類型的抗體共價(jià)修飾包括以例如Nektar Therapeutics的2005-2006PEG目 錄（可從 Nektar 網(wǎng)站獲得）美國專利號(hào) 4, 640, 835、4, 496, 689、4, 301，144、4, 670, 417、 4, 791，192或4, 179, 337中提及的方式將抗體連接至各種非蛋白質(zhì)聚合物，包括但不限于 各種多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，所述文獻(xiàn)都出于所有目的并且特別是出于 涉及將抗體連接至聚合物的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。此外，如本領(lǐng)域中 所已知，氨基酸取代可于抗體內(nèi)的各種位置上進(jìn)行以促進(jìn)如PEG的聚合物的添加。參見例 如，美國公布號(hào)2005/0114037A1，其以引用的方式整體并入。
[0189] 本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼本發(fā)明的Toso抗體的核酸。在重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒 定結(jié)構(gòu)域均包括于抗體中的情況下，通常使用編碼各自的核酸來制作這些恒定結(jié)構(gòu)域，所 述核酸被組合到標(biāo)準(zhǔn)宿主細(xì)胞（例如CH0細(xì)胞等）中，以便產(chǎn)生抗體的四聚體結(jié)構(gòu)。如果 制作僅一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，將使用僅單個(gè)核酸。
[0190] 根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的制劑可通過將具有所需純度的抗體與任選的藥學(xué)上可 接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑（Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol， A.編輯[1980]) -起混合成凍干制劑或水溶液的形式來制備以供儲(chǔ)存?？山邮艿妮d體、 賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度下對接受者無毒性，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、 檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑（如十八烷基二甲基 節(jié)基氯化銨、氯化六經(jīng)季銨（hexamethonium chloride)、氯化苯二甲輕銨（benzalkonium chloride)、氯化節(jié)甲乙氧銨（benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或節(jié)醇、對輕苯甲酸燒 酯（如對羥苯甲酸甲酯或丙酯）、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇以及間-甲酚）；低分子 量（小于約10個(gè)殘基）多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如 聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單 糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ;糖，如蔗糖、甘 露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉離子；金屬絡(luò)合物（例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物）； 和/或非離子型表面活性劑，如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇（PEG)。
[0191] 本發(fā)明的制劑也可含有所治療的特定適應(yīng)癥所需要的多于一種活性化合物，優(yōu)選 為具有互補(bǔ)活性并且不會(huì)不利地影響彼此的那些化合物。例如，可能需要提供具有其它特 異性的抗體。或者或此外，組合物可包含細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長抑制劑和/或小分子 拮抗劑。這類分子適當(dāng)?shù)匾詫︻A(yù)期目的有效的量組合存在。
[0192] 所述活性成分也可圍堵在例如通過凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊（例 如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚（甲基丙酸甲酯）微膠囊）中、膠狀藥物遞送系 統(tǒng)（例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子及納米膠囊）中、或巨乳液中。這類技術(shù) 公開于 Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol，A?編輯（1980)中。
[0193] 待用于體內(nèi)施用的制劑應(yīng)當(dāng)無菌或接近無菌。這可通過經(jīng)無菌過濾膜過濾來容易 地實(shí)現(xiàn)。
[0194] 可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適實(shí)例包括含有抗體的固體疏水性聚合 物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)呈成形物品例如膜、或微膠囊的形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括 聚酯、水凝膠（例如聚（2-羥乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸（美國專利號(hào) 3, 773, 919)、L-谷氨酸與.Y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPR0NDEPOT'K'(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞 林組成的可注射微球）以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸 的聚合物能夠釋放分子超過100天，而某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)持續(xù)較短的時(shí)間。
[0195] 當(dāng)囊封的抗體保留在體內(nèi)持續(xù)長時(shí)間時(shí)，其可能會(huì)因暴露于37°C下的濕氣而變 性或聚集，從而使生物活性喪失且可能使免疫原性發(fā)生變化?？扇Q于所涉及的機(jī)制設(shè)計(jì) 出合理策略以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過硫代-二硫鍵交換而形成分子內(nèi) S--S鍵，那么可通過修飾巰基殘基、自酸性溶液凍干、控制濕氣含量、使用適當(dāng)添加劑以及 開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
[0196] IV.調(diào)節(jié)Toso活件的方法
[0197] 一方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)Toso活性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Toso活性的 方法包括抑制Toso活性。在其它實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Toso活性的方法包括增加Toso活性。
[0198] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法直接涉及調(diào)節(jié)Toso活性。在一個(gè)示例性實(shí)施方 案中，所述方法包括應(yīng)用結(jié)合Toso的藥劑如抗體。
[0199] 在其它實(shí)施方案中，間接地調(diào)節(jié)Toso活性，例如通過結(jié)合Toso的同源配體來調(diào)節(jié) Toso活性。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，通過施用可溶性Toso蛋白來調(diào)節(jié)Toso活性。
[0200] 在其它實(shí)施方案中，通過多種機(jī)制的組合來調(diào)節(jié)Toso活性，例如通過施用包含結(jié) 合Toso的藥劑的組合物與包含結(jié)合Toso的同源配體的藥劑的組合物的組合來調(diào)節(jié)Toso 活性。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，這種組合物可包括但不限于Toso抗體和可溶性Toso蛋 白。
[0201] 如將理解，調(diào)節(jié)Toso活性的方法可包括使用以任何組合的本文所描述的任何組 合物，包括SEQ ID N0. 1-25中的任何一個(gè)或多個(gè)以及如本文所描述的其任何變體或修飾。
[0202] V.治療病癥的方法
[0203] -方面并且根據(jù)以上中的任一項(xiàng)，本發(fā)明提供通過用調(diào)節(jié)Toso活性的組合物（包 括但不限于可溶性Toso蛋白或Toso的抗體）治療有需要的受試者來治療病癥的方法。
[0204] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中并且根據(jù)以上中的任一項(xiàng)，本發(fā)明提供通過用包括可溶性 Toso蛋白的組合物治療有需要的受試者來治療病癥的方法。不受理論限制，通過其可溶性 Toso蛋白是用于這些病癥的有效治療的一種潛在機(jī)制是通過調(diào)節(jié)Toso活性。在某些實(shí)施 方案中，根據(jù)本發(fā)明治療病癥的方法包括施用治療有效量的本文所描述的任何可溶性Toso 蛋白，包括包含SEQ ID NO :1-25中的任何一個(gè)或多個(gè)的可溶性Toso蛋白或其任何變體。在 其它實(shí)施方案中，用于治療病癥（包括糖尿病、多發(fā)性硬化癥、哮喘和癌癥）的可溶性Toso 蛋白包括與 SEQ ID N0:l-25 中的任一個(gè)具有約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的多肽。所述多肽可進(jìn)一步根據(jù)本文所描述 的方法進(jìn)行修飾（包括化學(xué)修飾）以用于治療本文所描述的任何病癥。
[0205] 在其它方面，本發(fā)明涉及通過向受試者施用可溶性Toso蛋白（或其變體）來治療 病癥和疾病的方法。本發(fā)明的可溶性Toso蛋白可用于治療患有但不限于以下各項(xiàng)的受試 者：自身免疫性病癥（包括但不限于1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、2型糖 尿病、哮喘、過敏癥、慢性阻塞性肺?。?C0PD"）、高-IgM綜合癥、狼瘡、癌癥或中性白細(xì)胞 增多癥相關(guān)的病癥（包括但不限于中性粒細(xì)胞減少癥、重度先天性中性粒細(xì)胞減少癥、環(huán) 狀中性粒細(xì)胞減少癥、抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞減少癥、網(wǎng)狀發(fā)育不良、白細(xì)胞粘附缺陷、常 見骨髓增生性疾病、慢性髓細(xì)胞性白血病、常見感冒蕁麻疹和白細(xì)胞增多以及慢性肉芽腫 ?。?。如將理解，本文所描述的任何可溶性Toso蛋白均可單獨(dú)地或以任何組合用于治療任 何這些病癥或疾病。
