用于中風(fēng)和缺血或缺血性病況的人抗體及其特異性結(jié)合序列的制作方法
【專利摘要】提供能夠結(jié)合并識別CNS中的神經(jīng)元并引起CNS神經(jīng)元反應(yīng)的特異性結(jié)合成員、特別是人抗體、特別是重組抗體及其片段。所述抗體可用于與神經(jīng)損害、損傷或變性有關(guān)的病況和神經(jīng)變性疾病的診斷和治療，特別是治療或減輕中風(fēng)或腦缺血。本發(fā)明的抗體、其可變區(qū)或其CDR結(jié)構(gòu)域序列及其片段還可用于與化學(xué)治療劑、免疫調(diào)節(jié)劑或神經(jīng)活性劑和/或與其它抗體或其片段的聯(lián)合療法。所述抗體或其活性片段可以單獨(dú)或與溶栓劑例如TPA組合用于中風(fēng)或腦缺血的療法中?？贵w通過本文提供其序列的抗體IgM12和IgM42舉例說明。
【專利說明】用于中風(fēng)和缺血或缺血性病況的人抗體及其特異性結(jié)合序 列
[0001] 政府支持聲明 本文所述發(fā)明全部或部分受國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)(資 助號 ROl NS 24180、R01 NS 32129、R01 CA104996、R01 CA096859)及全國多發(fā)性硬化協(xié)會 (National Multiple Sclerosis Society)(資助號 CA 1011 A8-3)的支持。美國政府在 本發(fā)明中享有一定權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及能夠結(jié)合并識別CNS中的神經(jīng)元并能夠引起CNS神經(jīng)元反應(yīng)的抗體， 特別是人天然抗體、來源其的重組抗體及其片段。這些抗體可用于診斷和治療與神經(jīng)損害、 損傷或變性有關(guān)的病況、神經(jīng)變性疾病、慢性神經(jīng)損傷或損害和突發(fā)性神經(jīng)損傷或損害。本 發(fā)明的抗體、其可變區(qū)或其CDR結(jié)構(gòu)域序列及其片段還可用于與化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑或神 經(jīng)活性劑和/或與其他抗體或其片段組合的療法中。本發(fā)明特別涉及用于減輕或治療中風(fēng) 或缺血、特別是腦缺血的方法，和用于中風(fēng)或缺血的相關(guān)藥劑、構(gòu)建體和組合物。
[0003] 發(fā)明背景 神經(jīng)再生是指神經(jīng)組織、細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物的再生長或修復(fù)。此類機(jī)制可包括髓鞘再生、 新的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、軸突、髓磷脂或突觸的產(chǎn)生。神經(jīng)再生因所涉及的功能機(jī)制以及再 生程度和速度而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)間有所不同。
[0004] 在損傷后成熟哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)中的軸突再生非常有限。因此，在脊 髓損傷（SCI)、創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)和涉及軸突斷裂的相關(guān)病況之后功能缺陷持續(xù)存在。這 種情形不同于哺乳動物周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS)中的情況，周圍神經(jīng)系統(tǒng)中長距離軸突再生和 實(shí)質(zhì)性功能恢復(fù)可發(fā)生在成體中。神經(jīng)元的胞外分子和內(nèi)在生長能力兩者影響再生的成 功。
[0005] 成年哺乳動物中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)軸突在損傷后不會自發(fā)地再生。相比之下， 周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS)軸突容易再生，允許在周圍神經(jīng)損害后恢復(fù)功能。Aguayo與同事證實(shí)， 至少一些成熟CNS神經(jīng)元當(dāng)提供有允許的周圍神經(jīng)移植物時(shí)保持再生的能力（Richardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ (1980) Nature 284:264 - 265; Richardson PM, Issa VM, Aguayo AJ (1984) J Neurocytol 13:165 - 182; David S, Aguayo AJ (1981) Science 214:931 - 933; Benfey M, Aguayo AJ (1982) Nature 296:150 - 152)。該研究 表明對于軸突生長，PNS環(huán)境是刺激性的和/或CNS環(huán)境是抑制性的。隨后的研究鑒定出 PNS中的生長促進(jìn)因子和CNS中的生長抑制因子兩者。再生的抑制劑包括CNS髓磷脂中的 特定蛋白質(zhì)和與星形膠質(zhì)瘢痕有關(guān)的分子。另外，CNS中相對于PNS的較慢的碎片清除可 妨礙軸突再生。了解影響軸突生長的因素對開發(fā)促進(jìn)CNS再生的治療劑至關(guān)重要。
[0006] 在周圍神經(jīng)損傷后，軸突容易再生。與細(xì)胞體斷開的軸突的遠(yuǎn)端部分進(jìn)行沃勒變 性。這種活性過程導(dǎo)致軸突斷裂和分解。碎片被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（主要為巨噬細(xì)胞）除去。 近端軸突然后可再生，并且使其目標(biāo)重新受神經(jīng)支配，使得功能恢復(fù)。
[0007] CNS再生抑制劑的兩個(gè)主要類別是髓磷脂相關(guān)抑制劑（MI)和硫酸軟骨素蛋白聚 糖（CSPG)。這些分子限制軸突再生，并且通過干擾其功能，在成體CNS中實(shí)現(xiàn)某種程度的生 長。細(xì)胞自主性因子也是CNS再生失敗的重要決定因素。CNS神經(jīng)元不會增量調(diào)節(jié)生長相關(guān) 基因至與PNS神經(jīng)元相同的程度。因此甚至在沒有抑制劑時(shí)，其再生能力也受到限制。提高 神經(jīng)元的內(nèi)在生長能力允許CNS內(nèi)適度的軸突再生（Bomze HM等人（2001) Nat Neurosci 4:38 - 43; Neumann S，Woolf CJ (1999) Neuron 23:83 - 91)。
[0008] 作為CNS髓磷脂的組分，MAI是由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)。MAI體外削弱神經(jīng) 突增生，被認(rèn)為在CNS損傷后體內(nèi)限制軸突生長。MAI包括Nogo-A (Chen MS等人（2000) Nature 403:434 - 439; GrandPre T 等人（2000) Nature 403:439 - 44)、髓憐脂相關(guān)糖蛋 白（MAG) (McKerracher L等人（1994) Neuron 13:805 - 811)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓憐脂糖蛋 白（OMgp) (Kottis V 等人（2002) J Neurochem 82:1566 - 1569)、肝配蛋白-B3 (Benson MD 等人（2005) Proc Nat Acad Sci USA 102:10694 - 10699)和腦信號蛋白 4D (Sema4D) (Moreau-Fauvarque C 等人（2003) J Neurosci 23:9229 - 9239)。這些中的 3 種（Nogo-A、 MAG和OMgp)與神經(jīng)元Nogo-66受體I (NgRl)相互作用從而限制軸突生長。這3種在結(jié)構(gòu) 上不相關(guān)的配體還對第二種軸突生長抑制性受體（配對的免疫球蛋白樣受體B (PirB))顯 示親和力（Atwal JK 等人（2008) Science 322:967 - 970)。
[0009] 已鑒定出幾種識別分子，其充當(dāng)構(gòu)成促進(jìn)和/或抑制神經(jīng)突生長的基礎(chǔ)的分子 線索。在神經(jīng)突增生促進(jìn)性識別分子中，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子Ll在介導(dǎo)神經(jīng)突增生中起突 出作用（Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507)。Ll 依賴 性神經(jīng)突增生受嗜同性（homophilic)相互作用介導(dǎo)。LI促進(jìn)表達(dá)LI的神經(jīng)突和施萬細(xì) 胞及Ll轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中的神經(jīng)突增生（Bixby等人（1982) Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 84:2555-2559; Chang 等人（1987) J Cell Biol 104:355-362; Lagenaur 等人· (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7753-7757; Seilheimer 等人（1988) J Cell Biol 107:341-351; Kadmon 等人（1990) J Cell Biol 110:193-208; Williams 等人（1992) J Cell Biol 119:883-892)。
