通過聯(lián)合治療的半胱天冬酶-3酶原激活的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡例如癌細(xì)胞死亡的組合物和方法。公開了化合物的結(jié)合物以及相關(guān)的使用方法，包括化合物用于治療癌癥以及選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的用途。與其他化合物以及化合物的結(jié)合物相比，所公開的藥物結(jié)合物具有較低的神經(jīng)毒性作用。
【專利說明】通過聯(lián)合治療的半胱天冬酶-3酶原激活
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求依照35U.S.C. § 119(e)于2012年3月6日提交的第61/607, 098號 美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，該臨時專利申請通過引證方式納入本申請。

【背景技術(shù)】
[0003]細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡在所有多細(xì)胞生物的發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)過程中起著重 要作用。癌癥的常見標(biāo)志是抵抗自然的細(xì)胞凋亡信號。根據(jù)癌癥類型，這種抵抗通常是由于 細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白的上調(diào)或下調(diào)，或者是由于編碼這些蛋白的基因中的突變。 這些變化在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑和外源性細(xì)胞凋亡途徑中均有發(fā)生，其中內(nèi)源性凋亡途徑 通過線粒體和半胱天冬酶-9匯集，外源性凋亡途徑涉及死亡受體與半胱天冬酶_8的作用。 例如，已經(jīng)在癌癥中觀察到了蛋白質(zhì)--如p53、Bim、Bax、Apaf-1、FLIP和許多其他蛋白 質(zhì)--的適當(dāng)水平的改變。這些改變可導(dǎo)致有缺陷的細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，其中是上游的促 細(xì)胞凋亡信號沒有被充分地傳遞以激活執(zhí)行者半胱天冬酶--半胱天冬酶_3和半胱天冬 酶-7。
[0004] 由于大多數(shù)細(xì)胞凋亡途徑最終都涉及半胱天冬酶-3酶原的激活，上游的基因異 ?？捎行У?打斷"細(xì)胞凋亡線路，因此，這些細(xì)胞非典型地增殖。鑒于細(xì)胞凋亡在癌癥中 的重要作用，致力于開發(fā)靶向細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的特異蛋白質(zhì)的治療劑。例如，與級聯(lián)成 員諸如P53和Bel家族中的蛋白質(zhì)結(jié)合的肽或小分子結(jié)合劑，或者與細(xì)胞凋亡抑制劑（IAP) 蛋白質(zhì)家族結(jié)合的肽或小分子結(jié)合劑，具有促細(xì)胞凋亡活性，促進(jìn)Apaf-1寡聚的化合物也 同樣具有促細(xì)胞凋亡活性。然而，因?yàn)檫@些化合物靶向細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的早期（或中 間到高）位置，因此，具有影響這些成員的下游蛋白質(zhì)的突變的癌癥仍然可抵抗這些化合 物的可能的有益效果。
[0005] 對治療目的有利的是識別直接激活細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中遠(yuǎn)端下游（far downstream)的促細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的小分子。這種方法可涉及級聯(lián)反應(yīng)中相當(dāng)較低的位置， 因此，使得甚至能夠殺死那些具有影響上游細(xì)胞凋亡機(jī)器的突變的細(xì)胞。此外，如果促細(xì)胞 凋亡蛋白質(zhì)在癌細(xì)胞中被上調(diào)或者以增加的水平存在于癌細(xì)胞中，則這樣的治療策略會具 有較高的成功可能性。因此，靶向細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)物蛋白--半胱天冬酶_3酶原-- 的小分子的識別，將顯著有助于目前的癌癥治療。
[0006]半胱天冬酶-3酶原到半胱天冬酶-3的轉(zhuǎn)化或激活導(dǎo)致產(chǎn)生活性"執(zhí)行者"半胱天 冬酶形式，所述活性"執(zhí)行者"半胱天冬酶形式隨后催化眾多蛋白底物的水解?；罨陌腚?天冬酶-3是異源二聚體的同源二聚體，并且是通過半胱天冬酶_3酶原的蛋白酶解產(chǎn)生的。 在體內(nèi)，這種蛋白酶解激活通常通過半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的作用而發(fā)生。為確 保酶原不被過早地激活，半胱天冬酶-3酶原具有12個氨基酸"保險栓（safety catch) "， 其阻止進(jìn)入蛋白酶解的ETD位點(diǎn)（氨基酸序列，ile-glu-thr-asp)。這種保險栓使得半胱 天冬酶-3酶原能夠抵抗自身催化激活和由半胱天冬酶_9導(dǎo)致的蛋白酶解。突變研究表明 三個連續(xù)的天冬氨酸殘基似乎是該保險栓的關(guān)鍵成分。保險栓的位置對pH敏感，因此，一 旦發(fā)生細(xì)胞酸化（如在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生），保險栓被認(rèn)為允許進(jìn)入蛋白酶解的位點(diǎn)，活 性半胱天冬酶-3可通過半胱天冬酶-9的作用或經(jīng)由自身激活機(jī)制而產(chǎn)生。