[0206] 在其它實(shí)施方案中，將藥學(xué)上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試 者以便治療本文所討論的任何病癥。在一些實(shí)施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白 包括細(xì)胞外Toso結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)序列和/或柔性接頭。在仍然其它實(shí)施 方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)的序列。還可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)的組合（作為單獨(dú)的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療本文所討 論的任何病癥。所述多肽還可根據(jù)本文的描述進(jìn)行進(jìn)一步修飾（包括化學(xué)修飾）以便治療 所述病癥。在仍然其它實(shí)施方案中，用于治療本文所描述的任何病癥的可溶性Toso蛋白具 有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以 用于治療本文所討論的任何病癥的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有至少約70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。 在其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療本文所討論的任何病癥的可溶性Toso蛋白 具有與 SEQ ID N0 :5 具有約 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% _96%、91% -99%、 92% -98%、93% _97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它實(shí)施方案中，施用至受試者 以用于治療本文所討論的任何病癥的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11. 12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸取代的5￡〇10勵(lì).5。在又其它實(shí)施方案 中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、 5-10、6-9、7-8個(gè)氨基酸取代的SEQ ID N0:5。在其它示例性實(shí)施方案中，將約12. 1、12. 2、 12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、 13. 9、14mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白 的量可使用用于將來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量轉(zhuǎn)換至人的廣泛接受的體表面積（BSA)標(biāo)準(zhǔn)化方 法基于動(dòng)物研究來確定。（參見 Reagan_Shaw、S.，Nihal，M?和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)〇
[0207] 在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療處于1型糖尿病或2型糖尿 病的風(fēng)險(xiǎn)或具有1型糖尿病或2型糖尿病的受試者。在其它實(shí)施方案中，將藥學(xué)上可接受量 的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試者。在一些實(shí)施方案中，施用至受試者以便治療糖 尿病的可溶性Toso蛋白包括細(xì)胞外Toso結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)序列和/或接 頭。在仍然其它實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)的 序列或本文所討論的SEQ ID N0 :1-25的任何變體。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以 用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包括與SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)具有至少約70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。 還可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)的組合（作為單獨(dú)的多肽或一起作為融合蛋白）以 便治療糖尿病。所述多肽還可根據(jù)本文的描述進(jìn)行進(jìn)一步修飾（包括化學(xué)修飾）以便治療 糖尿病。在仍然其它實(shí)施方案中，用于針對糖尿病治療受試者的可溶性Toso蛋白具有包含 SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療 糖尿病的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。在其它實(shí)施方案中，施 用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有約75%-99%、 80%-98%、85%-97%、90%-96%、91%-99%、92%-98%、93%-97%、94%-96%同一 性的序列。在仍然其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包 含具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)氨基酸取代的SEQ IDNO. 5。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療糖尿病的可溶性Toso蛋白包含 具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8個(gè)氨基酸取代的5￡0 1〇勵(lì)：5。在仍然其它實(shí) 施方案中，用根據(jù)本文所描述的任何組合物的可溶性Toso蛋白治療用于改進(jìn)受試者中的 葡萄糖耐量，并且由此治療糖尿病。在示例性實(shí)施方案中，將約10-20、11-19、12-18、13-17、 14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。在其它示例性實(shí)施方案中， 將約 10、10. 1、10. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、11. 4、 11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、 13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、14、14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、14. 5、 14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、15. 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg 的可 溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白的量可使用用于 將來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量轉(zhuǎn)換至人的廣泛接受的體表面積（BSA)標(biāo)準(zhǔn)化方法基于動(dòng)物研究 來石角定° (參見 Reagan-Shaw、S.，Nihal，M.和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)。對于本文進(jìn)一步詳細(xì)地描述的 實(shí)驗(yàn)來說，50 y g劑量用于疾病模型中，所述劑量在20g小鼠中將大約是2. 5mg/kg。使用 BSA轉(zhuǎn)換，所述劑量將是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或?qū)τ?0kg成人來說大約12. 2mg。
[0208] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療處于多發(fā)性硬化癥的風(fēng)險(xiǎn)或 具有多發(fā)性硬化癥的受試者。在其它實(shí)施方案中，將藥學(xué)上可接受量的可溶性Toso蛋白 施用至有需要的受試者以用于治療或改善多發(fā)性硬化癥。在一些實(shí)施方案中，施用至受試 者的可溶性Toso蛋白包括和Fc結(jié)構(gòu)域和/或柔性接頭。在一些實(shí)施方案中，施用至受試 者的可溶性Toso蛋白包括細(xì)胞外Toso結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)序列和/或接 頭。在仍然其它實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :1-24中的任一個(gè) 的序列。還可使用SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)的組合（作為單獨(dú)的多肽或一起作為融合 蛋白）以便治療多發(fā)性硬化癥。所述多肽還可根據(jù)本文的描述進(jìn)行進(jìn)一步修飾（包括化 學(xué)修飾）以便治療多發(fā)性硬化癥。在仍然其它實(shí)施方案中，所述可溶性Toso蛋白具有包 含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于 治療多發(fā)性硬化癥的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具有至少約70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。在其它實(shí)施 方案中，施用至受試者以用于治療多發(fā)性硬化癥的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5具 有約 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% -96%、91% -99%、92% -98%、93% -97%、 94% -96%同一性的序列。