佐劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是基于無機(jī)(金屬/金屬氧化物)納米粒的佐劑性質(zhì)的識(shí)別。因此，本發(fā)明提供包含無機(jī)納米粒、由其組成或基本由其組成的佐劑。本發(fā)明還提供包含所述佐劑的組合物和疫苗以及使用所述佐劑無機(jī)納米粒的方法。
【專利說明】佐劑 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供新的佐劑，其用于改變、調(diào)節(jié)或增強(qiáng)人或動(dòng)物受試者中的免疫反應(yīng)。本 發(fā)明還提供包含所述佐劑的組合物和疫苗。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 疫苗被認(rèn)為是預(yù)防傳染病中的最終免疫學(xué)工具，其是通過以良好的抗體反應(yīng)提供 長(zhǎng)效保護(hù)性免疫[1 ;2]。佐劑的作用是加強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)通過抗原遞呈細(xì)胞的活化供給的最 小量抗原的特異性反應(yīng)[3]。理想的佐劑自身將不具有抗原性并且將促進(jìn)免疫反應(yīng)同時(shí)不 誘發(fā)免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)可能傷害患者（如誘發(fā)過度局部炎癥、過 敏或遲發(fā)型超敏反應(yīng)）。
[0004] 出于安全性考慮，得到許可的佐劑非常有限，并且注射位點(diǎn)處的疼痛和炎癥是在 臨床疫苗中使用佐劑的常見副作用。在人疫苗中被最廣泛使用的佐劑是含有鋁的[4]，如明 礬、無機(jī)鹽，其通常由Al (OH)3或Al (PO)4組成。明礬佐劑因此是金屬氧化物顆粒。
[0005] 在小鼠中，含鋁佐劑誘發(fā)體液免疫，主要是通過促進(jìn)Th2型反應(yīng)，同時(shí)刺激依賴 Thl的抗體的能力較弱。此類型的佐劑通常不會(huì)誘發(fā)強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，尤其是具有 細(xì)胞毒性的T細(xì)胞反應(yīng)[4]，雖然據(jù)報(bào)道其在額外的脂質(zhì)佐劑的存在下引發(fā)細(xì)胞毒性的CD8 反應(yīng)[5]。因此，含明礬的佐劑適合于針對(duì)蛋白質(zhì)抗原或失活有機(jī)體的反應(yīng)，但是對(duì)于誘發(fā) 對(duì)胞內(nèi)病原體的反應(yīng)來說不是最佳的[1-4]。
[0006] 納米粒（NP)已經(jīng)被擴(kuò)展至各種各樣的生物醫(yī)學(xué)用途，這歸因于與大體積的化學(xué) 品相比其獨(dú)特的理化性質(zhì)[6]。例如，NP具有更大的表面積并且通過靜電相互作用而具有 高的蛋白質(zhì)結(jié)合親和力[7]。NP還能夠滲入到組織深部并且加強(qiáng)細(xì)胞攝取以及避開溶酶體 腔室[7-9]。這些獨(dú)特的性質(zhì)導(dǎo)致NP被認(rèn)為是潛在的佐劑[10 ;11]。NP的大小表現(xiàn)出影 響佐劑能力，并且較小的NP已被證明產(chǎn)生更大的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)[12]。然而，用于疫 苗佐劑的NP候選物中的大多數(shù)是有機(jī)物質(zhì)[13]。
[0007] 據(jù)報(bào)道，在鼠的哮喘模型中，多壁碳納米管[14]、柴油機(jī)尾氣顆粒[15]和納米尺 寸的超細(xì)炭黑[16]通過類似佐劑的機(jī)制增加血清IgE水平。與使用含明礬佐劑報(bào)道的數(shù) 據(jù)[17;18]比較，納米尺寸的炭黑顯示與IgGl類似的佐劑作用，并且IgE增加[16]。
[0008] 已經(jīng)證明，氧化鎳NP (NiONP)和氧化鈷NP (Co3O4NP)能夠在雌性Wistar大鼠的肺 中誘發(fā)Thl相關(guān)性細(xì)胞因子反應(yīng)[19]。
[0009] 本發(fā)明試圖消除與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的一種或多種問題并且提供另外的佐劑，所述佐 劑適合于與疫苗一起使用以針對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)于預(yù)防或治愈來說是重要的疾病。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明是基于對(duì)無機(jī)（金屬/金屬氧化物）納米粒的佐劑性質(zhì)的鑒定。
[0012] 在第一方面，本發(fā)明提供包含無機(jī)納米粒、由其組成或基本由其組成的佐劑。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑可以不包含明礬。
[0014] 本發(fā)明提供的佐劑的無機(jī)納米粒可以包括金屬納米粒。例如，所述金屬納米?？?以包括金屬氧化物納米粒。