[0007] 在某些癌癥中，半胱天冬酶-3酶原的水平相對于正常組織是提高的。對來自20 位結(jié)腸癌患者的原代分離物（primary isolates)的研究顯示，平均而言，相對于鄰近的非 癌性組織，半胱天冬酶-3酶原在這些分離物中被上調(diào)了六倍。此外，在某些神經(jīng)母細(xì)胞瘤、 淋巴瘤和肝癌中，半胱天冬酶-3酶原被上調(diào)。而且，在被國立癌癥研究所（NCI)開發(fā)治療 項(xiàng)目（Developmental Therapeutics Program)用于癌癥篩選的60個細(xì)胞系組（cell-line panel)中進(jìn)行了半胱天冬酶-3酶原水平的系統(tǒng)性評估，這揭示了某些肺癌、黑素瘤、腎癌 和乳腺癌顯示顯著升高的半胱天冬酶-3酶原表達(dá)水平。
[0008] 由于活性半胱天冬酶-3在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡中的作用，在某些癌性細(xì)胞類型中相對 高水平的半胱天冬酶-3酶原以及令人感興趣的保險栓-介導(dǎo)的半胱天冬酶_3酶原自身激 活的抑制，直接修飾半胱天冬酶-3酶原的小分子可在靶向癌癥治療中具有很大應(yīng)用。
[0009] 聯(lián)合治療已經(jīng)成為治療癌癥患者的標(biāo)準(zhǔn)。聯(lián)合治療藥物雞尾酒療法的目的是在化 學(xué)治療劑之間實(shí)現(xiàn)協(xié)同或加和效果，借此有助于縮短治療時間，降低毒性并增加患者存活 率。作用于單一生化途徑的藥物對協(xié)同或增強(qiáng)作用而言是特別強(qiáng)有力的候選者，因?yàn)椋鼈?可以模擬"合成致死"基因組合（"synthetic lethal" genetic combinations)。例如， 聚（ADP-核糖）聚合酶-l(PARP-l)(-種促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的酶）的抑制劑，有效地與DNA 損傷劑協(xié)同作用，如在細(xì)胞培養(yǎng)物、動物模型和人體臨床試驗(yàn)中所證明的。然而，仍需要更 加有效的療法用于治療多種形式的癌癥，抗癌藥物的新的協(xié)同組合將有助于該訴求。因此， 需要識別新的細(xì)胞毒性劑，它們在殺死癌細(xì)胞方面是有效的，同時還保護(hù)正常宿主組織免 受細(xì)胞毒性劑的不期望的毒性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明主要提供化合物、組合物以及治療處理的方法。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明 適用于多種癌癥疾病和癌細(xì)胞類型，如乳腺癌、淋巴瘤、腎癌、黑素瘤、白血病、神經(jīng)細(xì)胞瘤、 肺癌、腦癌和本領(lǐng)域已知的其他癌癥。本文尤其公開了包括能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的小分子的 組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，所述組合物和方法涉及可直接或間接與程序性細(xì)胞死 亡途徑成員如半胱天冬酶-3酶原相互作用的化合物。在某些實(shí)施方案中，與直接或間接與 程序性細(xì)胞死亡途徑成員如半胱天冬酶-3酶原相互作用的其他化合物相比，所述組合物 和方法具有降低的神經(jīng)毒性。
[0011] 聯(lián)合抗癌治療可由靶向不同生化途徑的藥物組成，或者由那些在相同途徑中攻擊 不同靶標(biāo)的化合物組成，模擬"合成致死"的基因組合。半胱天冬酶-3酶原激活劑PAC-1 和第二活性劑的結(jié)合物對于誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡性死亡已經(jīng)顯示出相當(dāng)大的協(xié)同作用， 經(jīng)常達(dá)到完全超過加和效果的程度。PAC-1和第二活性劑的結(jié)合物可用于有效降低腫瘤模 型中的腫瘤負(fù)荷，其中單獨(dú)的化合物具有極小的效果或沒有效果。本文中描述的數(shù)據(jù)顯示 了 PAC-1/第二活性劑結(jié)合物用于治療癌癥的效力，更廣義而言，顯示出結(jié)合物可協(xié)同作用 并提供顯著加強(qiáng)的治療益處。
[0012] 因此，本發(fā)明提供一種組合物，其包含：
[0013] (a)化合物 PAC-1:

【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，包括 (a) 化合物PAC-I:
(b) 第二活性劑，其中所述第二活性劑是依托泊苷、硼替佐米、十字孢堿、多柔比星、他 莫昔芬、順鉬、卡鉬或紫杉醇，以及 (c) 藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體包括水和任選地緩沖劑、環(huán)糊精或其結(jié)合物。