在仍然其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療多發(fā)性硬化 癥的可溶性 Toso 蛋白包含具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20個(gè)氨基酸取代的SEQ ID N0. 5。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療多發(fā)性 硬化癥的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8個(gè)氨基酸取代 的SEQ ID N0 :5。在仍然其它實(shí)施方案中，用根據(jù)本文所描述的任何組合物的可溶性Toso 蛋白治療用于延遲多發(fā)性硬化癥的進(jìn)展。在示例性實(shí)施方案中，將約10-20、11-19、12-18、 13-17、14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。在其它示例性實(shí)施方 案中，將約 10、10. 1、10. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、 11. 4、11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、 12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、14、14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、 14. 5、14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、15. 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg 的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解，可溶性Toso蛋白的量可使 用用于將來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量轉(zhuǎn)換至人的廣泛接受的體表面積（BSA)標(biāo)準(zhǔn)化方法基于動(dòng) 物研究來確定。（參見 Reagan-Shaw、S.，Nihal，M?和 Admad，N. Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)。對于本文進(jìn)一步詳細(xì)地 描述的實(shí)驗(yàn)來說，50ii g劑量用于疾病模型中，所述劑量在20g小鼠中將大約是2. 5mg/kg。 使用BSA轉(zhuǎn)換，所述劑量將是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或?qū)τ?0kg成人來說大約12. 2mg。
[0209] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療處于關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)或具有關(guān) 節(jié)炎的受試者。在其它實(shí)施方案中，將藥學(xué)上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的 受試者以用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎。在一些實(shí)施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包 括和Fc結(jié)構(gòu)域和/或接頭。在一些實(shí)施方案中，施用至受試者的可溶性Toso蛋白包括細(xì) 胞外Toso結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)序列和/或接頭。在仍然其它實(shí)施方案中， 所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0 :1-25中的任一個(gè)的序列。還可使用SEQ ID N0: 1-25中的任一個(gè)的組合（作為單獨(dú)的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療關(guān)節(jié)炎。所述多 肽還可根據(jù)本文的描述進(jìn)行進(jìn)一步修飾（包括化學(xué)修飾）以便治療關(guān)節(jié)炎。在仍然其它實(shí) 施方案中，所述可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中示出）。在又 其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療關(guān)節(jié)炎的可溶性Toso蛋白具有與SEQ ID N0. 5 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%同一性的序列。在其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療關(guān)節(jié)炎的可溶性Toso蛋 白具有與 SEQ ID 勵(lì).5具有約75%-99%、80%-98%、85%-97%、90%-96%、91%-99%、 92% -98%、93% -97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它實(shí)施方案中，施用至受試者 以用于治療關(guān)節(jié)炎的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20個(gè)氨基酸取代的SEQ ID N0. 5。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以 用于治療關(guān)節(jié)炎的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8個(gè)氨基 酸取代的SEQ ID N0 :5。在仍然其它實(shí)施方案中，用根據(jù)本文所描述的任何組合物的可溶 性Toso蛋白治療用于預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)病或針對關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行保護(hù)。
[0210] 在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療處于哮喘的風(fēng)險(xiǎn)或具有哮喘 的受試者。在其它實(shí)施方案中，將藥學(xué)上可接受量的可溶性Toso蛋白施用至有需要的受試 者。在一些實(shí)施方案中，施用至受試者以便治療哮喘的可溶性Toso蛋白包括細(xì)胞外Toso 結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)序列和/或接頭。在仍然其它實(shí)施方案中，所述可溶性 Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID N0:l-25中的任一個(gè)的序列或本文所討論的SEQ ID N0:l-25 的任何變體。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白包 括與 SEQ ID N0:l-25 中的任一個(gè)具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。還可使用5￡0 1〇勵(lì).：1-25中的 任一個(gè)的組合（作為單獨(dú)的多肽或一起作為融合蛋白）以便治療哮喘。所述多肽還可根 據(jù)本文的描述進(jìn)行進(jìn)一步修飾（包括化學(xué)修飾）以便治療哮喘。在仍然其它實(shí)施方案中， 用于針對哮喘治療受試者的可溶性Toso蛋白具有包含SEQ ID N0 :5的序列（其在圖8中 示出）。在又其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白具有與 SEQ ID 吣.5具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %冋一性的序列。在其它實(shí)施方案中，施用至受試者以用于治療哮喘的可溶 性 Toso 蛋白具有與 SEQ ID NO. 5 具有約 75% -99%、80% -98%、85% -97%、90% -96%、 91% _99%、92% _98%、93% _97%、94% -96%同一性的序列。在仍然其它實(shí)施方案中，施 用至受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、 14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸取代的5￡〇10勵(lì).5。在又其它實(shí)施方案中，施用至 受試者以用于治療哮喘的可溶性Toso蛋白包含具有1-30、2-25、3-20、4-15、5-10、6-9、7-8 個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO :5。在仍然其它實(shí)施方案中，用根據(jù)本文所描述的任何組合物 的可溶性Toso蛋白治療用于改進(jìn)受試者中的葡萄糖耐量，并且由此治療哮喘。在示例性實(shí) 施方案中，將約10-20、11-19、12-18、13-17、14-16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲 得治療作用。在其它示例性實(shí)施方案中，將約l〇、l〇. l、l〇. 2、10. 3、10. 4、10. 5、10. 6、10. 7、 10. 8、10. 9、11、11. 1、11. 2、11. 3、11. 4、11. 5、11. 6、11. 7、11. 8、11. 9、12、12. 1、12. 2、12. 3、 12. 4、12. 5、12. 6、12. 7、12. 8、12. 9、13. 1、13. 2、13. 3、13. 4、13. 5、13. 6、13. 7、13. 8、13. 9、 14、 14. 1、14. 2、14. 3、14. 4、14. 5、14. 6、14. 7、14. 8、14. 9、15、15. 1、15. 2、15. 3、15. 4、15. 5、 15、 6、15. 7、15. 8、15. 9、16mg的可溶性Toso蛋白施用至受試者以獲得治療作用。如將理解， 可溶性Toso蛋白的量可使用用于將來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量轉(zhuǎn)換至人的廣泛接受的體表面積 (BSA)標(biāo)準(zhǔn)化方法基于動(dòng)物研究來確定。（參見Reagan_Shaw、S.，Nihal，M?和Admad，N.Dose translation from animal to human studies revisited. 2007. The Faseb Journal)〇 對 于本文進(jìn)一步詳細(xì)地描述的實(shí)驗(yàn)來說，50 y g劑量用于疾病模型中，所述劑量在20g小鼠中 將大約是2. 5mg/kg。使用BSA轉(zhuǎn)換，所述劑量將是0. 2027mg/kg或7. 5mg/m2或?qū)τ?0kg 成人來說大約12. 2mg。