[0010] 神經(jīng)系統(tǒng)損傷每年影響90, 000多人，如果包括腦血管事件例如中風(fēng)，則人數(shù)大更 多。據(jù)估計(jì)，僅脊髓損傷每年就影響10, 〇〇〇人。由于神經(jīng)損傷這種高的發(fā)生率，神經(jīng)再生和 修復(fù)（神經(jīng)組織工程學(xué)的分支學(xué)科），正成為致力于發(fā)現(xiàn)損傷后恢復(fù)神經(jīng)功能的新方法的 快速發(fā)展的領(lǐng)域。神經(jīng)系統(tǒng)被分成兩部分：由腦和脊髓組成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及由腦神經(jīng)和 脊神經(jīng)連同其相關(guān)神經(jīng)節(jié)組成的周圍神經(jīng)系統(tǒng)。雖然周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有修復(fù)和再生的內(nèi)在 能力，但是相比之下，且就絕大多數(shù)而言，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在其自我修復(fù)和再生能力方面受到 限制。目前還沒有可接受并獲得批準(zhǔn)的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后恢復(fù)人神經(jīng)功能的治療法。
[0011] 在脊髓損傷（SCI)后，軸突保護(hù)和修復(fù)作為防止運(yùn)動神經(jīng)元損失和永久失能的有 效策略仍具有巨大潛力。使用防止損害和促進(jìn)損傷后軸突修復(fù)的靶向營養(yǎng)因子已實(shí)現(xiàn)了神 經(jīng)元保護(hù)。這些分子主要采用基于體外系統(tǒng)（其集中于靶向特異性小分子神經(jīng)營養(yǎng)因子） 的選擇策略而鑒定。雖然這些分子在臨床前模型中顯示神經(jīng)保護(hù)結(jié)果，但是臨床試驗(yàn)的結(jié) 果不太有利。
[0012] 使用損傷和疾病的多個(gè)模型，證實(shí)了天然自體反應(yīng)性單克隆抗體在CNS細(xì)胞中 的有益生物功能。使用小鼠單克隆IgM，IN-1，體內(nèi)證實(shí)了神經(jīng)元存活、軸突再生和功能恢 復(fù)的抗體介導(dǎo)的促進(jìn)（Bregman BS 等人（1995) Nature 378(6556):498-501; Caroni P, Schwab ME (1988) Neuron 1(1) :85-96)。在CNS損傷前使用脊髓勻漿物（SCH)免疫，獲得 類似結(jié)果（Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L (2〇〇3) Neurobiol Dis 12(1):1-10; Huang DW 等人（1999) Neuron 24 (3): 639-647)。
[0013] 多發(fā)性硬化（MS)是一種慢性、頻繁進(jìn)行性、炎性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)疾病，其病 理學(xué)特征在于原發(fā)性脫髓鞘，通常沒有最初的軸突損傷。MS的病因和發(fā)病機(jī)制未知。MS 的幾個(gè)免疫學(xué)特征及其與某些主要組織相容性復(fù)合體等位基因適度相關(guān)，引起了 MS是免 疫介導(dǎo)的疾病的推測。自身免疫假設(shè)得到實(shí)驗(yàn)性自身免疫（變應(yīng)性）腦脊髓炎（EAE)模 型的支持，其中將某些髓磷脂組分注射給遺傳易感動物導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的CNS脫髓鞘。然 而，在MS患者的CNS中未明確鑒定出特異性自身抗原和致病性髓磷脂反應(yīng)性T細(xì)胞，MS 也不與其他自身免疫疾病有關(guān)?；诹餍胁W(xué)數(shù)據(jù)的備擇假設(shè)是環(huán)境因素，或許是未鑒定 的病毒促成了 CNS中的炎癥反應(yīng)，其導(dǎo)致直接或間接（"旁路對象（bystander)"）的髓磷 脂破壞，可能伴有受誘導(dǎo)的自身免疫組分。這種假設(shè)得到以下證據(jù)的支持：在人和動物兩 者中若干天然存在的病毒感染可引起脫髓鞘。一個(gè)普遍應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)性病毒模型由泰勒氏 (Theiler' s)鼠腦脊髓炎病毒（TMEV)誘導(dǎo)（Dal Canto, M. C.，和 Lipton, H. L.，J Path., 88:497-500 (1977))〇
[0014] 在MS的情況下，脫髓鞘最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。然而，脫髓鞘后的軸突死亡不是 即時(shí)的。如果提供合適的支持分子或細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)則具有明顯的修復(fù)能力。保護(hù)CNS的 軸突有希望成為限制存活軸突的喪失和防止永久失能的有效策略?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)損傷中的潛 在神經(jīng)毒性炎性環(huán)境來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)。正在研究設(shè)計(jì)以限制興奮性毒性、抑制一氧化氮或 阻斷離子通道的試劑作為保護(hù)處于危險(xiǎn)中的軸突的方法（Pitt，D.，P. Werner，和C. S. Raine (2000) Nat Med 6:67-70; Okuda, Y 等人（1997) Journal of neuroimmunology 73:107-116; Waxman, S. G. (2002) .J Rehabil Res Dev 39:233-242)。這些試劑中的 許多是具有已經(jīng)證實(shí)的毒性并全身作用于所有細(xì)胞的小分子。
[0015] 缺血是向組織的血液供應(yīng)受限，引起細(xì)胞代謝（以保持組織存活）所需要的氧和 葡萄糖短缺。缺血通常由血管問題引起，引起組織的損害或功能障礙。它也指有時(shí)由于淤 血（諸如血管收縮、血栓形成或栓塞）導(dǎo)致的身體給定部分的局部貧血。缺氧是其中作為 整體的身體或身體區(qū)域（組織缺氧、或較不常見的區(qū)域缺氧）缺乏足夠氧供應(yīng)的病況。動 脈氧濃度的變化可以是正常生理的一部分，例如，在劇烈身體鍛煉過程中。氧供應(yīng)和其在細(xì) 胞水平的需求之間的錯(cuò)配可以導(dǎo)致缺氧狀況。缺血性缺氧在血流減少時(shí)發(fā)生，并且可以例 如在心臟衰竭和血管擴(kuò)張性休克中發(fā)生。腦缺氧在沒有足夠氧氣進(jìn)入腦部時(shí)發(fā)生。腦部需 要氧和營養(yǎng)物的恒定供給來發(fā)揮功能。
[0016] 在腦缺氧時(shí)，有時(shí)只有氧供應(yīng)中斷。這可以由煙霧吸入）、一氧化碳中毒、氣哽、防 止呼吸肌運(yùn)動的疾病、高海拔、氣管（氣管）上的壓力和窒息（Strangulation)引起。在其 他情況下，氧和營養(yǎng)物供給兩者都被停止或中斷，例如在心臟驟停、心律失常、全身麻醉并 發(fā)癥、溺水、藥物過量、出生期間或出生后新生兒損傷，諸如腦性麻痹、中風(fēng)、非常低血壓中。
[0017] 腦缺血是到腦部的血流不足，并且可以是急性或慢性的。急性缺血性中風(fēng)是神經(jīng) 緊急情況，如果快速治療，其是可逆的。慢性腦缺血可以導(dǎo)致被稱為血管性癡呆的癡呆形 式。影響腦部的短暫缺血發(fā)作被稱為短暫性缺血發(fā)作（TIA)，經(jīng)常被稱為小中風(fēng)。
[0018] 中風(fēng)，也稱為腦血管意外（CVA)，是由于到腦部的血液供應(yīng)干擾導(dǎo)致的腦功能的迅 速損失。這可能是由于堵塞（血栓形成、動脈栓塞）或出血（血液滲漏）引起的缺血（缺 乏血流）。腦缺血，也被稱為腦缺血，是其中到腦部的血流不足以滿足代謝需求的病況，并且 是與蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦內(nèi)出血一起發(fā)生的中風(fēng)類型。缺血可以是局灶性缺血，其限于腦 的特定區(qū)域，或全腦缺血，其涵蓋腦組織的廣泛區(qū)域。中風(fēng)是美國長期殘疾的主要原因。每 年，接近800, 000人患有中風(fēng)。缺血性損傷之后，與臨床赤字相關(guān)的殘疾主要是由于神經(jīng)元 的功能障礙。功能恢復(fù)的缺乏部分歸因于再生和神經(jīng)可塑性的限制（Walmsley，A.R.，和 Mir, A. K. (2007) Ci/rrefli 13:2470-2484)。中風(fēng)可以導(dǎo)致改變 的運(yùn)動功能，諸如在身體一側(cè)不能移動一個(gè)或多個(gè)肢體，認(rèn)知效果，諸如不能理解或組織說 話，或其他缺陷，包括視覺效果，諸如不能看到視野的一側(cè)。目前不存在有效的治療來預(yù)防 或逆轉(zhuǎn)中風(fēng)相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷。