[0015] 有利地，本發(fā)明的佐劑可以包括一種或多種類型的金屬納米粒。例如，本文中 所述的佐劑可以包括不同類型的無機(jī)（金屬氧化物）納米粒的混合物（cocktails or mixtures)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中所述的佐劑還可以包含一些基于明研^的佐劑。
[0016] 如此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供包含金屬和/或金屬氧化物納米粒、由其組成 或基本由其組成的佐劑。
[0017] 本發(fā)明的佐劑可以包含鈷納米粒、由其組成或基本由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案 中，鈷納米粒包含鈷氧化物。適合用作本發(fā)明的佐劑的鈷氧化物納米?？梢园?，例如，鈷 (II，III)氧化物（Co3O4)納米粒。
[0018] 鑒于以上，本發(fā)明提供包含鈷和/或鈷（II，III)氧化物（Co3O4))納米粒、由其組 成或基本由其組成的佐劑。
[0019] 技術(shù)人員將理解，存在其他形式的鈷氧化物，并且這些可以具有作為佐劑的類似 用途-因此，本文中所述的佐劑還可以包含氧化鈷（鈷（II)氧化物：C〇0)和/或氧化高 鈷（鈷（III)氧化物：c〇203)或可以由其組成或基本由其組成。
[0020] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包含無機(jī)納米粒的佐劑，尤其是包含金屬納米粒如鈷納米粒的那些 佐劑，當(dāng)在體內(nèi)施用時(shí)，誘發(fā)平衡的Thl和Th2型反應(yīng)。這與其他佐劑（包括，例如，包含明 礬的那些）形成對(duì)比，后者僅誘發(fā)Thl反應(yīng)或Th2反應(yīng)。技術(shù)人員將理解，雖然Thl反應(yīng)可 以有效地幫助清除胞內(nèi)病原體，但是大部分佐劑引發(fā)Th2反應(yīng)，其在清除胞外病原體方面 更有效。如此，本發(fā)明的無機(jī)或鈷納米粒佐劑可以與各種各樣的疫苗一起使用，并且尤其適 合于與針對(duì)這樣的疾病的疫苗一起使用，在所述疾病中體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì) 于預(yù)防或治愈是重要的。
[0021] 此外，本發(fā)明人觀察到，與基于明礬的佐劑（其主要包含微粒明礬（即0.1 至 IOOym的明礬顆粒）或由其組成）形成對(duì)比的是，本發(fā)明的無機(jī)（基于鈷的）納米粒佐劑 誘發(fā)的免疫反應(yīng)包含少得多的'變應(yīng)性' IgE免疫球蛋白同種型。這是重要的，因?yàn)槠湓谧?劑施用后減少超敏反應(yīng)。
[0022] 作為另外的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基于無機(jī)納米粒的佐劑-如，例如，本文中所述 的鈷納米粒佐劑，在敏化和攻擊位點(diǎn)誘發(fā)較少的炎癥。這具有優(yōu)點(diǎn)，即減輕可以通常在佐劑 如明礬的施用后的疼痛腫脹。
[0023] 鑒于以上，并且不希望受制于理論，作為誘發(fā)平衡的THl和TH2免疫反應(yīng)的結(jié)果， 與基于明礬的佐劑相比減小的毒性以及變應(yīng)性副作用的相對(duì)缺少，無機(jī)納米粒（例如，包 含鈷和/或鈷氧化物（具體地Co3O4)的金屬納米粒），代表了適合于與疫苗一起使用的通 用佐劑，其中需要Thl或Th2反應(yīng)或Thl和Th2反應(yīng)兩者來清除病原體。
[0024] 術(shù)語納米粒涵蓋直徑為約Inm至約IOOnm的顆粒。例如，納米粒可以為約（或者 其平均直徑為）lnm，5nm，10nm，15nm，20nm，25nm，30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm， 95nm或99nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的佐劑組合物的納米粒的平均直徑可以為 約15nm, 16nm, 17nm, 18nm, 19nm或20nm。當(dāng)納米粒包含鈷時(shí)，其直徑（或平均直徑）可以 17nm, 17. 5nm, 18nm, 18. lnm, 18. 2nm, 18. 3nm, 18. 4nm, 18. 5nm, 18. 6nm, 18. 7nm, 18. 8nm, 18. 9nm,19nm,19. 5nm 或 20nm〇
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中所述的佐劑的鈷納米粒（包括鈷（II，III)氧化物納米 粒）的平均直徑為約18. 4±5. Onm。
[0026] 在第二方面，本發(fā)明提供本文所述的無機(jī)金屬納米粒（包括鈷/鈷氧化物）納米 粒作為佐劑的用途。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用作佐劑的本文所述的無機(jī)金屬納米 粒（包括鈷/鈷氧化物）納米粒。例如，本發(fā)明可以提供Co3O4納米粒作為佐劑的用途和用 作佐劑的Co3O4納米粒。