[0211] 在其它實(shí)施方案中，本文所描述的可溶性Toso蛋白，包括包含SEQ ID NO. 1-25的 多肽中的任何一種或多種的可溶性Toso蛋白是呈用作藥劑的形式。在其它實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供一種用作藥劑的可溶性Toso蛋白，所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID N0. 1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 的多肽中的任何一 種或多種（或任何一種或多種的一部分）。在仍然其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于使用包 含SEQ ID N0. 1-25的多肽中的任何一種或多種的可溶性Toso蛋白用于治療以下病癥中的 任一種的方法：自身免疫性病癥（包括但不限于1型糖尿病或2型糖尿病、多發(fā)性硬化癥或 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、哮喘、過敏癥、慢性阻塞性肺?。?C0PD")、高-IgM綜合癥、狼瘡、癌癥或中 性白細(xì)胞增多癥相關(guān)的病癥（包括但不限于中性粒細(xì)胞減少癥、重度先天性中性粒細(xì)胞減 少癥、環(huán)狀中性粒細(xì)胞減少癥、抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞減少癥、網(wǎng)狀發(fā)育不良、白細(xì)胞粘附 缺陷、常見骨髓增生性疾病、慢性髓細(xì)胞性白血病、常見感冒蕁麻疹和白細(xì)胞增多以及慢性 肉芽腫?。?。
[0212] 如以上所討論，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Toso蛋白用于治療癌癥。在 其它實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療癌癥的方法包括通過調(diào)節(jié)Toso活性來抑制腫瘤侵襲 和/或轉(zhuǎn)移的方法。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于治療有需要的受試者中的 腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤或畸胎癌的組中的任一個(gè)。在其它實(shí)施方案 中，本發(fā)明的組合物用于治療患有以下中的一個(gè)或多個(gè)中的癌癥的受試者：腎上腺、膀胱、 骨、骨髓、腦、乳房、子宮頸、膽囊、神經(jīng)節(jié)、胃腸道、心臟、腎、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲狀旁 腺、陰莖、前列腺、唾液腺、皮膚、脾、睪丸、胸腺、甲狀腺或子宮。
[0213] 實(shí)施例1 :T〇S〇在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起作用
[0214] 將TOSO+小鼠和野生型小鼠皮下注射于完全弗氏佐劑中的II型雞膠原并且監(jiān)測 隨時(shí)間推移的疾病進(jìn)展。暴露于II型膠原的動(dòng)物發(fā)展具有與人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)類似 的免疫學(xué)、病理學(xué)和組織學(xué)特征的疾病。如使用數(shù)字測徑器通過踝關(guān)節(jié)厚度的變化測量的 關(guān)節(jié)炎癥在T〇S〇+小鼠中顯著減輕（圖1A)。此外，基于可見腫脹和活動(dòng)性針對每個(gè)關(guān)節(jié) 從0-4對疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行計(jì)分。與野生型對照相比，TOSO+小鼠具有顯著降低的臨床得 分（圖1B)。對引流淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示B220+B細(xì)胞的顯著減 少（圖1C)。這些數(shù)據(jù)表明Toso在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。
[0215] 實(shí)施例2 :用Toso-Fc治療針對關(guān)節(jié)炎進(jìn)行保護(hù)
[0216] 這個(gè)實(shí)施例顯示用Toso-Fc(SEQIDN0 :5)治療針對關(guān)節(jié)炎進(jìn)行保護(hù)。將易患關(guān) 節(jié)炎的小鼠DBA1腹膜內(nèi)預(yù)先給藥50ygToso-Fc，用于完全弗氏佐劑中的II型膠原進(jìn)行免 疫以便誘導(dǎo)疾病，并且然后在實(shí)驗(yàn)過程中每周三次用Toso-Fc進(jìn)行治療。Toso-Fc治療的 小鼠被針對疾病的嚴(yán)重程度和發(fā)病率兩者保護(hù)，從而表明Toso-Fc施用可適用于管理關(guān)節(jié) 炎。例如，圖24A示出如與對照小鼠（僅用媒介物治療）相比，累加關(guān)節(jié)炎得分在Toso-Fc 治療的小鼠中是可忽略不計(jì)的。類似地，圖24B也示出如與對照相比，關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率百分 比在Toso-Fc治療的小鼠中是可忽略不計(jì)的。關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀被評(píng)定如下：0=正常，1 =輕微腫脹和/或紅斑，2 =顯著腫脹，3 =關(guān)節(jié)強(qiáng)直。添加每個(gè)小鼠的單獨(dú)肢得分，從而得 到12的最大疾病得分。當(dāng)觀察到小鼠在一個(gè)肢中具有1的疾病得分時(shí)，注意到疾病的發(fā)病 率。
[0217] 圖25提供顯示來自用膠原刺激的Toso-Fc治療的小鼠和媒介物治療的小鼠的脾 細(xì)胞的回憶應(yīng)答（增殖）的另外數(shù)據(jù)。如圖中所示，來自用Toso-Fc治療的小鼠的脾細(xì)胞 顯示比來自媒介物治療的對照的脾細(xì)胞減少的增殖應(yīng)答。
[0218] 實(shí)施例3 :-旦關(guān)節(jié)炎形成，Toso-Fc是針對所述疾病有效的
[0219] 如以上所示，Toso-Fc的預(yù)防性施用在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的鼠類模型中改善疾病癥 狀。這個(gè)實(shí)施例顯示施用Toso-Fc在治療性背景下（S卩，當(dāng)疾病已經(jīng)形成時(shí)）也是有效的。
[0220] 將雌性DBA. 1小鼠（6至8周大）隨機(jī)分配成2組，當(dāng)觀察到疾病時(shí)一組接受媒介 物治療，并且另一組接受Toso-Fc。將所有小鼠用膠原進(jìn)行接種以便誘導(dǎo)疾病。在免疫后第 43天觀察到疾病癥狀的引發(fā)。將所述動(dòng)物在第52天時(shí)用媒介物對照或Toso-Fc進(jìn)行治療， 如由曲線上的箭頭所指示（圖26)。在第57天之后，Toso-Fc的治療性施用顯著降低總疾 病得分和關(guān)節(jié)炎發(fā)病率（參見圖26)。這些數(shù)據(jù)指示當(dāng)疾病已經(jīng)形成時(shí)，Toso-Fc可有效地 管理關(guān)節(jié)炎癥狀，并且因此可以在治療性以及預(yù)防性背景下是有效的。
[0221] 實(shí)施例4 :Toso在哮喘的發(fā)展中起作用
[0222] 哮喘是以異常TH2活化、IgE的產(chǎn)生、支氣管高反應(yīng)性以及白細(xì)胞外滲至支氣管粘 膜中的過敏性病癥。嗜酸性粒細(xì)胞增多是過敏性哮喘的標(biāo)志并且被認(rèn)為是炎癥中的關(guān)鍵參 與者。哮喘的病理表現(xiàn)引起肺收縮，從而導(dǎo)致氣喘、呼吸短促、胸悶和咳嗽。
[0223] 對Toso-/-小鼠和野生型小鼠進(jìn)行0VA誘導(dǎo)的哮喘模型（圖2A)。在第0天、第7 天和第14天腹膜內(nèi)遞送OVA (10mg/kg)。小鼠然后在第21天、第22天和第23天接受霧化 0VA(lmg/ml)達(dá)30分鐘，并且在2天之后處死。如通過DifQuik染色所評(píng)定，Toso-/-小鼠 在嗜酸性粒細(xì)胞遷移至支氣管肺泡空間方面具有顯著減少（圖2B)?；谛螒B(tài)，通過對每個(gè) 載玻片至少200個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來量化嗜酸性粒細(xì)胞（圖2C)。
[0224] 哮喘和其它過敏性疾病典型特征具有天然T細(xì)胞優(yōu)先分化成TH2細(xì)胞的典型特 征。評(píng)定了支氣管肺泡灌洗液（BALF)中TH2相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的存在。如通過 ELISA所評(píng)定，Toso-/-小鼠在BALF中具有0VA誘導(dǎo)的TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13 的顯著減少（圖3A-C)。與受阻抑的嗜酸性粒細(xì)胞遷移至肺中一致，Toso-/-小鼠在BALF 中具有顯著減少的嗜酸性細(xì)胞活化趨化因子（一種嗜酸性粒細(xì)胞虜獲C-C趨化因子）（圖 3D)。支氣管平滑肌細(xì)胞已知響應(yīng)于TNF a產(chǎn)生嗜酸性細(xì)胞活化趨化因子。既然Toso已知 在肺中表達(dá)，并且Toso缺陷使小鼠對TNF頑固，本發(fā)明人尋求解決Toso對嗜酸性粒細(xì)胞趨 化因子水平的作用是否是肺固有的。培養(yǎng)的Toso-/-支氣管平滑肌細(xì)胞具有顯著降低的響 應(yīng)于TNF a治療產(chǎn)生的嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的水平（圖3E)。這些數(shù)據(jù)一起表明Toso缺 陷影響肺中的0VA誘導(dǎo)的TH2細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平。
[0225] 過敏性哮喘的一個(gè)標(biāo)志是IgE的過量產(chǎn)生。產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞被誘導(dǎo)以便由TH2 細(xì)胞因子如 IL-4 產(chǎn)生 IgE(0ettgen，H.C?和 R.S.Geha，IgE regulation and roles in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol，2001.107(3) :p. 429-40)。血清中 OVA誘 導(dǎo)的總IgE水平和OVA特異性IgE水平在Toso-/-小鼠中受到顯著阻抑（圖4A和B)，而 0VA特異性IgGl在野生型和敲除的之間類似（圖4C)。這些數(shù)據(jù)表明Toso的遺傳消融或 可能治療性阻斷可以減少IgE的產(chǎn)生。
[0226] 代表過敏性氣喘的炎癥事件在引起限制氣流至肺的氣道重塑中達(dá)到頂點(diǎn)。因此， 通過使用全身體積描記法測量響應(yīng)于增加的乙酰甲膽堿劑量的增強(qiáng)間歇（Penh)來評(píng)定 Toso缺陷是否影響0VA誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性。Toso-/-小鼠被顯著保護(hù)免于0VA誘導(dǎo)的氣 道高反應(yīng)性，如通過與野生型對照相比Penh值的顯著降低所指示（圖5)。這些數(shù)據(jù)表明 Toso阻斷是用于減輕過敏性哮喘中的氣道反應(yīng)性的有效策略。