[0019] 缺血性中風(fēng)在醫(yī)院中偶爾用血栓溶解（也稱為"凝塊破壞者（clot buster) "）治 療，并且一些出血性中風(fēng)受益于神經(jīng)外科手術(shù)。復(fù)發(fā)的預(yù)防可以涉及施用抗血小板藥物， 諸如阿斯匹林和雙嘧達(dá)莫，控制和降低高血壓，并且使用他汀類藥物。所選患者可能受益 于頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)和使用抗凝血?jiǎng)?。腦缺血的介入治療仍然受限于通過使用重組組織 纖溶酶原激活劑rtPA的酶促血栓溶解（Brott，T.G.，等人（1992)泣rofc 23:632-640; Haley, E.C·，等人（1992) 23:641-645; Group, Τ·Ν· (1995) New England J Med 333:1581-1587)，和經(jīng)由直接插管介入去除血液凝塊（Gobin YP等人（2004) Stroke 35:2848-2854)。然而，rtPA具有短的3小時(shí)的治療窗口，如果超過3小時(shí)時(shí)間期輸注，則 出血性腦缺血發(fā)病率增加（Clark, WM等人（1999) JAMA 282:2019-2026; Hacke W等人 (2008) New England J Med 359:1317-1329)。
[0020] 已鑒定出人單克隆自身抗體，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯示活性，并且與刺激髓鞘再 生特別有關(guān)。將期望的是，開發(fā)在CNS中具有活性且具有促進(jìn)神經(jīng)再生和/或保護(hù)神經(jīng)元免 受疾病、損傷、損害和/或死亡的能力的人單克隆抗體，特別是具有這些活性的重組抗體， 特別是在中風(fēng)或腦部/腦缺血的情況下，或當(dāng)?shù)侥X部或CNS的氧或血流被剝奪或受急性或 慢性影響時(shí)。具體而言，具有進(jìn)入CNS并治療、預(yù)防或減輕腦缺血或中風(fēng)的能力的人單克隆 抗體的使用和應(yīng)用將是期望的。本發(fā)明針對的正是該目標(biāo)的完成。
[0021] 本文參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)所述文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0022] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及在CNS中具有特定有效性的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑包含選自IgM亞型 的抗體、其活性片段、其單體、其激動劑及其組合的物質(zhì)。本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑或抗體具有 以下一個(gè)或多個(gè)特征：它們保護(hù)和/或穩(wěn)定神經(jīng)元；它們靶向CNS或神經(jīng)細(xì)胞損害、受損 (compromise)或損傷的部位；它們減少或阻止細(xì)胞死亡，例如過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，所述藥劑，特別是神經(jīng)元結(jié)合單克隆抗體是有效的，且可應(yīng)用或 用于治療和減輕中風(fēng)和缺血，特別是腦缺血，和其中涉及或已經(jīng)發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞或腦的缺血 或缺氧的病況。
[0023] 本發(fā)明提供神經(jīng)元結(jié)合單克隆抗體，其具有促進(jìn)神經(jīng)突延伸、以在神經(jīng)再生中起 作用和/或保護(hù)神經(jīng)元免受損害以及用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的診斷和治療目的的能力。本研究 證明，當(dāng)將神經(jīng)元結(jié)合單克隆抗體、特別是抗體IgM12 rHIgM12施用于中風(fēng)之后的動物（在 這種情況下，用于誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)的動物模型）時(shí)，其導(dǎo)致動物功能的明顯改善并保護(hù)組 織完整性。
[0024] 具體而言，提供特異性重組抗體，其中所述抗體識別并能夠結(jié)合神經(jīng)元，包括皮質(zhì) 神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且在中風(fēng)、缺血病況或神經(jīng)細(xì)胞 或小膠質(zhì)細(xì)胞缺血或缺氧事件中或之后，其靶向并介導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)細(xì)胞。本文提供重組 完全人抗體。本發(fā)明的抗體在與神經(jīng)受損、損害或損傷有關(guān)的病況或疾病中具有診斷和治 療用途。
[0025] 在一個(gè)總體方面，本發(fā)明提供針對且能夠結(jié)合神經(jīng)元上的一個(gè)或多個(gè)表位的抗 體，所述神經(jīng)元包括皮質(zhì)神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。在一個(gè) 大的方面，本發(fā)明提供分離的特異性結(jié)合成員（binding member)，特別是抗體或其片段， 包括識別、結(jié)合和/或靶向神經(jīng)元的重組人抗體。本發(fā)明提供特異性結(jié)合神經(jīng)元和保護(hù) 神經(jīng)元免于細(xì)胞死亡并且不會促進(jìn)髓鞘再生的抗體，特別是人抗體，特別是IgM抗體。本 發(fā)明的抗體應(yīng)用于治療或減輕其中神經(jīng)受損、損傷或損害或處于受損、損傷或損害風(fēng)險(xiǎn)的 哺乳動物的疾病或病況，包括應(yīng)用于脊髓損傷（SCI)、創(chuàng)傷性腦損傷（TBI)、肌萎縮性側(cè)索 硬化（ALS)、多發(fā)性硬化（MS)、阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease)、中風(fēng)、帕金森病 (Parkinson's disease)、亨廷頓舞蹈?。℉untington's disease)、產(chǎn)前缺氧/圍產(chǎn)期缺血、 大腦性麻痹、腦病、脊髓病或運(yùn)動神經(jīng)元疾病，并且特別應(yīng)用于神經(jīng)元和這些疾病中神經(jīng)能 力的保護(hù)、存活或維持。
[0026] 在一個(gè)具體方面，本發(fā)明的抗體或其組合物可用且應(yīng)用于中風(fēng)和腦缺血中。在一 個(gè)具體方面，本發(fā)明的抗體或組合物可用于其中到腦部的血流和/或氧不足以滿足代謝需 求或其中對腦部的創(chuàng)傷性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元和相關(guān)細(xì)胞的死亡或損傷或死亡或損傷風(fēng)險(xiǎn)的 病況。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供抗體或其片段，其是抗體12或42,特別是血清來源的或 重組的IgM12或IgM42。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供包含圖5和/或圖6中所示的可變區(qū)⑶R序 列的重組或合成神經(jīng)元結(jié)合抗體。抗體12包含圖5中所示的重鏈CDR序列 CDR1 GGSVSLVY (SEQ ID N0 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ^ ID NO 32： 和 CDR3 ARSAS 丨 RGWFD (SEOID 吣調(diào)..及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSlSSY (SEQ IDNO.:判、CDR2 AAS (SEQ ID NO;35；和 CDR3 QQSWTPW (SEQ IO NO:36)?？贵w 42 包含圖 6 中所示的 重鏈 CDR 序列 CDR1 GFTFSTYA (SK! ID NO: 3打、C0R2 INVC5GVII (SEQ ID NO38)和 CDR3 VRRSGFDRNSSPADF (8EQ l〇 NO^35}及輕鏈 CDR 序列 CDW QGIG《SEQ D NO..爾、 CDR2 TTS 丨+SEO ID NOW)和C0R3 QKYNSAPRf (SEQ ID NO..銷。因此，以本文鑒定的抗體的 CDR 為基礎(chǔ)的重組抗體可用于靶向和保護(hù)神經(jīng)元，特別是疾病或癌癥中的易感、受損、損傷或損 害的神經(jīng)元。
[0028] 本發(fā)明因此提供特異性結(jié)合神經(jīng)元和保護(hù)神經(jīng)元免于細(xì)胞死亡并且不會促進(jìn) 髓鞘再生的分離的人IgM抗體或其片段，其中抗體或片段包含：(a)圖5所示的可變重 鏈氨基酸⑶R 結(jié)構(gòu)域序列 CDm GGSVSIYY (SEQ ID NO:31)、CD?2 GYI+YSSGST (SEQ ? NO:· 和 CDW ARSASIRGWFD (SM D Nft33)及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEO ID?.:制)、 CDR2 AAS (SEOID NO:?!和 CDR3 QOSYHTPW (SEQ ID W:3Q ;或（b)圖 6 所示的可變重鏈 氨基酸⑶R 結(jié)構(gòu)域序列 CDR1 證了rtyMseq 3D 37丨、CDR2 IWGGVTT {SEQ ID NO:38| 和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID N0.39j 和輕鏈 CDR 序列 CDR1 QGIG (SEOIO NO ]、 core TTS {SEQ ID ΝΟι.41;·和CDFQCWYN&APRT (SEQ ID NO: 42丨，以用于治療或減輕其中神經(jīng)受損、 損傷或損害或處于受損、損傷或損害風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動物的疾病或病況。