[0027] 在第三方面，本發(fā)明提供的佐劑可以被提供作為組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明的佐劑組合物可以包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的一種或多種組分：
[0028] (i) -種或多種類型的無機(jī)金屬納米粒；
[0029] (ii)另外的佐劑組分（例如基于明研1的佐劑）；和
[0030] (iii)藥學(xué)上可接受的或生理學(xué)上可接受的賦形劑、溶劑、載體或稀釋劑。
[0031] 合適的賦形劑可以包括，例如油，并且技術(shù)人員將理解，術(shù)語"油"可以包括鏈烷 烴，烯烴，炔烴，及其相應(yīng)的酸和醇，其醚和酯，及它們的混合物。油的具體化合物有輕質(zhì)烴 化合物，即，此種組分具有6至30個(gè)碳原子。所述油可以合成制備或自石油產(chǎn)品純化。所 述"油"可以具有直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)。其可以是完全飽和的或具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵。用 于本發(fā)明的一些非可代謝油包括例如礦物油、石蠟油和環(huán)烷烴。
[0032] 術(shù)語油也意在包括"輕質(zhì)礦物油"，即這樣的油，其通過蒸餾礦脂類似地獲得，但是 具有比石蠟油稍微低的比重。用作賦形劑的其他"油"可以包括可代謝（無毒性）油。此 類油可以包括，例如植物油，魚油，動(dòng)物油或可以被將被施用以所述佐劑的受試者（人或動(dòng) 物）的身體代謝并且沒有毒性的合成制備的油。植物油的來源包括堅(jiān)果，種子和谷物。
[0033] 技術(shù)人員將理解，本文所述的任何油賦形劑可以作為水包油、油包水或水包油包 水乳液形式被提供。
[0034] 本發(fā)明提供的水包油乳液由AMPHIGEN(R)制劑組成。此制劑包含水成組分， 卵磷脂，礦物油，和表面活性劑。描述所述制劑的組分的專利包括US 5, 084, 269和US 6, 572, 861。典型地，本發(fā)明的油組分以按體積計(jì)1 %至50%的量；或10%至45%的量；或 20 %至40 %的量存在。
[0035] 本文所述的佐劑組合物的其他組分可以包括藥學(xué)上可接受的賦形劑，如載體、溶 齊U、和稀釋劑、等張劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、血管收縮劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑等。典型的 載體、溶劑和稀釋劑包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油、油等。代表性的等張劑包括氯化鈉、 右旋糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等。有用的穩(wěn)定劑包括明膠、清蛋白等。
[0036] 表面活性劑用于幫助穩(wěn)定被選擇充當(dāng)佐劑和抗原的載體的乳液。適用于本發(fā)明的 表面活性劑包括天然生物相容性表面活性劑和非天然合成表面活性劑。生物相容性表面 活性劑包括磷脂化合物或磷脂的混合物。優(yōu)選的磷脂有磷脂酰膽堿（卵磷脂），如大豆或 蛋卵磷脂。卵磷脂可以通過以下方法作為磷脂和甘油三酯的混合物獲得：水洗未加工的植 物油，并且分離和干燥所得的水合膠。精制的產(chǎn)物可以通過以下方法獲得：對(duì)通過丙酮洗 滌除去甘油三酯和植物油后剩余的丙酮不溶性磷脂和糖脂的混合物進(jìn)行分餾。備選地，卵 磷脂可以獲得自多個(gè)商業(yè)來源。其他合適的磷脂包括磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰絲 氨酸（phosphatidylsehne)，磷脂酸，心磷脂，和磷脂酰乙醇胺。磷脂可以分離自天然來源 或可以是常規(guī)合成的。適用于本發(fā)明的非天然、合成表面活性劑包括脫水山梨醇系非離子 表面活性劑，例如脂肪酸取代的脫水山梨醇表面活性劑（以商品名SPAN(R)或ARLACEL(R) 市售的），聚乙氧基化的山梨醇的脂肪酸酯（TWEEN(R))，來自來源如蓖麻油的脂肪酸的聚 乙二醇酯（EMULFOR(R));聚乙氧基化的脂肪酸（例如，可以商品名SMULSOL M-53(R)獲 得的硬脂酸），聚乙氧基化的異辛基苯酚/甲醛聚合物（TYLOXAPOL(R))，脂肪醇聚氧乙烯 醚（BRIJ(R));壬基酚聚氧乙烯醚（TRITON(R)N)，異辛基苯基聚氧乙烯醚（TRITON(R)X)。 一般而言，表面活性劑或表面活性劑的組合（如果使用兩種以上表面活性劑）以按體積計(jì) 0. 01 %至10 %、優(yōu)選地0. 1 %至6. 0 %、更優(yōu)選地0. 2 %至5. 0 %的量存在于乳液中。