[0227] 實(shí)施例5 :Toso消融影響樹突細(xì)胞活性
[0228] Toso消融對過敏性和炎性疾病的發(fā)作具有廣泛作用。一種可能的非限制性機(jī)制 是Toso在全局水平下調(diào)控這些疾病過程，可能通過樹突細(xì)胞（DC)將抗原呈遞至天然T細(xì) 胞的功能。
[0229] 為了測試TOSO+樹突細(xì)胞在疾病的發(fā)作或在T細(xì)胞的活化中的功能相關(guān)性，本發(fā) 明人確定負(fù)載抗原的T 〇S〇-/-DC的轉(zhuǎn)移是否引發(fā)與野生型對應(yīng)受體類似的疾病過程。
[0230] 通過與GM-CSF -起培養(yǎng)來制備源自野生型和Tosof骨髓的DC (參見Lutz， M. B.等人，An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods,1999. 223(1)： p. 77-92,所述文獻(xiàn)特此出于所有目的并且特別是出于關(guān)于培養(yǎng)樹突細(xì)胞的所有教導(dǎo)的 目的而以引用的方式整體并入）。與Lambrecht等人的方案類似，本實(shí)驗(yàn)中的DC負(fù)載有 0VA。將負(fù)載抗原的DC滴入C57BL6動(dòng)物的氣管中（參見Lambrecht，B. N.，等人，Myeloid dendritic cells induce Th2 responses to inhaled antigen，leading to eosinophilic airway inflammation. J Clin Invest，2000. 106(4) :p. 551-9,所述文獻(xiàn)特此出于所有目 的并且特別是出于涉及樹突細(xì)胞的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式并入）。一周之后，將動(dòng) 物按照哮喘研究用霧化0VA進(jìn)行治療持續(xù)連續(xù)三天。顯著地，負(fù)載0VA的T 〇S〇f樹突細(xì)胞與 野生型對照相比在其誘導(dǎo)至BALF中的TH2細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力方面被顯著降低（圖7A)。 2d2TCR轉(zhuǎn)基因品系包含對用于引發(fā)EAE的M0G35-55肽具有特異性的T細(xì)胞（Bettelli， E.，等人，Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med, 2003.197(9)： p. 1073-81)。源自2d2小鼠的T細(xì)胞未能在與負(fù)載M0G35-55的Tos〇-/-DC共培養(yǎng)時(shí)增 殖（圖7B)。在大鼠胰島素啟動(dòng)子（RIP)的控制下表達(dá)來自淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒 (LCMV)的主要糖蛋白（GP)的小鼠發(fā)展糖尿病，如通過增加的血清葡萄糖水平所評(píng)定。類似 地，接受負(fù)載GP肽的DC的RIP-GP發(fā)展疾病。T 〇S〇-/-DC顯示與野生型對照相比在其引發(fā) 疾病的能力方面的損傷，并且接受負(fù)載肽的T〇S〇-/-DC的RIP-GP小鼠比接受負(fù)載肽的野生 型DC的那些小鼠顯著更好地存活（圖7C)。這些結(jié)果一起表明Toso對于樹突細(xì)胞活化T 細(xì)胞并且誘導(dǎo)疾病的能力來說是必要的。
[0231] 實(shí)施例6 :施用可溶性Toso蛋白廢除哮喘疾病量度
[0232] 為了產(chǎn)生可溶性受體，將來自人脾cDNA文庫的Toso的胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行擴(kuò) 增并且然后用源自C末端處的人IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域框內(nèi)克隆至IL2信號(hào)序列下游的 pFuse-hIgGle3-Fc2中，從而允許最佳分泌至培養(yǎng)物上清液中（圖8A-信號(hào)序列由盒指示， 并且Fc結(jié)構(gòu)域用下劃線指示）。此外，F(xiàn)c區(qū)包含幾種突變（E233P/L234V/L235A/AG236/ A327G/A330S/P331S)，所述突變已經(jīng)顯示消除抗體依賴性和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。當(dāng)體內(nèi) 施用時(shí)，這些突變可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的半衰期并且賦予有利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)曲線。將這種 Toso-Fc構(gòu)建體以及空載體對照使用自由式表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染至于400ml的不含血清的培養(yǎng)基 細(xì)胞中的3x 108個(gè)293F細(xì)胞中。兩天之后，收集上清液并且將細(xì)胞重懸浮于另外400ml的 培養(yǎng)基中。在再培養(yǎng)2天之后，收集第二上清液并且將其與第一上清液組合。使用ELISA 來確認(rèn)Toso-Fc可溶性受體的分泌（圖8B)，通過蛋白質(zhì)G色譜法進(jìn)行純化，并且用lOOmM 甘氨酸（pH 2. 3)洗脫。將lml洗脫液級(jí)分收集至60 ill的中和緩沖液（1M Tris pH 9. 5) 中并且通過使用針對Fc區(qū)的抗體蛋白質(zhì)印跡（圖8C i)和考馬斯藍(lán)染色（圖8Cii)進(jìn)行 確認(rèn)。
[0233] 在鼠類脾細(xì)胞上測試所述可溶性受體的結(jié)合。將大約106個(gè)細(xì)胞與指示量的于 100 ii 1 FACS染色緩沖液（PBS+1 % BSA+0. 05% NaN3)中的Toso-Fc在冰上一起孵育2小 時(shí)。將細(xì)胞在FACS緩沖液中進(jìn)行洗滌并且與FITC綴合的抗人FC g F(ab'）2片段在冰上 一起孵育30分鐘，并且在FACS Canto流式細(xì)胞儀上獲得。大約10%的脾細(xì)胞在10 y g下 結(jié)合至所述可溶性受體（圖8D)。純化的Fc蛋白質(zhì)獨(dú)自不顯示與脾細(xì)胞的顯著結(jié)合，從 而表明Toso-Fc結(jié)合是特異性的。進(jìn)一步詳細(xì)的分析指示Toso-Fc最顯著地結(jié)合脾中的 ⑶llc+MHChi成熟樹突細(xì)胞或⑶11C+B220+漿細(xì)胞樣DC (圖8E)。這些數(shù)據(jù)說明Toso-Fc 可溶性受體是功能性的，并且Toso的配體可被表達(dá)于成熟樹突細(xì)胞上。
[0234] 在0VA誘導(dǎo)的哮喘的鼠類模型中評(píng)定了 Toso-Fc施用的治療性效用。疾病是如以 上所描述在略微修改的情況下引發(fā)。將雌性BALB/c小鼠如所描述進(jìn)行治療，除了在霧化 0VA激發(fā)之前腹膜內(nèi)施用50 y g的Toso-Fc持續(xù)連續(xù)3天（圖9A)。通過評(píng)估BALF中的Th2 細(xì)胞因子（圖9B)、BALF中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖9C)來評(píng)定疾病的嚴(yán)重程度。用Toso-Fc預(yù)治 療顯著廢除疾病度量，從而表明施用Toso-Fc可以是哮喘管理中的有用治療模式。
[0235] 實(shí)施例7 :Toso是治療多發(fā)性硬化癥的潛在靶標(biāo)
[0236] 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎（EAE)是用于人MS的有用小鼠模型。這一系統(tǒng)涉及 CD4+TH1/TH17細(xì)胞的抗原依賴性活化和導(dǎo)致脫髓鞘的單核細(xì)胞的血管周圍積聚以及后肢 麻痹。在C57BL/6背景下，EAE被認(rèn)為是慢性進(jìn)行性的，因?yàn)榧膊‰S時(shí)間增加并且是通過注 射髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白肽M0G35-55與完全弗氏佐劑中的百日咳毒素引發(fā)的。每日 從0至5對疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行計(jì)分持續(xù)大約1個(gè)月（其中0 =無疾病病征，1 =跛行的尾 部或后肢虛弱但不是兩者，2 =跋行的尾部和后肢虛弱,3 =部分后肢麻搏,4 =完全后肢麻 搏,5 =垂死狀態(tài)或由于EAE死亡）。
[0237] 在上述M0G誘導(dǎo)的模型中，與野生型對照相比，Toso-/-小鼠被明顯保護(hù)免于EAE 的發(fā)作（圖6)。這些數(shù)據(jù)表明阻斷Toso功能可以代表用于MS的新穎治療策略。
[0238] 實(shí)施例8 :用Toso-Fc治療延遲EAE的發(fā)作
[0239] 這個(gè)實(shí)施例證明用Toso-Fc (SEQ ID N0 :5)治療延遲EAE的發(fā)作。如以上所討論， EAE小鼠模型是用于人MS的有用模型。對于圖23A中描繪的實(shí)驗(yàn)來說，將C57BL/6小鼠在 用誘導(dǎo)疾病的M0G肽進(jìn)行免疫之前用Toso-Fc進(jìn)行預(yù)治療。在免疫之后，將小鼠每周三次 腹膜內(nèi)使用50 y g Toso-Fc (或?qū)τ趯φ招∈髞碚fPBS)進(jìn)行治療持續(xù)30天。如圖23B中 所示，Toso-Fc延遲EAE的進(jìn)展，從而顯示Toso-Fc在多發(fā)性硬化癥中的緩和作用。
[0240] 實(shí)施例9 :T〇S〇減弱先天性抗細(xì)菌免疫應(yīng)答
[0241] 這個(gè)實(shí)施例證明粒細(xì)胞在細(xì)菌感染之后在Toso缺陷的小鼠中早期活化并且對于 控制病原體來說是必要的。Toso缺陷的粒細(xì)胞顯示增強(qiáng)的⑶lib和⑶18表達(dá)并且展示降 低的活化閾值。與這些結(jié)果一致，Toso缺陷的粒細(xì)胞顯示在周圍組織中的炎癥部位處的減 少的效應(yīng)子功能。由于改變的粒細(xì)胞功能，Toso缺陷的小鼠未能清除全身性李斯特氏菌感 染，從而導(dǎo)致Toso缺陷的小鼠的快速死亡。因此，Toso影響粒細(xì)胞的活化閾值和效應(yīng)子功 能，并且因此關(guān)鍵性地減弱先天性抗細(xì)菌免疫應(yīng)答。
[0242] 材料和方法