[0029] 在更具體的方面，本發(fā)明的抗體包含包括圖5和/或圖6所示的抗體12或42的 氨基酸序列。本發(fā)明的重組抗體IgM12包含圖5所示的可變重鏈序列（SEQ ID NO: 1)和輕 鏈序列（SEQ ID N0:11)。本發(fā)明的重組抗體IgM42包含圖6所示的可變重鏈序列（SEQ ID NO: 17)和輕鏈序列（SEQ ID N0:27)。在本發(fā)明的具體方面，重組抗體是包含人重鏈可變區(qū)、 恒定區(qū)和人J鏈的完全人重組抗體。本文提供完全人重組IgM12抗體，其包含圖5所示的 人免疫球蛋白重鏈（包含可變區(qū)（SEQ ID NO: 1)或其CDR)、人恒定區(qū)、特別是κ序列（SEQ IDN0:3、5、7和9)和人J鏈（SEQIDN0:15)。
[0030] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的抗體或其能夠結(jié)合抗原的片段，其中所述抗體 或其片段包含含有基本如本文或圖6中所示的氨基酸序列的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明提 供能夠結(jié)合神經(jīng)元的分離的人抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區(qū)（SEQ ID N0:17)或其CDR和輕鏈可變區(qū)（SEQ ID N0:27)或其CDR，或包含基本如本文或圖6中 所示的氨基酸序列。
[0031] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的完全人抗體或其能夠結(jié)合抗原的片段，其中 所述抗體或其片段包含含有基本如本文和圖5中所示的氨基酸序列的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。本發(fā)明提供能夠結(jié)合神經(jīng)元的分離的完全人抗體或其片段，其中所述抗體或其片段 包含重鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 1)或其⑶R及輕鏈可變區(qū)（SEQ ID NO: 11)或其⑶R，或包 含基本如本文和圖5中所示的氨基酸序列。本發(fā)明特別提供分離的人IgM抗體或其活 性片段，其包含圖5所示的可變重鏈氨基酸⑶R結(jié)構(gòu)域序列CDR! GGSVSLW (SEOID NO:31! 、C0R2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASiRGWFD (S+EQ _0 NO:33)及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEQ IDNO： 3IJ > CDR2 MS {SEQ D N0:% 和 C.DR3. QQSWTPW (SEO ID NO:36)。在 一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供分離的完全人重組IgM抗體或其活性片段，其包含可變重 鏈氨基酸 CDR 結(jié)構(gòu)域序列 CDm GGS辟LYY (SEO ID NO:31 丨、CDR2 GYiYSSGST (SEQ ID NO:32：| 和 CDR3 ARSASIRGWFD {SEQ ID NO 33丨及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QSISSY (SEQ 丨DW 3$、 CDR2MS 丨SEQ ID N0.35丨和 CDR3 QQSWiPW {.SEQ O NO:：?)、人恒定區(qū)和 SEQ ID NO: 15 所示的 人J鏈序列。
[0032] 在其他方面，本發(fā)明提供包含編碼上述神經(jīng)元結(jié)合多肽或抗體的序列的分離的 核酸和制備本發(fā)明的多肽或抗體的方法，所述方法包括在引起所述多肽或抗體表達(dá)的條 件下表達(dá)所述核酸，并回收多肽或抗體。在一個(gè)此類方面，提供編碼具有圖5或圖6所示 的氨基酸序列的抗體可變區(qū)序列的核酸或提供具有圖5或圖6所示的CDR結(jié)構(gòu)域序列的 抗體。在一個(gè)方面，提供包含圖5或圖6的核酸序列的核酸。在又一個(gè)方面，提供編碼 圖5或圖6所示的重鏈可變區(qū)VH或輕鏈可變區(qū)VL的核酸。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明抗 體的重組DNA分子或克隆基因或其簡并變體；優(yōu)選核酸分子，特別是編碼抗體VH和VL、 特別是⑶R區(qū)序列的重組DNA分子或克隆基因，其具有圖5或圖6所示序列或能夠編碼 圖5或圖6所示序列。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供編碼IgM12的重鏈（SEQ ID N0:2)和輕 鏈可變區(qū)序列（SEQ ID N0:12)的核酸，以及編碼IgM42的重鏈（SEQ ID N0:18)和輕鏈 可變區(qū)序列（SEQ ID N0:28)的核酸。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供核酸，其編碼包含可變 重鏈氨基酸 CDR 結(jié)構(gòu)域序列 CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID N0:31丨.、CDR2 GYiYSSGST (SEQ ID 和① R3 ARSASIRGWFD (SEQ ID N0.33)及輕鏈 CDR 序列 CDfi1 OSISSY (SEO ID?.. 34}、 CDfS AAS (SM ID NCWS和CDR3 QQSYHWW既(2丨D NO 3?的抗體或其片段。在又一個(gè)方面， 核酸還編碼人恒定區(qū)和人J鏈，特別是SEQ ID NO: 15的J鏈。在本發(fā)明的一個(gè)方面， 提供核酸，其編碼包含可變重鏈氨基酸⑶R結(jié)構(gòu)域序列CDR1 GFTFSTYA (SEO ID NO: 37) 、GDR2 INVGSVTT (SEQ ID ?;38丨和 CDRS VRRSGP+D側(cè)SSPADF {SEQ 丨D NO:39丨及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QGIG{SEQ ID NO: )、CDR2 TTS {SEO O NCH1)和 CDR3 OKYNSAPRT (SE0I.D ?312 丨的抗體或 其片段。在又一個(gè)方面，核酸還編碼人恒定區(qū)和人J鏈，特別是SEQ ID NO: 15的J鏈。
[0033] 包含本發(fā)明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體可用于治療、預(yù)防或診斷人 或動物體的方法，例如哺乳動物中的神經(jīng)保護(hù)方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有 效量的本發(fā)明的抗體、其片段和重組抗體。包含本發(fā)明的⑶R結(jié)構(gòu)域序列的重組抗體或其 片段可用于哺乳動物中的神經(jīng)保護(hù)方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的本發(fā) 明的抗體、其片段和重組抗體。
[0034] 本發(fā)明的藥劑，特別是重組抗體或其片段可在預(yù)防、治療或減輕能夠、可能或的確 導(dǎo)致CNS損傷的神經(jīng)損傷、損害或受損和并發(fā)癥的方法中用作神經(jīng)保護(hù)劑。當(dāng)涉及或關(guān)聯(lián) 神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)、功能或存活喪失（包括腦損傷或創(chuàng)傷、脊髓損傷（SCI)、神經(jīng)損傷、頭損傷、 其中腦供血減少或受損的病況、腦感染性疾病、神經(jīng)變性疾病）時(shí)，本發(fā)明的治療或預(yù)防方 法是可適用的。根據(jù)本發(fā)明的方法治療、預(yù)防或減輕的示例性的此類疾病或病況包括脊髓 損傷（SCI)、創(chuàng)傷性腦損傷（TBI)、肌萎縮性側(cè)索硬化（ALS)、多發(fā)性硬化（MS)、阿爾茨海默 病、中風(fēng)、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、產(chǎn)前缺氧/圍產(chǎn)期缺血和/或大腦性麻痹、腦病、脊髓病 和運(yùn)動神經(jīng)元疾病。本發(fā)明因此涉及治療或減輕其中神經(jīng)受損、損傷或損害的哺乳動物中 或者其中神經(jīng)或神經(jīng)元易于受損、損傷或損害或者有受損、損傷或損害風(fēng)險(xiǎn)的情形中的疾 病或病況的方法，所述方法包括施用選自IgM12和IgM42的重組抗體或完全人抗體或其片 段。