[0037]當(dāng)在本文中使用時(shí)，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、涂 料、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑等。載體應(yīng)當(dāng) 在與組合物的其他組分相容并且對(duì)受試者無害的意義上是"可用的"。典型地，載體將是無 菌且無熱原的，并且基于要使用的施用模式進(jìn)行選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，藥學(xué)上可 接受的載體的某些制劑包含在由美國(guó)（US)農(nóng)業(yè)部或美國(guó)食品和藥品管理局（或非美國(guó)國(guó) 家中的同等的政府機(jī)構(gòu)）頒布的可適用的規(guī)定中批準(zhǔn)的那些載體。因此，用于組合物的商 業(yè)制備的藥學(xué)上可接受的載體可以是已經(jīng)或?qū)⒈幻绹?guó)或外國(guó)的適當(dāng)?shù)恼畽C(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的載 體。
[0038] 所述組合物可以任選地包含相容的藥學(xué)上可接受的（即，無菌或無毒性）液體、半 固體或固體稀釋劑，其充當(dāng)藥物載體、賦形劑或介質(zhì)。稀釋劑可以包括水、鹽水、右旋糖、乙 醇、甘油等。等張劑可以包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，等等。穩(wěn)定劑包括清 蛋白，等等。
[0039] 所述組合物還可以含有抗生素或其他防腐劑，包括，例如，慶大霉素、硫柳汞 (merthiolate)或氯甲酚?？蛇x擇的多種類型的抗生素或防腐劑是技術(shù)人員熟知的。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑組合物可以包含一種或多種另外的佐劑組分。 例如，佐劑組合物除了本文所述的無機(jī)（鈷）納米粒以外還可以包含選自由以下各項(xiàng)組成 的組的一種或多種佐劑：明礬（包含氫氧化鋁/磷酸鋁）；油系佐劑和有機(jī)佐劑（例如角鯊 烯）。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的佐劑和/或佐劑組合物可以以凍干形式或作為凍 干組合物被提供。技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的凍干佐劑/佐劑組合物可以使用本文所述的 任何藥學(xué)上可接受的載體/稀釋劑和/或賦形劑重建。
[0042] 有利地，本文所述的佐劑和佐劑組合物還可以包含一種或多種保存劑-包括，例 如，防凍劑。
[0043] 佐劑經(jīng)常被用作疫苗組合物的組分-尤其是當(dāng)疫苗的抗原的免疫原性弱時(shí)。技 術(shù)人員將理解，佐劑可以用于改變、調(diào)節(jié)、修改或增大疫苗的效果從而刺激合適或適當(dāng)?shù)拿?疫反應(yīng)-所述免疫反應(yīng)有助于從人或動(dòng)物宿主中清除病原體。如此，在另一方面，本發(fā)明 擴(kuò)展至用于人或動(dòng)物使用的疫苗，其中所述疫苗包含本文所述的佐劑或利用其配制。
[0044] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于加強(qiáng)人或動(dòng)物受試者中的免疫反應(yīng)的本發(fā) 明的佐劑（即，鈷系佐劑）。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑與疫苗一起或同時(shí)施用。典 型地，將佐劑與疫苗配制在一起以用于施用于人或動(dòng)物受試者。在其他實(shí)施方案中，使用的 佐劑可以被配制成單獨(dú)的組合物（與合適的藥物載體、稀釋劑和/或賦形劑一起）以在施 用疫苗之前或之后向人或動(dòng)物受試者施用。
[0045] 技術(shù)人員將理解，對(duì)本文中使用的"疫苗"的指代可以涵蓋用于產(chǎn)生（raise)人或 動(dòng)物宿主中的免疫反應(yīng)的任何抗原制劑。目前使用的有很多不同類型的疫苗并且這些中的 很多使用佐劑配制/與佐劑結(jié)合或與佐劑一起施用（同時(shí)地或分開地）以提高、增加或改 變產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的性質(zhì)。在一些情況中，佐劑被用作提高人或動(dòng)物宿主中的免疫反應(yīng)的 手段。例如，佐劑可以用于提高由低（亞最優(yōu)）劑量的抗原引起的免疫反應(yīng)。在這點(diǎn)上，本 發(fā)明的佐劑/佐劑組合物可以與亞最優(yōu)劑量的疫苗或抗原組合-所述疫苗或抗原用來增 加由亞最優(yōu)劑量引起的免疫反應(yīng)。當(dāng)與本發(fā)明的佐劑或佐劑組合物一起施用時(shí)，由亞最優(yōu) 疫苗/抗原劑量產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，可以比得上單獨(dú)（即，沒有佐劑）施用最優(yōu)劑量的疫苗/ 抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒和/或細(xì)菌抗原疫苗可以與本文所述的佐劑/佐劑組合 物組合或一起施用（同時(shí)地或分開地）。例如，針對(duì)例如'流感'、白喉、百日咳、麻疹、腮腺 炎、風(fēng)疹、小兒麻痹癥、結(jié)核病、腦膜炎、破傷風(fēng)、黃熱病、狂犬病的形式的疫苗可以與本文所 述的佐劑組合或一起施用。