[0243] 小鼠：短序列是使用源自小鼠Toso cDNA序列的一系列低聚物通過對文庫分離的 基因組DNA片段進(jìn)行測序來獲得。6.5kbp片段是使用Bglll限制消化酶從5'端分離的 并且被用作敲除構(gòu)建體的長臂。650bp短臂是使用源自所述基因的3'端的序列的低聚物 (5, GTGAATACGTGAGCTTGGGCTACC 3' SEQ ID N0 :1 和 5' CAAGTGATGG GGGATTACAGTGAA3' SEQ ID N0 :2)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的。將長臂和短臂以與Toso翻譯正義相同的定向連 接在新霉素抗性盒的任一端上。這種敲除構(gòu)建體位點(diǎn)特異性插入胚胎干（ES)細(xì)胞基因組 DNA中首先使用在Neo的3'端中和在所述短臂的3'端下游的基因組DNA側(cè)翼區(qū)中設(shè)計(jì)的 引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來進(jìn)行篩選。使用三種引物對小鼠進(jìn)行篩選。共用引物 (5'TGTTTAATATGATGTGTCAGGCTG 3'SEQ ID N0:3)位于短臂區(qū)中并且兩種其它引物是來自 Neo 的 3' 區(qū)（5, AGGGCCAGCTCAITCCTCCCACTCAT 3' SEQ ID N0 :4)或通過所述敲除構(gòu)建體 切除的 DNA 的 3' 區(qū)（5'AACTCTGCCCCTGCTCCTTCAITTCC 3'SEQ ID N0:5)。如此從重排的 等位基因獲得的條帶具有400bp并且天然基因的條帶是450bp。將D3ES細(xì)胞用敲除構(gòu)建 體進(jìn)行電穿孔并且在存在SOOyg/ml G418的情況下生長。然后將陽性ES克隆注射至源自 E3. 5 C57/BL6的胚泡中。針對重排等位基因的存在篩選嵌合子代并且將其與C57BL/6背景 回交。0)1 ltT^小鼠源自C57BL/6背景的Jackson。
[0244] 骨髓嵌合小鼠：將小鼠用1050rad進(jìn)行致死輻射處理并且用107⑶45. 1WT骨髓細(xì) 胞或107CD45. 2T0S0-A骨髓細(xì)胞或5x 106CD45. 1WT骨髓細(xì)胞加5x 106CD45. 2T0S0+骨髓細(xì) 胞進(jìn)行重構(gòu)。將用于這一研究的所有小鼠維持在C57BL/6遺傳背景上。所有實(shí)驗(yàn)在單個(gè)通 風(fēng)籠中進(jìn)行。
[0245] 李斯特氏菌感染：將李斯特氏菌生長在心臟浸液瓊脂中。如果未不同地指示，那么 將小鼠用2xl0 4CFU靜脈內(nèi)感染。
[0246] 在細(xì)胞因子刺激之后的粒細(xì)胞活化和FACS分析：如所描述進(jìn)行FACS染色和分析 (Lang, P. A.,等人 Aggravation of viral hepatitis by platelet-derived serotonin. Nat Med 14, 756-761 (2008)，其特此出于所有目的并且特別是出于涉及FACS染色和分析 的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入）。重組小鼠TNF-a來自R+D系統(tǒng)，LPS來自 Sigma并且GM-CSF是從X630細(xì)胞上清液獲得。在所指示的濃度下使用來自Sigma的fMLP。 對于活化研究，將10 U 1血液在含有不同細(xì)胞因子還有抗Grl (eBiosciences)、二氫羅丹明 (八161丨8)和〇)1113(613；[08(^611068，如果指不）的100111培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育。在孵育30分 鐘或45分鐘（如果未不同地指示在37°C )之后，將粒細(xì)胞固定并且使用紅細(xì)胞溶解緩沖 液（BD Biociences)溶解紅細(xì)胞。對于⑶11a、⑶lib和⑶18的天然表達(dá)來說，將血液用 2 %福爾馬林固定10分鐘，并且然后用抗Grl和相應(yīng)抗體在4°C下染色。Toso抗體是根據(jù) Nguyen 等人，（Blood，2011年 7 月 21 日，118(3) :598-608)產(chǎn)生的。
[0247] 對于引發(fā)研究來說，將粒細(xì)胞與不同細(xì)胞因子一起孵育30分鐘，接著fMLP孵育15 分鐘。
[0248] 組織學(xué)：如 Lang，K. S.,等人 Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. J Clin Invest 116,2456-2463(2006) 中所描述在急速冷凍或福爾馬林固定的組織上進(jìn)行組織學(xué)分析，所述文獻(xiàn)特此出于所有目 的并且特別是出于涉及組織學(xué)分析的所有教導(dǎo)的目的而以引用的方式整體并入。
[0249] MP0 ELISA :MP0 ELISA源自Hycult biotech并且根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。
[0250] 通過定量RT-PCR進(jìn)行的mRNA基因序型分析：使用Trizol進(jìn)行RNA提取和cDNA 合成。使用來自Applied Biosystems的Toso(Faim3)試劑盒Mm01302388_ml進(jìn)行的基因 表達(dá)分析。對于分析，將所有靶基因的表達(dá)水平針對18sRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（ACt)?；虮磉_(dá) 值被表示為ACt。
[0251] 統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)被表示為平均值土S. E. M。使用學(xué)生t檢驗(yàn)對兩個(gè)不同組之間的統(tǒng) 計(jì)學(xué)上有意義的差異進(jìn)行分析。如果未不同地提及，那么雙向未配對。使用單向AN0VA與 另外Bonferroni或Dunnett測試來進(jìn)行包括幾組的分析。使用雙向AN0VA(重復(fù)測量值） 來計(jì)算多個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)實(shí)驗(yàn)組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的差異。P值< 〇. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上 有意義的。
[0252] T0S0在粒細(xì)胞上表達(dá)但對于白細(xì)胞分化來說不是必要的
[0253] 為了分析Toso在體內(nèi)的功能相關(guān)性，本發(fā)明人如材料和方法中所描述產(chǎn)生了一 種Toso缺陷的小鼠。將Toso缺陷的小鼠與C57BL/6背景回交并且然后針對Toso RNA的 表達(dá)進(jìn)行分析。來自Tos〇f小鼠的RT-PCR分析顯示缺乏Toso,從而表明Toso確實(shí)不在 TOSO+小鼠中表達(dá)（圖12a)。接著使用Toso特異性抗體在淋巴細(xì)胞上對Toso蛋白進(jìn)行分 析。據(jù)發(fā)現(xiàn)與出版的文獻(xiàn)一致，天然B細(xì)胞而不是T細(xì)胞表達(dá)Toso (圖12b)。接著，本發(fā)明 人分析了 Toso在粒細(xì)胞上的表達(dá)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)血液和脾兩者中的粒細(xì)胞在細(xì)胞表面上 表達(dá)Toso (圖12c)。為了分析Toso是否影響淋巴細(xì)胞或粒細(xì)胞發(fā)育，本發(fā)明人對T〇S〇+小 鼠的外周血中的這些細(xì)胞群體進(jìn)行了分析。TOSO+小鼠未顯示血液粒細(xì)胞中的任何顯著差 異（圖12d)。在Toso缺陷的小鼠中存在血液淋巴細(xì)胞數(shù)目的稍微顯著減少，這被歸因于減 少的B細(xì)胞數(shù)目（圖12d和e)。T 〇S〇+小鼠的脾大小是正常的并且脾淋巴細(xì)胞顯示正常 分布（圖12f和g)，從而表明Toso對免疫細(xì)胞的發(fā)育不存在主要作用。
[0254] 3.活化閾值在T0S0缺陷小鼠的粒細(xì)胞中被降低
[0255] 將來自Toso+小鼠和野生型小鼠的粒細(xì)胞用粒細(xì)胞活化劑N-甲酰蛋氨酰-亮氨 酰-苯丙氨酸（fMLP)進(jìn)行活化。fMLP活化粒細(xì)胞上的fMLP受體，其模擬病原體接觸。在 預(yù)活化的粒細(xì)胞中，與fMLP相接觸導(dǎo)致活性氧物種（R0S)的強(qiáng)烈產(chǎn)生和脫粒。相比之下， 未通過細(xì)胞因子預(yù)活化的粒細(xì)胞顯示對fMLP的有限應(yīng)答。當(dāng)通過R0S的產(chǎn)生和脫粒進(jìn)行 分析時(shí)，僅10 %的野生型粒細(xì)胞在用fMLP處理之后被活化（圖13a)。相比之下，用fMLP 處理活化50%的TOSO+粒細(xì)胞（圖13a)。
[0256] 接著，在用TNF- a處理之后對TOSO+粒細(xì)胞的R0S產(chǎn)生和脫粒進(jìn)行分析，TNF- a 通常僅引發(fā)粒細(xì)胞，但不會(huì)導(dǎo)致R0S產(chǎn)生。用TNF-a處理導(dǎo)致WT粒細(xì)胞中實(shí)際上不存在 的R0S產(chǎn)生（圖13b)。相比之下，TOSO+粒細(xì)胞在TNF-a處理之后顯示顯著R0S產(chǎn)生/脫 粒的粒細(xì)胞，從而表明Toso影響粒細(xì)胞活化的閾值（圖13b)。用LPS和GM-CSF處理（其 也已知引發(fā)粒細(xì)胞）既未活化野生型粒細(xì)胞中的R0S也未活化TOSO+粒細(xì)胞中的R0S (圖 13c和d)。這些結(jié)果顯示Tosof粒細(xì)胞對于fMLP和TNF- a兩者來說均具有降低的活化閾 值。用GM-CSF或LPS連同fMLP共處理使WT粒細(xì)胞中產(chǎn)生R0S的野生型粒細(xì)胞的百分比 增加10倍（圖13e)。產(chǎn)生R0S的粒細(xì)胞的百分比在LPS或GM-CSF引發(fā)的fMLP共處理的 Tosof粒細(xì)胞中也增加（圖13e)。這些數(shù)據(jù)顯示Tosof粒細(xì)胞還在用GM-CSF或LPS引發(fā) 的粒細(xì)胞的情況下展示降低的活化閾值。這表明T 〇S〇+粒細(xì)胞一般具有降低的活化閾值。
[0257] 細(xì)胞應(yīng)激可活化粒細(xì)胞，其可能顯著導(dǎo)致（自身）炎性疾病。為了分析T〇S〇+粒 細(xì)胞是否更易于這種活化，將野生型（WT)粒細(xì)胞和TOSO+粒細(xì)胞在不同溫度下進(jìn)行孵育。 溫度降低誘導(dǎo)30%的T 〇S〇+粒細(xì)胞中的脫粒，這是野生型粒細(xì)胞未顯示任何應(yīng)答的一種 條件（圖13f)?；罨撝档牟町惪赏ㄟ^WT粒細(xì)胞與TOSO+粒細(xì)胞之間的壽命差異來解 釋。粒細(xì)胞通常具有非常有限的壽命，其通過在體外培養(yǎng)之后24小時(shí)內(nèi)的自發(fā)性細(xì)胞凋亡 加強(qiáng)。粒細(xì)胞活化通常與延長的壽命和減少的細(xì)胞凋亡相關(guān)。然而，在T 〇S〇+粒細(xì)胞與WT 粒細(xì)胞之間不存在自發(fā)性細(xì)胞凋亡的差異（圖17)。用GM-CSF處理減少粒細(xì)胞中的細(xì)胞凋 亡，這是不依賴于Toso的一個(gè)過程（圖17)。數(shù)據(jù)證明當(dāng)遇到炎性信號(hào)或應(yīng)激信號(hào)時(shí)，Toso 蛋白的表達(dá)保持粒細(xì)胞處于靜止非活化狀態(tài)。
[0258] 粒細(xì)胞中的活化閾值被內(nèi)在地調(diào)控