[0035] 在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，包含根據(jù)本發(fā)明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組 抗體，可以用于方法中或以組合物施用以治療或減輕中風(fēng)或腦缺血。在本發(fā)明的一個(gè)具 體方面，包含根據(jù)本發(fā)明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體，可以用于方法中或以 組合物施用以治療或減輕中風(fēng)。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，包含根據(jù)本發(fā)明的可變區(qū)序 列的抗體、其片段和重組抗體，可以用于方法中或以組合物施用以治療或減輕腦缺血。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含根據(jù)本發(fā)明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體，可 以用于方法中或以組合物施用以改善病況諸如中風(fēng)中的運(yùn)動功能。包含根據(jù)本發(fā)明的可 變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體，可以用于方法中或以組合物施用以改善患有或疑 似患有中風(fēng)的動物中的運(yùn)動功能。包含根據(jù)本發(fā)明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組 抗體，可以用于方法中或以組合物施用以改善已經(jīng)具有中風(fēng)或具有腦缺血的動物中的運(yùn) 動功能。在一個(gè)具體方面，如圖5中所示，包含重鏈CDR序列CDR1 GGSVSLYY(SEQ ID N0.31j 、CDR2 GYIYSSGST (SE-Q ID NO:32)和 GDR3 ARSASiRGWFD 〖SEQ ID ?.以及輕鏈 CDR 序列 CDW QSISSY (SEO ?NO.:34)、CDR2 MS {SEO ID NO:35)和 CDFQCMSWfPVV (SEOO NO:36)的 IgM12、 rIgM12、抗體12用于治療、預(yù)防或減輕中風(fēng)或腦缺血。在其一個(gè)方面，包含根據(jù)本發(fā)明的可 變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體可以在其中確定、懷疑中風(fēng)和/或腦缺血或處于中風(fēng) 和/或腦缺血的風(fēng)險(xiǎn)的情況下，包括其中可以施用或利用酶促溶栓劑，諸如組織纖溶酶原 激活劑（TPA)或其他溶栓劑或抗血栓形成劑的情況下，進(jìn)行施用。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，在其中神經(jīng)受損、損傷或損害的情況、疾病或病況中或者在 其中神經(jīng)或神經(jīng)元易于受損、損傷或損害或者有受損、損傷或損害風(fēng)險(xiǎn)的情形下，包含本發(fā) 明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體可用于方法中或以組合物施用以改進(jìn)或穩(wěn)定神 經(jīng)功能或運(yùn)動功能。在一個(gè)具體方面，抗體或其片段在疾病、創(chuàng)傷或病況的早期或初始階段 使用或施用，或在疾病、創(chuàng)傷或病況的進(jìn)程或持續(xù)時(shí)間內(nèi)重復(fù)，以利于或維持神經(jīng)系統(tǒng)功能 或運(yùn)動功能的改進(jìn)或穩(wěn)定，包括或選自運(yùn)動（例如步行）或認(rèn)知功能（例如回憶或識別）。
[0037] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，包含根據(jù)本發(fā)明的可變區(qū)序列的抗體、其片段和重組抗體 可用于方法中或以組合物施用以減緩或減輕中風(fēng)或腦缺血事件中的神經(jīng)影響、缺陷、損害 或神經(jīng)元細(xì)胞死亡。根據(jù)該方法，所述抗體減輕一種或多種功能或可評價(jià)的神經(jīng)或運(yùn)動參 數(shù)，包括可評估的或可量的參數(shù)例如中風(fēng)量表（scale)或功能量表?？贵w的施用有效改善 或減輕一種或多種與中風(fēng)相關(guān)的癥狀或參數(shù)，包括例如，上下肢運(yùn)動功能、肢體共濟(jì)失調(diào)、 感覺功能、語言、聲音清晰度、注意力、注視和視覺功能、手臂、手和腿部力量和運(yùn)動中的一 種或多種。
[0038] 本發(fā)明的方法可包括施用多于一種抗體或片段，包括抗體IgM12和42的 組合。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供包括施用一種或多種抗體或其片段的方法，其 中抗體包含（a)可變重鏈氨基酸⑶R結(jié)構(gòu)域序列CDR1 GGSVSLYY丨SEQ ID N0:31}、 CDR2 GY1YSSGST |SEQ IO NO:32)和 COR3 ARSASlRGWFO {SEQ D 嶋:夠及輕鏈 CDR 序列 CDR1 QS丨SSY (SEQ IDNO 34)、CDR2 WS pEQ IO NO:36)和 CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID M0.3S),或（b)可 變重鏈氨基酸 CDR 結(jié)構(gòu)域序列 CDR1 GFTFSTOMSEQ 丨D NO: 37]、CDR2 胸VG.GVTT (SEQ 10 ?5:38》 和 CDR3 VRRSGPDRNSSPAOF {SEQ ID NO.獨(dú)及輕鏈 CDR 序列 CDRI QGIGpEOIDNO:蝴、 CDR2 TTS (SEQ ?0 N0:41 丨和 CDR3 OKYNSAPRT (SEQ 丨D NO: β)。在又一個(gè)此類方法中，抗體 IgM12 和/或抗體IgM42的一種或多種可與另一種CNS活性抗體組合，特別包括抗體rHIgM22和 /或rHIgM46的一種或多種。rHIgM22抗體包含SEQ ID N0:43和44所示氨基酸序列，或 這些SEQ ID的CDR。rHIgM46抗體包含SEQ ID NO: 45和46所示氨基酸序列，或這些SEQ ID的⑶R。因此，抗體IgM12和/或抗體IgM42的一種或多種可與一種或多種包含以下 的髓鞘再生抗體組合：（a)包含CDRl序列SSGMH、CDR2序列V師SYDGSRKYYADSVKG和CDR3 序列GVTGSPTLDY的重鏈可變區(qū)CDR及包含CDRl序列SGSSSNiGNNFVS、CDR2序列DfTKRPS 和CDR3序列G(E丨TWDSSLSAV V的輕鏈可變區(qū)CDR ;或（b)包含CDRl序列SGFTFSSYW、 CDR2序列丨KKDGSEK和CDR3序列ARPfCGGDCYLPWYFD的重鏈可變區(qū)CDR及包含CDRl序列 QSVLYSSNNKNY、CDR2序列YWAS和CDR3序列QQYYNTPQA的輕鏈可變區(qū)CDR。抗體的組合 可在不同的時(shí)間和以不同的量或濃度共同或連續(xù)施用。可使用雙特異性或多特異性抗體。 在一個(gè)具體此類方面，通過聯(lián)合施用或通過相隔短的持續(xù)時(shí)間或較長持續(xù)時(shí)間（包括數(shù)小 時(shí)、數(shù)天或數(shù)周）的連續(xù)施用，將抗體12和/或42與抗體22和/或46和/或具有IgM22 或IgM46的⑶R區(qū)⑶RU OTR2和⑶R3序列的抗體組合施用。在一個(gè)此類具體方面，通過聯(lián) 合或連續(xù)施用，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合施用用于治療或減輕涉及神 經(jīng)變性的疾病或病況，特別包括脫髓鞘。在又一個(gè)此類方面，通過聯(lián)合或連續(xù)施用，將抗體 12和/或42與抗體22和/或46組合施用用于治療或減輕脫髓鞘疾病或病況。在一個(gè)具 體方面，通過聯(lián)合或連續(xù)施用，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合施用用于治療 或減輕多發(fā)性硬化。在一個(gè)此類方面，在MS疾病的可測量臨床方面，實(shí)現(xiàn)髓鞘再生和神經(jīng) 保護(hù)的聯(lián)合作用，包括協(xié)同作用。
[0039] 鑒于本發(fā)明藥劑的神經(jīng)保護(hù)和/或神經(jīng)再生能力，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生和刺激神經(jīng) 元增殖的體外方法，包括皮質(zhì)神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增 殖。此類增殖的神經(jīng)元可適于移植和神經(jīng)細(xì)胞治療方案和方法。
[0040] 本發(fā)明的診斷效用延伸到本發(fā)明的抗體在表征CNS神經(jīng)損傷或損害或者篩查或 評價(jià)涉及神經(jīng)損傷、損害或死亡（包括壞死性或凋亡性死亡）的疾病或病況的測定法和方 法中的用途，包括體外和體內(nèi)診斷和成像測定法。因此，所述抗體可用于測定和方法中以評 價(jià)中風(fēng)或缺血和/或評估缺血或中風(fēng)或預(yù)測的或懷疑的缺血或中風(fēng)后的損傷。在免疫測定 中，可制備控制量的抗體等，并用酶、特異性結(jié)合配偶體、配體、染料、熒光標(biāo)簽和/或放射 性元素標(biāo)記抗體，然后可引入細(xì)胞樣品中。在標(biāo)記材料或其結(jié)合配偶體有機(jī)會與樣品中的 部位起反應(yīng)后，所得質(zhì)量可通過已知技術(shù)檢查，這隨所連接的標(biāo)記的性質(zhì)而變化。在體內(nèi) 診斷或成像應(yīng)用中，可制備抗體或其神經(jīng)元結(jié)合片段，并用酶、特異性結(jié)合配偶體、配體、染 料、熒光標(biāo)簽和/或放射性元素標(biāo)記所述抗體或其神經(jīng)元結(jié)合片段，然后可引入動物中。在 標(biāo)記材料或其結(jié)合配偶體有機(jī)會與動物內(nèi)的部位起反應(yīng)后，可通過已知技術(shù)檢查動物，這 隨所連接的標(biāo)記的性質(zhì)而變化。在本發(fā)明的診斷效用的方面，本發(fā)明的抗體或其活性片段 可用于測定和方法中以表征腦缺血或中風(fēng)。具體而言，在其中疑似腦缺血或中風(fēng)或有腦缺 血或中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的情況下，本發(fā)明的抗體可用于確定或評價(jià)腦缺血和或/中風(fēng)。