[0047] 在另一方面，本發(fā)明提供（i)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法和/或（ii)加強(qiáng)、調(diào)節(jié)或增強(qiáng) 人或動(dòng)物受試者中的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括以下步驟：向有此需要的人或動(dòng)物受 試者施用本發(fā)明的第一方面提供的疫苗和佐劑。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑可以與疫苗配制在一起以致所述佐劑與疫苗一起被施用 至人或動(dòng)物宿主。在其他實(shí)施方案中，佐劑被配制成單獨(dú)的組合物，以致其可以與疫苗分開 施用或與其同時(shí)施用。
[0049] 詳述
[0050] 現(xiàn)在將參考以下附圖詳細(xì)地描述本發(fā)明，以下附圖顯示：
[0051] 圖I =Co3O4NP(A)和I-明礬⑶的形狀和尺寸。顆粒分散在蒸餾水中并且通過透 射電子顯微鏡測(cè)量。
[0052] 圖2 :NP或I-明礬對(duì)RAW264. 7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在存在或不存在1 % OVA的情況 下將顆粒（給出的濃度以U g/ml計(jì)）添加到RAW264. 7細(xì)胞中達(dá)24h。對(duì)于細(xì)胞毒性，測(cè)量 乳酸脫氫酶（LDH)的水平。注意到，與Co3O4NP相比，I-明礬顯示約6倍更多的細(xì)胞毒性， 并且OVA增加顆粒的毒性。數(shù)據(jù)為平均值土 SEM (n = 4/組）。將用1 % OVA或不用OVA處 理的顆粒的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)與其各自對(duì)照相比。***P〈〇. 001。
[0053] 圖3 :第二次皮下敏化后7天血清中的OVA特異性IgGl水平。其他免疫球蛋白 (IgG2a、IgE、IgA和IgM)不顯示增加（數(shù)據(jù)未顯示）。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM(n = 5/組）。
[0054] 圖4 :使用卵清蛋白腹膜內(nèi)攻擊后7天存在于血清中的OVA特異性免疫球蛋白水 平。測(cè)試的免疫球蛋白有仏)1§61，出)1§62&，（〇1 §￡，（0)1§4，和伍)1§11。數(shù)據(jù)是平均值 土SEM(代表數(shù)據(jù)，n = 5/組）。（F)使用OVA腹膜內(nèi)攻擊后7天的脾細(xì)胞的增殖。僅用培 養(yǎng)基或在10 U M OVA存在下培養(yǎng)的細(xì)胞的3H-胸腺嘧啶摻入。
[0055] 圖5 :使用卵清蛋白攻擊后7天腹腔灌洗液中的OVA特異性IgGl水平。其他免疫 球蛋白（IgG2a、IgE、IgA和IgM)不顯示增加（數(shù)據(jù)未顯示）。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM(n = 5/ 組）。
[0056] 圖6 :攻擊后7天收集的腹腔灌洗液中的細(xì)胞因子的水平。（A) IFN- Y ; (B) IL-I 3。 數(shù)據(jù)是平均值土 SEM (n = 5/組）。*P〈0. 05,與PBS處理組相比。
[0057] 圖7 :攻擊后7天收集的腹腔灌洗液的分類細(xì)胞計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)是平均值土SEM(n = 5/ 組）。*P〈0. 05，**P〈0. 01，并且 ***P〈0. 001，與 PBS 處理組相比。
[0058] 圖8 :攻擊后7天注射位點(diǎn)的代表性組織學(xué)。A，PBS ;B，NP-OVA ;C，I-明礬-OVA ; D，單獨(dú)的NP。注意到，NP-OVA和單獨(dú)的NP組顯示輕微的炎癥（箭頭）以及NP的沉積（黑 點(diǎn)），同時(shí)I-明研I _〇VA顯不嚴(yán)重炎癥和壞死（箭頭）。
[0059] 圖9 :顯示表達(dá)特定標(biāo)志的樹突細(xì)胞的數(shù)目的圖表。
[0060] 圖10 :顯示對(duì)鈷氧化物納米粒的細(xì)胞毒性反應(yīng)的圖表。
[0061] 圖11 :顯示對(duì)Imject Alum的細(xì)胞毒性反應(yīng)的圖表。
[0062] 圖12 :顯示響應(yīng)于氧化鈷NP±1 % OVA的DC的細(xì)胞毒性的圖表。
[0063] 圖13 :顯示響應(yīng)于Imject Alumil % OVA的DC的細(xì)胞毒性的圖表。
[0064] 圖14 :顯示通過用氧化鈷NP±1 % OVA處理的DC的IL-I @產(chǎn)生。