[0259] 當(dāng)與野生型粒細(xì)胞相比時(shí)，源自T〇S〇+小鼠的粒細(xì)胞針對分化成效應(yīng)子表型具有 降低的閾值。除其內(nèi)在調(diào)控之外，粒細(xì)胞活化受幾種外在體液因素（像：細(xì)胞因子、抗體、補(bǔ) 體因素）以及周圍細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或血小板的活化狀態(tài)影響。為了得到關(guān) 于源自T 〇S〇+小鼠的粒細(xì)胞的降低的活化閾值的機(jī)制的更多認(rèn)識(shí)，對混合的骨髓嵌合體進(jìn) 行了分析。將C57BL/6小鼠進(jìn)行輻射處理并且然后用WKTosof或混合的WT/Toso^(比例 1 : 1)骨髓進(jìn)行重構(gòu)。WT骨髓可以通過CD45. 1同種型的表達(dá)在嵌合小鼠中被單獨(dú)地追蹤 (圖14a)。這種混合的骨髓嵌合體允許對源自同一小鼠的WT粒細(xì)胞和Tosc^粒細(xì)胞的活 化閾值的分析?；罨撝抵械乃^察到的差異（尤其是混合的嵌合小鼠中的那些）將表明 Toso內(nèi)在地調(diào)控粒細(xì)胞的活化。在骨髓移植之后30天對骨髓嵌合體的分析顯示T〇S〇+粒 細(xì)胞以與WT粒細(xì)胞相同的數(shù)目重構(gòu)，從而再次表明Toso在粒細(xì)胞的發(fā)育中不存在主要作 用（圖14b)。在混合的嵌合體中，總粒細(xì)胞（WT和T 〇S〇+)是與接受來自單一小鼠品系的 骨髓的小鼠可比的（圖14b)。在混合的骨髓嵌合體的競爭模式方面不存在WT粒細(xì)胞對比 TOSO+粒細(xì)胞的顯著優(yōu)點(diǎn)（圖14b)。
[0260] 接著，對嵌合小鼠中WT粒細(xì)胞對比TOSO+粒細(xì)胞的活化閾值進(jìn)行分析。用fMLP 處理在接受骨髓移植的小鼠中活化更多粒細(xì)胞（圖14a對比圖13a)，這可能是由于接受骨 髓移植的小鼠中的不同細(xì)胞因子水平（但不限于這一潛在機(jī)制）。與源自T 〇S〇+小鼠的數(shù) 據(jù)可比，用TOSO+骨髓重構(gòu)的C57BL/6小鼠顯示降低的活化閾值（圖14c)。這也在混合的 骨髓嵌合體中見到（圖14c)。這表明Toso內(nèi)在地影響粒細(xì)胞的活化閾值。
[0261] 為了確定Toso是否另外影響效應(yīng)子功能的強(qiáng)度，測定了活化的WT粒細(xì)胞和活化 的TOSO+粒細(xì)胞的R0S產(chǎn)生量?；罨腤T粒細(xì)胞顯示比活化的TOSO+粒細(xì)胞顯著更多的 R0S產(chǎn)生（圖14d)。這些數(shù)據(jù)顯示Toso增強(qiáng)了粒細(xì)胞的活化閾值。一旦粒細(xì)胞被活化，它 們就在存在Toso的情況下顯示增強(qiáng)的效應(yīng)子功能。
[0262] Toso缺陷的小鼠中李斯特氏菌的受損控制
[0263] 評(píng)定了粒細(xì)胞中Toso的缺乏對體內(nèi)細(xì)菌控制的作用。用革蘭氏陽性單核細(xì)胞增 生李斯特氏菌感染特別強(qiáng)烈地依賴于粒細(xì)胞的快速活化。用亞致死劑量的李斯特氏菌感染 導(dǎo)致TOSO+小鼠中增加的死亡（圖15a)，從而表明Toso對于細(xì)菌的控制來說是必不可少 的。在李斯特氏菌接種之后兩天，TOSO+小鼠中的血液粒細(xì)胞顯示增強(qiáng)的脫粒和R0S產(chǎn)生 (圖15b)。這與T 〇S〇+小鼠的血清中髓過氧化物酶的增強(qiáng)釋放相關(guān)（圖15c)。
[0264] 一個(gè)可能性是Toso+粒細(xì)胞在血液中被快速活化，但可能未能在受感染的器官 中發(fā)揮其充分發(fā)展的效應(yīng)子功能。為了對這種假設(shè)進(jìn)行分析，將受感染的野生型小鼠或 Tosof小鼠用2x 106CFU的李斯特氏菌感染并且在20小時(shí)之后對組織學(xué)進(jìn)行分析。在WT 小鼠和TOSO+小鼠兩者中均發(fā)現(xiàn)肉芽腫（圖15d)，從而表明Toso未參與肉芽腫形成。針 對李斯特氏菌染色顯示肉芽腫中增強(qiáng)的細(xì)菌（圖15d)，從而表明肉芽腫中的效應(yīng)子功能由 Toso實(shí)現(xiàn)。
[0265] 對器官中感染后一天粒細(xì)胞的分析顯示減少的效應(yīng)子功能（圖15e)并且李斯特 氏菌生長在T 〇S〇+小鼠的肝和脾中顯著增強(qiáng)（圖15f)。這與李斯特氏菌散播至血液中相 關(guān)（圖18)并且最終還散播至腦，這可能是感染李斯特氏菌的T 〇S〇+小鼠的死亡原因（圖 15f)。這些數(shù)據(jù)顯示T〇S〇+小鼠顯示出對李斯特氏菌感染增強(qiáng)的敏感性。這與血液中增 強(qiáng)的粒細(xì)胞活化、肝和脾中減少的效應(yīng)子功能以及李斯特氏菌散播至腦中相關(guān)。
[0266] Toso調(diào)控粒細(xì)胞上的表面CDllb和CD18表達(dá)
[0267] Toso缺陷的粒細(xì)胞展示在血液中增強(qiáng)的活化但在組織中減少的粒細(xì)胞效應(yīng)子功 能。這種表型將適合整聯(lián)蛋白的不同表達(dá)和/或不同信號(hào)傳導(dǎo)。⑶11a、⑶lib和⑶18是 對于粒細(xì)胞活化來說重要的整聯(lián)蛋白。因此在WT粒細(xì)胞和Tosc^粒細(xì)胞中比較⑶11a、 ⑶lib和⑶18的表達(dá)。存在⑶lib和⑶18在天然Toso缺陷的粒細(xì)胞上的顯著增強(qiáng)的表達(dá) (圖16a)。⑶11a的表達(dá)在WT粒細(xì)胞與Tosc^粒細(xì)胞之間沒有顯著不同（圖16a)。在用 GM-CSF或LPS活化之后，⑶lib表達(dá)在WT粒細(xì)胞和Tosc^粒細(xì)胞兩者中上調(diào)，然而表達(dá)差 異隨著增加LPS和GM-CSF濃度而減少（圖16b)。LPS和GM-CSF在fMLP之后降低粒細(xì)胞 的活化閾值。因此，WT粒細(xì)胞與T〇S〇+粒細(xì)胞之間CDllb表達(dá)的差異可能可以解釋不不同 活化閾值。為了觀察CDllb表達(dá)是否確實(shí)參與活化閾值的調(diào)控，本發(fā)明人對CDllb在系統(tǒng) 中的作用進(jìn)行了分析。如所預(yù)期，缺乏⑶lib導(dǎo)致減少的⑶18表達(dá)（圖16c)。Cdllb+粒 細(xì)胞顯示在用fMLP連同GM-CSF處理之后減少的活化和ROS產(chǎn)生（圖16d)。這些數(shù)據(jù)顯示 Toso-/粒細(xì)胞顯示增強(qiáng)的⑶lib (影響粒細(xì)胞的活化閾值的一種整聯(lián)蛋白）基礎(chǔ)表達(dá)。這 些發(fā)現(xiàn)將T〇S〇+粒細(xì)胞中增強(qiáng)的⑶lib表達(dá)與在不存在Toso的情況下降低的活化閾值相 聯(lián)系。
[0268] 實(shí)施例10 :T〇S〇在葡萄糖耐量和胰島素敏感性中起作用
[0269] 這個(gè)實(shí)施例證明Toso在葡萄糖耐量和胰島素敏感性中起作用。圖19示出 Toso 7小鼠在開始商脂肪飲食之后具有正常食物攝取和體重。對于圖19A中的實(shí)驗(yàn)，自開 始高脂肪飲食（開始于5周大）監(jiān)測WT和T 〇S〇+雄性小鼠的體重。對于圖19B，在高脂肪 飲食后14周測量食物攝取。食物攝取通過單獨(dú)家養(yǎng)的動(dòng)物測量，其中在2天周期的開始和 結(jié)束時(shí)測定食物重量的差異。
[0270] 如圖20中所示，在進(jìn)行高脂肪飲食持續(xù)10-13周之后，與野生型小鼠相比， TOSO+小鼠具有增強(qiáng)的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。用自5周大開始以高脂肪飲食喂養(yǎng) 10-13周的野生型小鼠和T 〇S〇+小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量測試（注意使用雌性小鼠組獲得類似 結(jié)果）。用自5周大開始以高脂肪飲食喂養(yǎng)10-13周的野生型小鼠和TOSO+小鼠進(jìn)行胰島 素耐量測試。
[0271] 在9 :30a. m.與11 :30a. m.之間對禁食過夜的動(dòng)物進(jìn)行葡萄糖耐量測試，使用腹 膜內(nèi)（1.?.)注射的以/1^體重的葡萄糖劑量和在注射之后0、15、30、60和120分鐘時(shí)的葡 萄糖水平的測量值。
[0272] 使用在0. 5U/kg體重劑量下的人常規(guī)胰島素（Humalog)在9 :30a. m.與11 :30a. m.之間對禁食過夜的動(dòng)物或在1 :00p. m與3p. m.之間對禁食4. 5小時(shí)的動(dòng)物進(jìn)行胰島素 耐量測試，并且在注射之后0、15、30、45和60分鐘時(shí)測量血液葡萄糖水平。
[0273] 與喂以高脂肪飲食的小鼠相比，圖21示出當(dāng)兩組小鼠均喂以常規(guī)食物持續(xù)10-13 周時(shí)，TOSO+具有與野生型小鼠類似的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。用喂以常規(guī)飲食的野 生型和T 〇S〇+雄性小鼠（15-18周大）進(jìn)行葡萄糖耐量測試。用喂以常規(guī)飲食的野生型 和T〇S〇+雄性小鼠（15-18周大）進(jìn)行胰島素耐量測試。圖21表明，不受理論限制，Toso 缺陷的保護(hù)作用要求高脂肪飲食。在9 :30a.m.與11 :30a.m.之間對禁食過夜的動(dòng)物進(jìn)行 葡萄糖耐量測試，使用腹膜內(nèi)（i.P.)注射的lg/kg體重的葡萄糖劑量和在注射之后0、15、 30、60和120分鐘時(shí)的葡萄糖水平的測量值。使用在0. 5U/kg體重劑量下的人常規(guī)胰島素 (Humalog)在9 :30a. m?與11 :30a. m.之間對禁食過夜的動(dòng)物或在1 :00p. m與3p. m?之間 對禁食4. 5小時(shí)的動(dòng)物進(jìn)行胰島素耐量測試，并且在注射之后0、15、30、45和60分鐘時(shí)測 量血液葡萄糖水平。
[0274] 實(shí)施例11 :用可溶性Toso治療改善用高脂肪飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠中的葡萄糖 耐量
[0275] 這個(gè)實(shí)施例證明用可溶性Toso蛋白（SEQ ID N0 :5)治療改善用高脂肪飲食喂養(yǎng) 14周的野生型小鼠中的葡萄糖耐量。圖22A示出來自在可溶性Toso治療之前的野生型雄 性小鼠的數(shù)據(jù)。用自5周大開始以高脂肪飲食（60%脂肪卡路里）喂養(yǎng)14周的禁食野生 型小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量測試。圖22B示出來自在可溶性Toso治療之后的野生型小鼠的數(shù) 據(jù)。將小鼠（高脂肪飲食持續(xù)14周）在第0、2、5、7、9和12天用可溶性Toso-hlgG在腹 膜內(nèi)50 yg的劑量下進(jìn)行治療。在禁食過夜之后第14天進(jìn)行葡萄糖耐量測試。在可溶性 Toso蛋白治療過程中，將小鼠連續(xù)喂以高脂肪飲食。在9 :30a.m.與11 :30a.m.之間對禁 食過夜的動(dòng)物進(jìn)行葡萄糖耐量測試，使用腹膜內(nèi)（i.P.)注射的lg/kg體重的葡萄糖劑量和 在注射之后0、15、30、60和120分鐘時(shí)的葡萄糖水平的測量值。
[0276] 實(shí)施例12 :分泌人和小鼠Toso-Fc的穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生
[0277] 使用脂質(zhì)體（Lipofectamine) 2000 將編碼 cDNA 的 Toso-Fc 轉(zhuǎn)染至粘附 HEK293T 細(xì)胞中。在補(bǔ)充有10%胎牛血清和〇. 2mg/ml博萊霉素（Zeocin)的DMEM培養(yǎng)基中選擇單 個(gè)克隆。將高表達(dá)克隆擴(kuò)大至15cm培養(yǎng)皿，并且在匯合時(shí)1 : 2分裂。在每次分裂，將穩(wěn) 定的轉(zhuǎn)染株在具有連續(xù)更多無血清自由式培養(yǎng)基和連續(xù)更少DMEM/FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)以便 針對無血清生長調(diào)理細(xì)胞。（例如在分割1時(shí)-90% DMEM/FBS 10%自由式一在分割10時(shí) 100%自由式）。將調(diào)理成在無血清培養(yǎng)基中生長的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株在無生存力損失的情況下生 長在定軌振蕩器孵育箱（37°C，8% C02，125rpm)中的懸浮液中。