[0041] 放射性標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，特別是抗體及其片段，可用于體外診斷技術(shù)和體 內(nèi)放射性成像技術(shù)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，放射性標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，特別是抗體及 其片段，特別是放射性免疫綴合物，可用于放射性免疫療法，特別作為用于神經(jīng)損傷修復(fù)、 神經(jīng)再生、神經(jīng)變性恢復(fù)、癌癥或CNS腫瘤療法的放射性標(biāo)記的抗體，或在某些情況下備選 地用于受損害神經(jīng)組織或神經(jīng)元的切除。在體內(nèi)方面，抗體或其神經(jīng)元結(jié)合片段是標(biāo)記的， 并在手術(shù)或手術(shù)技術(shù)（包括立體定向術(shù)或最小侵入性技術(shù)）之前、期間或之后施用于動物， 用于定位神經(jīng)損傷或評價(jià)其余受損害或受損傷的神經(jīng)組織的目的。在一個(gè)此類方面，放射 性標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，特別是抗體及其片段，可用于放射免疫導(dǎo)向手術(shù)技術(shù)，其中它們 可在靶向、鑒定或除去此類細(xì)胞的手術(shù)之前、期間或之后，鑒定和表明受損、受損害、受損傷 或?yàn)l死神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元或神經(jīng)組織的存在情況和/或位置。
[0042] 免疫綴合物或抗體融合蛋白包括在本發(fā)明中，其中本發(fā)明的特異性結(jié)合成員，特 別是抗體及其片段，與其他分子或藥劑綴合或連接，其進(jìn)一步包括但不限于與神經(jīng)活性藥 物、化學(xué)消融劑、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性劑、化療劑或藥物綴合的結(jié)合成員。 [0043] 本發(fā)明包括可以試驗(yàn)試劑盒的形式制備的測定系統(tǒng)，其用于定量分析例如受損 害、受損或受損傷神經(jīng)元的存在程度或定量測定樣品中的神經(jīng)元。系統(tǒng)或試驗(yàn)試劑盒可包 括通過本文所述的放射性技術(shù)和/或酶技術(shù)之一，使標(biāo)記與抗體偶聯(lián)而制備的標(biāo)記組分， 以及一種或多種其他的免疫化學(xué)試劑，任選其中至少一種是游離或固定的組分或其結(jié)合配 偶體。
[0044] 可在藥物組合物中制備本發(fā)明的抗體，且在一個(gè)具體的實(shí)施方案中為包含本文圖 5和圖6提供的重鏈和/或輕鏈序列的重組抗體，或其活性片段和來源于其中、特別包含圖 5和圖6所述CDR區(qū)序列的單鏈、重組或合成抗體，所述藥物組合物包括合適的媒介物、載 體或稀釋劑，用于在其中療法是適宜的情況下施用，以例如治療或減輕涉及神經(jīng)元受損、損 害、損傷或死亡的病況或疾病。此類藥物組合物還可包括通過本領(lǐng)域已知方法（諸如聚乙 二醇化）調(diào)節(jié)抗體或片段的半衰期的方法。此類藥物組合物還可包含其他抗體或治療劑。
[0045] 本發(fā)明還包括與其他分子或藥劑共價(jià)連接或以其他方式結(jié)合的抗體及其片段。 這些其他分子或藥劑包括但不限于具有截然不同的識別特征的分子（包括抗體或抗體片 段）、毒素、配體、神經(jīng)活性劑和化療劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體或片段可用來靶向或 導(dǎo)向治療分子或其他藥劑，例如使分子或藥劑靶向神經(jīng)元，例如靶向皮質(zhì)神經(jīng)元、海馬神經(jīng) 元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或小腦顆粒細(xì)胞，包括傷口部位、缺血部位、腫瘤部位、炎癥區(qū)域或神 經(jīng)變性病灶。本發(fā)明的抗體或片段可用于靶向或引導(dǎo)治療性分子或其他藥劑，例如將分子 或藥劑靶向至腦缺血或中風(fēng)的部位。
[0046] 從接下來的參照下列說明性附圖和隨附權(quán)利要求書進(jìn)行的詳述來看，其他目的和 優(yōu)勢對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。
[0047] 附圖簡沭 圖1 :人IgM與多種類型的神經(jīng)元表面結(jié)合。sHIgM42 (A)和rHIgM12 (C)與共表達(dá)神 經(jīng)絲（NF) (B和D)的活的皮質(zhì)神經(jīng)元表面結(jié)合。在培養(yǎng)基中與10 μ g/ml IgM孵育10分 鐘過程內(nèi)，將細(xì)胞保持在冰上。將細(xì)胞固定，洗滌，用抗人μ鏈Fab'2-FITC第二Ab檢測人 IgM。內(nèi)部NF以特有的節(jié)段模式存在。使皮質(zhì)細(xì)胞在聚鳥氨酸包被的蓋玻片上的神經(jīng)基礎(chǔ) B27培養(yǎng)基中生長6天。并非所有的皮質(zhì)神經(jīng)元均表達(dá)NF，但是IgM與培養(yǎng)物中的所有神 經(jīng)元結(jié)合。rHIgM12 (E綠色）和sHIgM42 (F綠色）與共表達(dá)神經(jīng)絲（NF，紅色）的活的小 鼠海馬神經(jīng)元表面結(jié)合。使海馬神經(jīng)元在聚賴氨酸包被塑料上的神經(jīng)基礎(chǔ)B27培養(yǎng)基中生 長1周。使自人顳葉切除而分離的細(xì)胞在DMEM/F12/N2/B27中生長21天。rHIgM12與也是 β III微管蛋白陽性（F，得自Promega的抗β III)的細(xì)胞表面結(jié)合（G)。
[0048] 圖2.人IgM以截然不同的模式標(biāo)記小腦顆粒細(xì)胞表面。使在培養(yǎng)1天的大鼠小 腦顆粒細(xì)胞與10 Kg/ml人血清來源的IgM、sHIgM12或sHIgM42在培養(yǎng)基中在冰上活著孵 育15分鐘。在用4%低聚甲醛洗滌和固定后，使細(xì)胞在室溫下與FITC綴合的抗人μ鏈抗體 一起孵育，并使用免疫熒光顯微鏡成像。使用這兩種抗體的神經(jīng)元膜標(biāo)記的模式不同。神 經(jīng)突膜的短區(qū)被sHIgM12結(jié)合，導(dǎo)致清楚的點(diǎn)狀模式。神經(jīng)突膜的較大區(qū)被sHIgM42結(jié)合， 導(dǎo)致節(jié)段模式。放大倍數(shù)為400x。
[0049] 圖3.神經(jīng)元結(jié)合性人IgM、rHIgM12和sHIgM42保護(hù)培養(yǎng)中的皮質(zhì)神經(jīng)元免于過 氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。培養(yǎng)3天的小鼠神經(jīng)元用含或不含10 Pg/ml人IgM的500 nM H2O2 或鹽水處理30分鐘。細(xì)胞用新鮮的神經(jīng)基礎(chǔ)B27培養(yǎng)基洗滌，24小時(shí)后，使用FLICA胱天 蛋白酶-3測定試劑盒（Immunochemistry Technologies 935)，檢測一式三份處理的96孔 中胱天蛋白酶-3的表達(dá)。條形柱表示免于胱天蛋白酶3活化的保護(hù)％。
[0050] 圖4表示用于產(chǎn)生重組抗體的可擴(kuò)增載體。這是用于產(chǎn)生基于sHIgM22 (rHIgM22)的重組抗體的載體圖，該載體經(jīng)修飾以產(chǎn)生重組IgM12和IgM42。對于在CHO細(xì) 胞中表達(dá)，VH啟動子用ElA啟動子置換。CX輕鏈恒定區(qū)用κ輕鏈恒定區(qū)C κ置換。
[0051] 圖5表示重組載體中的IgM12抗體氨基酸和核酸序列。重鏈氨基酸序列和編碼核 酸序列呈灰色，提供并標(biāo)出Vh的每一個(gè)和恒定區(qū)序列CHl、CH2、CH3和CH4。輕鏈氨基酸序 列和編碼核酸序列呈紫色，標(biāo)出可變VL和恒定CL (κ)序列。注釋了重鏈和輕鏈可變區(qū)的 CDR區(qū)序列。在氨基酸和核酸序列中標(biāo)示了人J鏈。
[0052] 圖6表示重組載體中的IgM42抗體氨基酸和核酸序列。重鏈氨基酸序列和編碼核 酸序列呈灰色，提供并標(biāo)出Vh的每一個(gè)和恒定區(qū)序列CHl、CH2、CH3和CH4。輕鏈氨基酸序 列和編碼核酸序列呈紫色，標(biāo)出了可變VL和恒定CL (κ)序列兩者。注釋了重鏈和輕鏈可 變區(qū)的⑶R區(qū)序列。
[0053] 圖7.重組rHIgM12改進(jìn)患TMEV誘導(dǎo)性疾病的小鼠中的缺陷。在100 Pg sHIgM12 的單一 i.p.劑量后3周，平均每小時(shí)自發(fā)性夜間活動（當(dāng)小鼠有正常活動性時(shí)）改變。在 TMEV感染后90天各組5只SJL小鼠用rHIgM12 (紅色條形柱）或?qū)φ杖薎gM (黑色條形 柱）治療，在AccuScan活動監(jiān)測箱中按組每周監(jiān)測3天。將3個(gè)夜間時(shí)段內(nèi)的每小時(shí)夜間水 平活動的平均值土 SEM與IgM治療前3個(gè)夜晚的夜間活動進(jìn)行比較。在單劑量的rHIgM12 治療后3周-7周存在與治療前水平相比夜間活動增加（P〈0. 01)，但用對照治療后無增加。 對未感染年齡匹配小鼠的運(yùn)動水平作圖用于比較（綠色條形柱）。
[0054] 圖8.在小鼠腦干采集的MRS光譜。上小圖表示從中采集信號的三維像素。定位該 目標(biāo)區(qū)域使用解剖界標(biāo)。極短MRI掃描用來獲取3個(gè)正交平面的圖像以定位腦干上的2. 5 mm3立方體（上小圖）。小鼠腦干的300MHz，IH光譜（下小圖）。容易地鑒定出膽堿（Cho)、 肌酸（Cr)和N-乙酰基-天冬氨酸（NAA)峰。光譜參照水（在4. 7 ppm)。