[0065] 圖15 :顯示通過用Imject Alum± 1 % OVA處理的DC的IL-I P產(chǎn)生。
[0066] 實(shí)施例1
[0067] 因?yàn)閹缀鯖]有佐劑能夠誘發(fā)Thl反應(yīng)，所以考慮NP可以用于提高針對(duì)模式抗原卵 清蛋白（OVA)的Thl免疫性。
[0068] 我們選擇Co3O4NP作為候選佐劑，因?yàn)镃o3O 4NP在不產(chǎn)生在NiONP的情況下見到的 嚴(yán)重的延遲型超敏病理學(xué)[19]的情況下產(chǎn)生Thl反應(yīng)。目的是確定Co3O4NP是否可以通過 誘發(fā)針對(duì)經(jīng)皮下施用至雌性C57BL/6小鼠的模式抗原OVA的平衡的Thl和Th2反應(yīng)而適合 用作佐劑。
[0069] 為此，我們將由Co3O4NP誘發(fā)的抗-OVA反應(yīng)與由市售含鋁佐劑誘發(fā)的那些相比。 選擇的佐劑是Imject Alum(I-明礬），這是一種被廣泛用于鼠類實(shí)驗(yàn)的金屬顆粒佐劑，其 含有氫氧化鋁和氫氧化鎂的50/50混合物以及無活性的穩(wěn)定劑。除了卵清蛋白特異性反應(yīng) 以外，還在注射位點(diǎn)處評(píng)估毒性，并且使用小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系評(píng)估抗原遞呈細(xì)胞的細(xì)胞 毒性。
[0070] 材料和方法
[0071] 除非另外指出，所有化學(xué)品和試劑都購自Sigma-Aldrich (Poole, UK)。
[0072] 顆粒的表征和分散.
[0073] 使用透射電子顯微鏡（JEM-1200EX II，JEOL，Tokyo, Japan)測(cè)量 Co3O4NP (Nanostructural and Amorphous Materials, TX, USA)和 Imject Alum(Thermo Scientific, Cramlington, UK)的尺寸。使用粒度分析儀（90Plus/BI_MAS ;Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA)，在不同濃度的分散介質(zhì)存在下，測(cè)量顆粒的流 體力學(xué)尺寸。對(duì)于體內(nèi)研究，雞蛋卵清蛋白（V級(jí)）被用作用于C〇304NP+0VA (NP-OVA)和I-明 礬+0VA(I-明礬-0VA)的分散介質(zhì)，同時(shí)收集自健康的C57BL/6小鼠的熱失活血清（終濃 度：5% )被用于 NP-單獨(dú)。使用 Limulus Amebocyte Lysate 測(cè)定（Cambrex，MD, USA)測(cè) 量顆粒懸浮液中的內(nèi)毒素水平。根據(jù)之前描述的方法[19]，在酸性人造溶酶體液（pH 5.5) 或堿性人造間質(zhì)液（pH 7.4)中，測(cè)試Co3O4NP和I-明礬的溶解度。
[0074] 劑量選擇的理由.
[0075] 基于我們之前的研究，我們選擇I-明礬的劑量為2. Omg/小鼠[17]。相對(duì)地，基于 肺中的炎癥原性（inf lammogenicity) ,Co3O4NP的劑量被選擇為25 ii g/小鼠；灌注419 ii g/ 大鼠的Co3O4NP顯示急性嗜中性細(xì)胞炎癥和慢性淋巴細(xì)胞/嗜中性細(xì)胞炎癥以及小泡脂蛋 白累積?。╝lveolar lipoproteinosis) [19] 〇
[0076] 細(xì)胞毒性測(cè)定（LDH).
[0077] 將小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264. 7在37°C，在5% CO2的情況下，在含有L-谷氨酰 胺、抗生素（青霉素和鏈霉素）和10%熱失活的胎牛血清（FBS)的Dulbecco' s Modified Eagle's Medium(DMEM)中培養(yǎng)。使用accutase剝離細(xì)胞并且將其以5X105接種在 12孔板（Corning，NY，USA)中以用于實(shí)驗(yàn)。使用乳酸脫氫酶（LDH)測(cè)定試劑盒（Roche Applied Science, Sussex, UK)，根據(jù)手冊(cè)說明，測(cè)量NP和明研^的細(xì)胞毒性作用。使用 Ti02NP(30.5±1.8nm) (Nanostructural and Amorphous Materials, TX, USA)作為基準(zhǔn)顆 粒。將含有或不含〇VA(l% )的NP或I-明礬溶液供應(yīng)至RAW264. 7細(xì)胞達(dá)24h。以10、30、 100和500 ii g/ml的濃度測(cè)試各NP，同時(shí)以80、240和800 ii g/ml的濃度測(cè)試I-明礬。在 溫育后，將無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清在17000Xg離心20min以除去顆粒。將細(xì)胞毒性計(jì)算為與 陽性對(duì)照（〇? 1% Triton-X)相比的百分比。
[0078] 動(dòng)物免疫.