[0278] 本說明書在目前描述的技術(shù)的實(shí)施例方面中提供方法、系統(tǒng)和/或結(jié)構(gòu)以及其用 途的完整描述。雖然所述技術(shù)的多種方面已經(jīng)如上在一定程度的具體性上或參考一個(gè)或多 個(gè)單獨(dú)方面作了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離此技術(shù)的精神或范圍的情況下能夠?qū)?所公開的方面做出大量的改變。因?yàn)榭梢栽诓幻撾x目前描述的技術(shù)的精神和范圍的情況下 產(chǎn)生許多方面，所以適當(dāng)?shù)姆秶嬖谟谙挛乃降臋?quán)利要求書中。因此涵蓋其它方面。此 夕卜，應(yīng)理解的是，除非另外明確地主張或主張語言本身需要特定的順序，否則任何操作可以 以任何順序進(jìn)行。希望包含于以上描述和在附圖中示出的所有事物只解釋為特定方面的說 明性的并且不限于所示的實(shí)施方案。除非另外從上下文清晰可見或明確說明，否則本文中 提供的任何濃度值通常就混合物值或百分?jǐn)?shù)給出，而不考慮添加混合物的特定組分時(shí)或之 后發(fā)生的任何轉(zhuǎn)化。如果尚未明確地并入本文中，那么在本公開中提及的所有公開的參考 文獻(xiàn)和專利文件均出于所有目的以引用的方式整體并入本文。如在以下權(quán)利要求書中所定 義，可以在不脫離本技術(shù)的基本要素的情況下進(jìn)行細(xì)節(jié)或結(jié)構(gòu)上的改變。
【權(quán)利要求】
1. 一種治療受試者中的自身免疫性病癥的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可 溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸 殘基 18-253。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID NO :5或6的 氨基酸序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO :5或6具 有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
5. 如權(quán)利要求1至4所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚體。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述多聚體包含6個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含根據(jù) SEQ ID NO :6 的序列。
7. 如權(quán)利要求1至6所述的方法，其中所述自身免疫性病癥是選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多 發(fā)性硬化癥、狼瘡和I型糖尿病的成員。
8. -種治療受試者中的II型糖尿病或哮喘的方法，所述方法包括用包含治療有效量 的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受試者。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基酸 殘基 18-253。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID NO :5或6 的氨基酸序列。
11. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO :5或6具 有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
12. 如權(quán)利要求8-11所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚體。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述多聚體包含6個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含根據(jù) SEQ ID NO :6 的序列。
14. 一種治療受試者中的1型糖尿病、2型糖尿病、哮喘、多發(fā)性硬化癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎的方法，所述方法包括向所述受試者施用具有SEQ ID NO :5或6的氨基酸序列或其片段 或缺失變體的可溶性多肽。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者中的Toso活性被降低。
16. 如權(quán)利要求14-15所述的方法，其中所述可溶性多肽包含SEQ ID NO :5或6的缺 失變體。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述缺失變體包含選自：SEQ ID NO. 9-24的成員。
18. -種治療受試者中的癌癥、過敏癥、C0PD、高-IgM綜合征或中性白細(xì)胞增多癥相關(guān) 的病癥的方法，所述方法包括用包含治療有效量的可溶性Toso蛋白的組合物治療所述受 試者。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含SEQ ID NO :7的氨基 酸殘基18-253。
20. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含根據(jù)SEQ ID NO :5或6 的氨基酸序列。
21. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白包含與SEQ ID NO :5或6具 有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
22. 如權(quán)利要求18-21所述的方法，其中所述可溶性Toso蛋白是多聚體。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多聚體包含6個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含根據(jù) SEQ ID NO :6 的序列。
24. 如權(quán)利要求18-23所述的方法，其中所述自身免疫性病癥是選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 多發(fā)性硬化癥、狼瘡和I型糖尿病的成員。
25. -種抑制受試者中的Toso活性的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效 量的可溶性Toso多肽。 26?-種抑制Toso活性的方法，所述方法包括將可溶性Toso多肽應(yīng)用至包含膜結(jié)合 Toso受體的細(xì)胞。
27. -種組合物，其包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的多肽。
28. 如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述組合物抑制Toso活性。
29. 如權(quán)利要求27-28所述的組合物，其中所述多肽是多聚體。
30. 如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述多聚體包含6個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含根 據(jù)SEQ ID NO :6的序列。
31. -種分離的核酸，其編碼如權(quán)利要求27-30所述的多肽。
32. -種宿主細(xì)胞，其包含編碼如權(quán)利要求27-30所述的多肽的核酸。
33. -種包含可溶性多肽的組合物，其中所述可溶性多肽與SEQ ID NO :5或SEQ ID NO: 6具有至少90 %序列同一性。
34. 如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述可溶性多肽抑制Toso活性。
35. 如權(quán)利要求33-34所述的組合物，其中所述可溶性多肽是多聚體。
36. 如權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述多聚體包含6個(gè)單體，其中每個(gè)單體包含根 據(jù)SEQ ID NO :6的序列。
37. -種分離的核酸，其編碼如權(quán)利要求33-36所述的多肽。
38. -種宿主細(xì)胞，其包含編碼如權(quán)利要求33-36所述的多肽的核酸。
39. -種融合蛋白，其包含人Toso蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域、Fc區(qū)和多聚化標(biāo)簽。
40. 如權(quán)利要求39所述的融合蛋白，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域包含人Toso蛋白的氨基酸 18-253。
41. 如權(quán)利要求39-40所述的融合蛋白，其中所述多聚化標(biāo)簽包含SEQ ID NO :4。
42. 如權(quán)利要求39-41所述的融合蛋白，其中所述Fc區(qū)包含SEQ ID NO :3。
43. -種分離的核酸，其編碼如權(quán)利要求39-42所述的融合蛋白。
44. 一種宿主細(xì)胞，其包含編碼如權(quán)利要求39-42所述的多肽的核酸。
45. -種分離的可溶性多肽，其包含與具有選自由SEQ ID NO. 1-24組成的組的氨基酸 序列的多肽具有至少90 %序列同一性的氨基酸序列。
46. -種產(chǎn)生如權(quán)利要求45所述的多肽的方法，所述方法包括提供包含編碼所述多肽 的核酸的細(xì)胞，其中將所述細(xì)胞在適于表達(dá)所述多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
47. -種核酸，其編碼如權(quán)利要求45所述的多肽。
48. -種產(chǎn)生根據(jù)SEQ ID NO :5或6的多肽的方法，所述方法包括提供包含編碼所述 多肽的核酸的細(xì)胞，其中將所述細(xì)胞在適于表達(dá)所述多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
49. 一種核酸，其編碼根據(jù)SEQ ID NO :5或6的多肽。
50. -種宿主細(xì)胞，其包含編碼根據(jù)SEQ ID NO :5或6的多肽的核酸。
【文檔編號(hào)】A61P19/02GK104394880SQ201380023772
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月16日
【發(fā)明者】M.W.圖舍, T.W.馬克, P.S.奧哈施, P.朗, K.朗, D.布倫納, G.林 申請人:大學(xué)保健網(wǎng)絡(luò)