[0055] 圖9.腦干NAA水平降低與軸突喪失增加有關(guān)。用TMEV感染后0-270天，對10只 SJL小鼠進(jìn)行了前瞻性研究。獲得每只小鼠腦干的MRS，并測定NAA濃度（上）。在病毒感 染后90天（通過橫切面的直接計(jì)數(shù)顯示大軸突喪失的點(diǎn)），在達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性下降的所有 小鼠中記錄到NAA逐漸降低（2)。在疾病持續(xù)期間，NAA水平保持低下。未感染小鼠（黑色 條形柱）、感染后90天（灰色）和270天（白色）以T6水平計(jì)數(shù)的絕對軸突（下）。
[0056] 圖10.在單劑量的人IgM后腦干中的NAA。TMEV感染后90天，當(dāng)NAA水平開始 下降，且可檢測到大軸突喪失時(shí)，向各組10-15只SJL小鼠 i.p.施用單次100 Pg劑量的 SHIgM12、sHIgM42、對照人IgM或鹽水（PBS)。在治療前和治療后5周和10周，收集腦干的 MRS。由這些光譜計(jì)算NAA水平。在sHIgM12和sHIgM42治療組中，與治療前水平相比，NAA 在5周后（P=0. 005, P=O. 029)和在10周（P〈0. 001，P=O. 037)增加。在用對照試劑治療的 各組小鼠中是穩(wěn)定的或趨于向下。該圖表示腦干三維像素 NAA水平的平均值+/-SEM。
[0057] 圖11.與神經(jīng)元結(jié)合的人IgM不改變脫髓鞘、髓鞘再生或炎癥。各組5只慢性 TMEV感染小鼠用單次100 Pg劑量的人IgM治療。在治療后10周，所有組包括相同程度的 脊髓炎癥（黑色條形柱）和脫髓鞘（紅色條形柱）。如所預(yù)期的一樣，用少突膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合 性IgM、rHIgM22治療的小鼠，顯示較多髓鞘再生（綠色條形柱）。sHIgM12和sHIgM42不促 進(jìn)脊髓髓鞘再生。這表明體內(nèi)有保護(hù)軸突的多種方式。
[0058] 圖12.靜脈內(nèi)注射后⑶-1小鼠循環(huán)中的神經(jīng)元結(jié)合性人IgM的血清半衰期。夾 心ELISA用來定量測定48小時(shí)內(nèi)小鼠血清的人μ鏈的衰變。堿性磷酸酶底物（Sigma 104) 的0D405平均值獲自該方法。繪制每組3只小鼠的血清和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0059] 圖13. 35S標(biāo)記的rHIgMl2進(jìn)入TMEV感染和未感染SJL小鼠的腦和脊髓。將35S 標(biāo)記的rHIgM12 i.p.施用于5個(gè)月TMEV感染的和年齡匹配的未感染SJL小鼠。4小時(shí)后， 一對小鼠用鹽水灌注，急速收獲組織，稱重，用剃刀切碎，并與10 ml閃爍液（Ultima Gold LSC)混合。在24小時(shí)時(shí)重復(fù)相同步驟。48小時(shí)后，使組織增溶，將小瓶在Beckman閃爍計(jì) 數(shù)器中計(jì)數(shù)1分鐘。對每只小鼠的全腦和脊髓總計(jì)數(shù)繪圖。小瓶中無組織的背景計(jì)數(shù)為12 個(gè)計(jì)數(shù)。
[0060] 圖14.神經(jīng)元結(jié)合性人IgM體內(nèi)靶向脊髓病變。向患慢性TMEV誘導(dǎo)的脊髓脫髓 鞘的小鼠腹膜內(nèi)施用1.0 mg sHIgM42 (A)、rHIgM12 (B)或?qū)φ杖藛慰寺gM (C)。4小時(shí) 后，小鼠用4%低聚甲醛灌注，取出脊髓，冷凍切片，使用針對人μ鏈的FITC綴合的Fab' 2 片段（Jackson Immnoresearch)免疫標(biāo)記。來自接受sHIgM42或rHIgM12的小鼠的脊髓在 病變中含有人IgM。病變中幾乎未發(fā)現(xiàn)對照人IgM。下小圖為Η/E染色以顯現(xiàn)炎性細(xì)胞和 病變。我們得出的結(jié)論是，在TMEV模型中某些人IgM可穿過BBB。
[0061] 圖15.神經(jīng)元結(jié)合性人IgM定位于脊髓病變中神經(jīng)絲+ (NF)軸突。向患慢性 TMEV誘導(dǎo)的脊髓脫髓鞘的小鼠腹膜內(nèi)施用1.0 mg IgM，4小時(shí)后處死。將脊髓縱向冷凍切 片，用FITC綴合的抗人μ鏈Fab' 2片段（綠色）和抗-NF (SMI-32和34,紅色）免疫標(biāo) 記，接著用TRICT綴合的第二抗體免疫標(biāo)記。合并的共聚焦圖像證實(shí)sHIgM42 (A)與長NF+ 纖維⑶共定位，在（C)中合并。rHIgM12 (D，綠色）也與NF+結(jié)構(gòu)（D，紅色）例如橫切軸 突纖維束共定位。
[0062] 圖16. rHIgM12和sHIgM42不會使EAE臨床評分變差。在每只小鼠達(dá)到1的臨床 評分（尾無力）時(shí)，向患MOG肽誘導(dǎo)的EAE的各組10只C57BL6小鼠 i. V.施用單次100 Pg 劑量的rHIgM12、sHIgM42、對照人IgM或鹽水，且每隔一天進(jìn)行監(jiān)測直到免疫后28天。圖 為每個(gè)治療組的平均臨床評分的平均值+/-SEM。平均臨床評分的秩的ANOVA (ANOVA on ranks)表明組間無差異（Ρ=0· 14)。
[0063] 圖17. rHIgM12和sHIgM42不加重EAE脊髓病理。在圖13的研究結(jié)束時(shí)，取出 脊髓，切成I mm塊，從每3個(gè)的連續(xù)塊中切取橫切面，用erichrome染色以顯現(xiàn)病理。不 知情地對10個(gè)橫切面/小鼠（40象限（quadrant))進(jìn)行分級。炎癥（P=O. 825)或脫髓鞘 (Ρ=0· 766)在組間無差異。
[0064] 圖18. rHIgM12促進(jìn)神經(jīng)突增生使Ε15海馬神經(jīng)元在聚-D-賴氨酸（PDL) (A) 或rHIgM12 (B)硝酸纖維素包被的蓋玻片上生長。接種（plating)細(xì)胞后12小時(shí),將這些 神經(jīng)元固定，并用β 3-微管蛋白抗體（Al和B1，綠色）和德克薩斯紅鬼筆環(huán)肽（A2和B2) 染色。A3-B3是A1-A2和B1-B2的重疊，其中核用DAPI (藍(lán)色）染色。C、D和E顯示總的 (C，p=0. 0056)、最長（D，p〈0. 0001)和次最長（E，p=0. 0782)神經(jīng)突長度的測量值。與具有 多個(gè)對稱神經(jīng)突的接種在對照PDL基質(zhì)上神經(jīng)元相比（72%相對于18%)，在rHIgM12上生長 的神經(jīng)元帶有較少神經(jīng)突（F，p〈0. 0001)，且大多數(shù)為3期神經(jīng)元（G)。統(tǒng)計(jì)分析顯示平均 值土 SEM (非配對t檢驗(yàn)）。
[0065] 圖19. rHIgM12驅(qū)動軸突形成海馬神經(jīng)元在接種在TOL (A)、TOL+層粘連蛋白 (B)或rHIgM12 (C)的基質(zhì)上后12小時(shí)用Taul (A1-C1，綠色）或MAP2 (A2-C2,藍(lán)色）染 色。A3-C3是Al-Cl和A2-C2的重疊，將F-肌動蛋白（紅色）用德克薩斯紅鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。 D-F顯示在通過短劃線標(biāo)示的Al-Cl中，沿自細(xì)胞體到生長錐的最長神經(jīng)突的相對Taul強(qiáng) 度。Taul染色不對稱地富集在于rHIgM12和層粘連蛋白基質(zhì)兩者中生長的3期神經(jīng)元中的 最長神經(jīng)突遠(yuǎn)部。
[0066] 圖20. rHIgM12結(jié)合識別神經(jīng)元膜在固定后，將DIV3海馬神經(jīng)元用rHIgM12、 霍亂毒素 B (CTB，Alexa Fluor 594)和菲律賓菌素三重染色（A)。rHIgM12 (Al)均勻地 標(biāo)記神經(jīng)元表面，其模式類似于分別用CTB或菲律賓菌素標(biāo)記的GMl (A2)或膽固醇（A3) 的模式。然而，用rHIgM12在37°C下處理30分鐘后，膜結(jié)合的rHIgM12在神經(jīng)元表面聚集 (B1-C1)。用rHIgM12處理導(dǎo)致膽固醇（B2)和GMl (C2)兩者的群聚，其與聚集的rHIgM12 共定位（B3-C3)。B和C底部的下小圖是方框標(biāo)示區(qū)域的更高放大倍數(shù)，表明生長錐區(qū)中聚 集的rHIgM12 (綠色）與群聚的膽固醇（藍(lán)色）或GMl (紅色）共定位。
[0067] 圖21. rHIgM12與神經(jīng)元膜微結(jié)構(gòu)域中的GMl共定位A. DIVl海馬神經(jīng)元 首先用4%低聚甲醒固定，然后經(jīng)rHIgM12染色。rHIgM12標(biāo)記較小的點(diǎn)結(jié)構(gòu)（punctum structure)。B.將活的DIVl海馬神經(jīng)元冷卻到4°C達(dá)30分鐘，然后用rHIgM12標(biāo)記，接 著用抗β-III-微管蛋白抗體染色（在固定后）。rHIgM12使神經(jīng)元表面上大得多的點(diǎn)形 成染色。C.活的DIV3海馬神經(jīng)元用甲基-β-環(huán)糊精在37°C下處理30分鐘以消耗膽固 醇，然后冷卻至4°C。固定的神經(jīng)元然后用rHIgM12 (綠色）和霍亂毒素 B (紅色）染色。 rHIgM12與較大的點(diǎn)（其與由霍亂毒素 B標(biāo)記的GMl共定位）結(jié)合。下小圖顯示方框標(biāo)示 區(qū)域的更高放大倍數(shù)。