[0079] 六周齡雌性 C57BL/6 小鼠獲得自 Harlan Laboratories (Hillcrest，UK)。所有動(dòng) 物都在由英國(guó)內(nèi)政部向作者中的一位（SEMH)授權(quán)的、保證所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的人道處理和 減輕痛苦的特殊許可下維持和處理。在1周的馴化后，以2周的間隔將小鼠（5只小鼠/組） 免疫兩次。通過在尾部的底部皮下注射以含有25 ill PBS、50 ill (100 ii g)無內(nèi)毒素的卵清 蛋白（Worthington Biochemical Corporation，NJ，USA)和 25 u 1 的佐劑（I-明研i :2. Omg ; Co3O4NP :25 ii g)的 100 ill 劑量敏化每只小鼠。將 PBS (100 ill)和 Co3O4NP (25 ii g，在含有 5 %小鼠血清的PBS中）用于陰性對(duì)照。然后，將在100 ill的PBS中的50 ii g的OVA注射 到腹膜中作為攻擊。在第二次敏化后7天，從尾靜脈收集血液。在攻擊后7天，通過心臟穿 刺收集血液并且使用2ml的0.9%鹽水進(jìn)行三次腹腔灌洗。保留第一次的灌洗液以用于免 疫球蛋白和細(xì)胞因子ELISA，同時(shí)匯集來自三次灌洗的細(xì)胞以用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。注射位 點(diǎn)也用10%中性緩沖的福爾馬林固定以用于組織學(xué)分析。
[0080] 2. 5.免疫球蛋白ELISA.對(duì)于OVA特異性免疫球蛋白IgA、IgE、IgGl、IgG2c (之 如被稱為IgG2ab)和IgM子類的存在，分析在免疫后1周和攻擊后1周收集的血液樣品。 將血清和腹腔灌洗液樣品適當(dāng)?shù)叵♂屧诤? % BSA的PBS中。如下地稀釋生物素綴 合的二抗：抗-IgA- 1:1000 ;抗-IgGl - 1:8000 ;抗-IgG2c- 1:1000 ;抗-IgM- 1:1000 ; 抗-IgE- 1:250。在測(cè)量IgE前，將血清與G蛋白偶聯(lián)的小珠溫育一小時(shí)以除去IgG[17 ; 18]。
[0081] 細(xì)胞因子ELISA.
[0082] 為了評(píng)估細(xì)胞因子分布，在腹腔灌洗液中測(cè)試Thl型細(xì)胞因子（IFN-Y )、Th2型細(xì) 胞因子（IL-10和IL-13)以及來源于巨噬細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子（IL-1 P )。所有試劑盒都 購自R&D Systems (Abingdon, UK)，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明測(cè)量細(xì)胞因子。
[0083] 腹腔灌洗液分類細(xì)胞計(jì)數(shù).
[0084] 通過使用細(xì)胞核計(jì)數(shù)器（Chemometec，Surrey, UK)估計(jì)灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)。使 用甩片機(jī)將細(xì)胞涂片于載玻片（Thermo Scientific, Cramlington，UK)上，用甲醇固定并且 用Diff-Quik(Raymond Lamb，Eastbourne，UK)染色。在光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)其形態(tài)，每片約 計(jì)數(shù)300-500個(gè)細(xì)胞。
[0085] 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定.
[0086] 將脾從小鼠中移除并且通過使其通過40 y m濾器制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分層放 置在 lympholyte-M?(Fisher Scientific, Loughborough, UK)密度梯度分離介質(zhì)上并且在 2000Xg旋轉(zhuǎn)15分鐘以除去死細(xì)胞、紅血球和粒細(xì)胞。移除界面處的單核細(xì)胞層，將其洗滌 并重懸在組織培養(yǎng)基（補(bǔ)充有10%FCS、100U/ml青霉素、100iig/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰 胺和50 ii M 2-ME的RPMI 1640 ;Sigma，UK)中。對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且將在200 ill中含 有4X IO5個(gè)細(xì)胞、不含有或含有IOii M無內(nèi)毒素的卵清蛋白的一式三份的培養(yǎng)物鋪板于96 孔板中。將培養(yǎng)物溫育48小時(shí)并且向每孔中加入0.5 ii Ci 3-H-胸腺嘧啶過夜。收獲培養(yǎng) 物并且在betaplate閃爍計(jì)數(shù)器（Wallac UK, Milton Keynes, UK)中對(duì)摻入的胸腺啼陡進(jìn) 行計(jì)數(shù)。在72小時(shí)時(shí)收獲來自平行的未標(biāo)記培養(yǎng)物的上清用于細(xì)胞因子分析。
[0087] 組織學(xué).