3. 權(quán)利要求2的組合物，其中所述環(huán)糊精是2-羥丙基-P-環(huán)糊精。
4. 權(quán)利要求1的組合物，其中PAC-I的濃度為約2iiM至約50iiM。
5. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述第二活性劑的濃度為約25nM至約ImM。
6. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是依托泊苷，并且依托泊苷的濃度為 約 2iiM至約 50iiM0
7. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是硼替佐米，并且硼替佐米的濃度為 約 50nM至約 20iiM。
8. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是十字孢堿，并且十字孢堿的濃度為 約 25nM至約 200nM。
9. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是多柔比星，并且多柔比星的濃度為 約50nM至約5uM。
10. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是他莫昔芬，并且他莫昔芬的濃度 為約5iiM至約50iiM。
11. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是順鉬，并且順鉬的濃度為約5yM 至約150iiM，所述第二活性劑是卡鉬，并且卡鉬的濃度為約5iiM至約150iiM。
12. 權(quán)利要求1或4的組合物，其中所述第二活性劑是紫杉醇，并且紫杉醇的濃度為約 0. 5nM至約 5nM。
13. -種抑制癌細(xì)胞生長或增殖的方法，包括使癌細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1的組合 物接觸，從而抑制癌細(xì)胞生長或增殖。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述癌細(xì)胞是淋巴瘤細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞或卵 巢癌細(xì)胞。
15. -種在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包括使癌細(xì)胞與有效量的化合物PAC-I和 有效量的第二活性劑接觸，
其中所述第二活性劑是依托泊苷、硼替佐米、十字孢堿、多柔比星、他莫昔芬、順鉬、卡 鉬或紫杉醇；從而在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述接觸為在體外。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述接觸為在體內(nèi)。
18. 權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌細(xì)胞與PAC-I和第二活性劑同時接 觸。
19. 權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中在所述癌細(xì)胞與所述第二活性劑接觸之前 使所述癌細(xì)胞與PAC-I接觸。
20. 權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中在所述癌細(xì)胞與所述第二活性劑接觸之后 使所述癌細(xì)胞與PAC-I接觸。
21. -種在有需要的患者中治療癌癥的方法，包括同時或相繼給予患者治療有效量的 化合物PAC-I和有效量的第二活性劑，
其中所述第二活性劑是依托泊苷、硼替佐米、十字孢堿、多柔比星、他莫昔芬、順鉬、卡 鉬或紫杉醇；從而治療癌癥。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物PAC-I和所述第二活性劑同時給藥。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物PAC-I和所述第二活性劑相繼給藥。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物PAC-I在所述第二活性劑之前給藥。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物PAC-I在所述第二活性劑之后給藥。
26. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是淋巴瘤、骨肉瘤或乳腺癌。
27. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。
28. 權(quán)利要求27的用途，其中所述癌癥是淋巴瘤、骨肉瘤、乳腺癌或卵巢癌。
【文檔編號】A61K33/24GK104507479SQ201380023803
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月6日
【發(fā)明者】保羅·J·赫甘羅斯?fàn)? 瑞秋·C·博特姆, 蒂莫西·M·范, 馬克·J·吉爾伯特, 邁克爾·K·漢德里, 霍華德·S·羅斯, 索多爾·M·塔拉索 申請人:伊利諾伊大學(xué)評議會, 抑制腫瘤公司