[0088] 將石蠟包埋的福爾馬林固定的來自注射位點(diǎn)的組織切割成3 切片并且用蘇木 精和曙紅染色。
[0089] 統(tǒng)計(jì)分析.
[0090] 利用 GraphPad Prism Software(Version 5,GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA, USA)分析數(shù)據(jù)。為了比較處理組，應(yīng)用單向方差分析以及事后Tukey成對(duì)比較。 P〈〇. 05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)上是顯著的。
[0091] 結(jié)果
[0092] 顆粒的理化性質(zhì)?
[0093] Co3O4NP顯示為球形并且一級(jí)尺寸為18. 4±5. Onm。I-明礬顯示為更多樣的形狀并 且平均尺寸為88. 7±32. 4nm(長(zhǎng)度）和28. 9±19. 7nm(寬度）（圖1)。兩者顆粒的內(nèi)毒素 水平都低于檢測(cè)極限（0.1EU/ml)。Co3O4NP在沒有分散介質(zhì)的情況下顯示為大的團(tuán)塊而在 卵清蛋白作為分散劑的情況下顯示為小的團(tuán)塊（表1)。I-明礬即使在沒有分散介質(zhì)的情 況下也顯示為小的團(tuán)塊。大部分I-明礬在3天內(nèi)溶解在酸性人造溶酶體液（pH 5.5)中， 同時(shí)最低限度地溶解在人造間質(zhì)液（pH 7.4)中（數(shù)據(jù)未顯示）。Co3O4NP在兩種條件下都 顯示最小溶解（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0094] 3. 2.體外細(xì)胞毒性.I-明研^是到目前為止在小鼠巨噬細(xì)胞上測(cè)試的NP中毒性最 大的（圖2)。當(dāng)利用OVA分散顆粒時(shí)，顆粒毒性更大。
[0095] 表1.分散后24小時(shí)顆粒的流體力學(xué)尺寸和多分散性（平均值土SD)。
[0096]
【權(quán)利要求】
1. 包含無機(jī)納米粒、由其組成或基本由其組成的佐劑。
2. 權(quán)利要求1的佐劑，其中所述佐劑不包含明礬。
3. 任一前述權(quán)利要求的佐劑，其中所述佐劑包含至少一種金屬納米粒和/或至少一種 金屬氧化物納米粒。
4. 任一前述權(quán)利要求的佐劑，其中所述佐劑包含鈷納米粒和/或鈷氧化物納米粒。
5. 權(quán)利要求4的佐劑，其中所述鈷氧化物納米粒包含鈷（II，III)氧化物（C〇304)納米 粒。
6. 任一前述權(quán)利要求的佐劑，其中所述佐劑包含或進(jìn)一步包含氧化鈷（鈷（II)氧化 物：CoO)納米粒和/或氧化高鈷（鈷（III)氧化物：C〇203)納米粒。
7. 任一前述權(quán)利要求的佐劑，其中所述納米粒的直徑為約lnm至約lOOnm。
8. 權(quán)利要求4、5、6或7的佐劑，其中所述鈷納米粒的平均直徑為約18. 4±5. Onm。
9. 無機(jī)金屬納米粒、鈷納米粒和/或鈷氧化物納米粒作為佐劑的用途。
10. 權(quán)利要求9的用途，其中所述納米粒包含C〇304納米粒。
11. 佐劑組合物，所述佐劑組合物包含：權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的佐劑，藥學(xué)上或生理 學(xué)上可接受的賦形劑、溶劑、載體或稀釋劑。
12. 權(quán)利要求11的佐劑組合物，其中所述組合物包含一種或多種另外的佐劑組分。
13. 疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的佐劑。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的佐劑或根據(jù)權(quán)利要求13的疫苗，其用于加強(qiáng)人或動(dòng) 物受試者中的免疫反應(yīng)。
15. 在人或動(dòng)物受試者中（i)產(chǎn)生免疫反應(yīng)和/或（ii)加強(qiáng)、調(diào)節(jié)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的 方法，所述方法包括以下步驟：將根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的佐劑或權(quán)利要求13的疫苗 施用于有此需要的人或動(dòng)物受試者。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK104427998SQ201380027056
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月26日
【發(fā)明者】薩拉·豪伊, 肯尼思·唐納森, 趙完燮 申請(qǐng)人:愛丁堡大學(xué)董事會(huì)