[0068] 圖22. rHIgM12與脂筏結(jié)合使活的DIV7皮質(zhì)神經(jīng)元在4°C下與rHIgM12或?qū)φ?IgM抗體結(jié)合30分鐘。A.神經(jīng)元在抗體結(jié)合后洗滌3次，在含有0. 5% NP-40的緩沖液中 裂解。裂解物通過在4°C下微量離心分離，上清液和沉淀兩者用抗人IgM第二抗體進(jìn)行印跡 法。與不與神經(jīng)元結(jié)合并洗掉的對照IgM抗體相比，rHIgM12在沉淀和上清液兩者中均有 分布。下小圖顯示加載等量的蛋白質(zhì)的各個(gè)考馬斯染色凝膠。B.在含有1% Triton X-100 的緩沖液中裂解的神經(jīng)元在4°C下以蔗糖梯度通過超速離心分級分離。相繼針對rHIgM12、 窖蛋白-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、β3-微管蛋白（B3-Tub)和β-肌動蛋白，用特異性抗體對所得 級分進(jìn)行印跡法。rHIgM12位于含有窖蛋白-1和β 3-微管蛋白的低密度級分。較高密度 級分含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、β 3-微管蛋白和肌動蛋白。一些rHIgM12定位于去污劑不溶性沉 淀，所述沉淀主要由微管蛋白中富含的細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)成。大部分肌動蛋白進(jìn)入去污劑可 溶性較高密度級分。
[0069] 圖23. rHIgM12與微管結(jié)合A.首先將DIVl海馬神經(jīng)元在37°C下用rHIgM12處 理30分鐘，然后用含有4%低聚甲醛和0.1% Triton X-IOO的緩沖液同時(shí)固定并提取，接著 針對rHIgM12 (綠色）、β3-微管蛋白（藍(lán)色）和F-肌動蛋白（紅色）進(jìn)行染色。rHIgM12 結(jié)合去污劑不溶性分子，所述去污劑不溶性分子與沿神經(jīng)突干（neurite shaft) (A 2和4) 和在生長錐中心域的束狀微管共定位，但不與位于生長錐周圍的F-肌動蛋白共定位（A 3 和4)。B.使DIV7皮質(zhì)神經(jīng)元先結(jié)合rHIgM12,然后在0. 5% NP-40中裂解。對上清液進(jìn)行 免疫共沉淀。rHIgM12和β 3-微管蛋白兩者彼此免疫共沉淀。
[0070] 圖24.提出的rHIgM12促進(jìn)軸突形成的機(jī)制Α.神經(jīng)元膜含有筏微結(jié)構(gòu)域 (raft microdomain)和非後微結(jié)構(gòu)域（nonraft microdomain)兩種。在神經(jīng)兀膜均勻分布 的筏微結(jié)構(gòu)域分隔成兩個(gè)庫。它們之一與微管結(jié)合。B. rHIgM12的結(jié)合誘導(dǎo)筏微結(jié)構(gòu)域群 聚，這促進(jìn)了微管穩(wěn)定并錨定神經(jīng)元膜。C.在神經(jīng)突增生期間，通過與rHIgM12相互作用， 生長錐探測環(huán)境，而筏微結(jié)構(gòu)域群聚。結(jié)果，微管穩(wěn)定于rHIgM12接觸部位并錨定神經(jīng)元 膜，這促進(jìn)圖3和圖6中觀察的生長錐周圍至中心域轉(zhuǎn)換，其中浸泡施用的（bath-applied) rHIgM12在生長錐中心域聚集。
[0071] 圖25. rHIgM12不與微管蛋白直接結(jié)合A. N2A成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞用rHIgM12 (Al,綠色）和β 3-微管蛋白（A2,紅色）染色。核用DAPI (A3,藍(lán)色）標(biāo)記。N2A細(xì)胞是 rHIgM12染色陰性的，但表達(dá)β3-微管蛋白。Β.將Ν2Α細(xì)胞裂解物的上清液與rHIgM12 - 起孵育，與rHIgM12結(jié)合的分子被蛋白質(zhì)-L瓊脂糖拉下（pulled down)，并進(jìn)行Western印 跡法。rHIgM12不與沉淀結(jié)合。β 3-微管蛋白不被rHIgM12拉下，但在上清液中檢測到。
[0072] 圖26. rHIgM12拉下肌動蛋白，但不與F-肌動蛋白共定位A.在固定后，先將 DIVl活的海馬神經(jīng)元在4°C下用rHIgM12 (A1，綠色）染色，將F-肌動蛋白（A2,紅色）用 德克薩斯紅鬼筆環(huán)肽標(biāo)記。在生長錐區(qū)，F(xiàn)-肌動蛋白收縮，且在中心域富集，而rHIgM12使 生長錐表面上點(diǎn)結(jié)構(gòu)均勻染色，這就標(biāo)記了生長錐的最邊緣。B.少量肌動蛋白被rHIgM12 拉下，3種所測的抗肌動蛋白抗體無一在免疫沉淀反應(yīng)中起作用。位于與β3-微管蛋白類 似位置的條帶是用空心箭頭標(biāo)示的IgG重鏈。
[0073] 圖27 (a)細(xì)胞膜將在有數(shù)千納米孔（大小為200 nm)穿孔的薄金膜上重構(gòu)。（b) 懸浮金膜與兩側(cè)的緩沖溶液接觸。
[0074] 圖28.與神經(jīng)元結(jié)合的人抗體促進(jìn)神經(jīng)突延伸。將神經(jīng)元接種在用人IgM包被 的基質(zhì)上，使之生長24小時(shí)后，用抗神經(jīng)絲進(jìn)行免疫標(biāo)記。與非許可性人IgM (B)相比， sHIgM42誘導(dǎo)增生（A)。
[0075] 圖29.與神經(jīng)元結(jié)合的人抗體使膜結(jié)構(gòu)域群聚。在0°C下進(jìn)行體細(xì)胞（soma)和 軸突上的均勻免疫標(biāo)記（A)。當(dāng)細(xì)胞升溫至15°C達(dá)15分鐘時(shí)，sHIgM42定位在軸突細(xì)胞表 面上更多的分散斑塊上（B)。
[0076] 圖30.促進(jìn)神經(jīng)突延伸的人抗體體內(nèi)靶向損傷部位。將抗體i.p.施用于患有慢 性SCI的小鼠，4小時(shí)后取出脊髓，在脊髓橫切面中檢測人IgM。來自施用抗體的小鼠的脊 髓受損區(qū)顯示結(jié)合帶熒光標(biāo)簽的抗人IgM的平行纖維（A)。來自施用對照人IgM的小鼠的 脊髓受損區(qū)不含人IgM (B)。
[0077] 圖31.脊髓擠壓傷。顯微照片顯示來自對照小鼠（A)或8 g Fejota夾壓迫后30 天小鼠（B)的H&E染色脊髓的典型外觀。壓傷與廣泛炎性細(xì)胞浸潤、運(yùn)動神經(jīng)元喪失有關(guān)。
[0078] 圖32. TMEV感染小鼠自發(fā)性夜間活動的實(shí)例。A)在64天時(shí)間內(nèi)水平活動原始完 整記錄。多夜間活動和少晝間活動易于理解。因?yàn)樾∈笳Ｔ谝归g活動，因此我們選擇夜 間活動用于分析（6PM-6AM)。然而，通過目視檢查水平（B)或垂直（C)活動中的未過濾壓縮 記錄，可能難以鑒定真實(shí)的長期改變。
[0079] 圖33.單次i. p.劑量的神經(jīng)元結(jié)合抗體（rHIgM12)改善慢性感染SJL小鼠的水 平活動。在90dpi將3組（5只SJL小鼠）放入AccuScan活動監(jiān)測箱。在8天時(shí)間內(nèi)收 集基線測量。在治療后，在8周內(nèi)連接監(jiān)測小鼠。小圖A、C和E對應(yīng)于水平活動，B、D和F 對應(yīng)于垂直活動。A、B)作為每天的箱（bins)提供的平均夜間活動，表明僅在rHIgM12治 療組的水平活動有改善；C)高斯濾波（GB=2天）和E)標(biāo)準(zhǔn)化Z值的6階多項(xiàng)式擬合得出 rHIgM12治療小鼠中清楚明顯的改善。B、D和F)垂直活動不受任何治療影響。活動（垂直 標(biāo)度）是每小時(shí)光束中斷次數(shù)。參數(shù)GB可解釋為半高時(shí)濾波器半寬的值（以天計(jì)）。隨著 GB值增加，標(biāo)準(zhǔn)差降低。給出每天的逐點(diǎn)95%置信帶。
[0080] 圖34.通過使用預(yù)測模型值在90dpi的3種治療的比較。在治療之前和之后每天 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與對照IgM治療和鹽水治療小鼠相比,在治療后第7天（p=0. 045)和第11 天（p=0. 042)，rHIgM12治療小鼠的水平夜間活動分別顯著偏離/改善（用黑色箭標(biāo)示）。 給出每天的逐點(diǎn)95%置信帶。
[0081] 圖35.當(dāng)在疾病早期施用時(shí)rHIgM12改善SJL小鼠的水平和垂直兩種活動。在 45dpi將5只SJL小鼠3組放置在AccuScan活動監(jiān)測箱中。在8天時(shí)間內(nèi)收集基線測量。 在治療后，在8周內(nèi)連接監(jiān)測小鼠。小圖A、C、E和G對應(yīng)于水平活動，B、D、F和H對應(yīng)于垂 直活動。A、B)水平和垂直活動的原始未濾過記錄；C、D)作為每天的箱（bins)提供的平均 夜間活動；E、F)高斯濾波（GB=2天）；和G、H)標(biāo)準(zhǔn)化Z值的6階多項(xiàng)式擬合顯示rHIgM12 治療組中水平和垂直兩種活動皆改善。對照IgM治療組和鹽水治療組顯示整個(gè)研究中運(yùn)動 活動水平相似。給出每天的逐點(diǎn)95%置信帶。
[0082] 圖36.通過使用預(yù)測模型值在45dpi的3種治療的比較。在治療之前和之后每天 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。A、C)與對照IgM治療和鹽水治療小鼠相比，治療后第13天（p=0. 015)和 第9天（p=0. 036)，rHIgM12治療小鼠的水平夜間活動分別顯著偏離。B、D)治療后第14天 (ρ=0· 019)和第6天（ρ=0· 037)，rHIgM12治療小鼠的垂直（直立（rearing))活動分別偏 離/改善。黑色箭頭表示開始顯著改善的日期。給出每天的逐點(diǎn)95%置信帶。
[0083] 圖37.正常未感染SJL小鼠具有不受任何治療影響的高度可變的自發(fā)活動。將5 只未感染SJL小鼠3組放入AccuScan活動監(jiān)測箱。在8天時(shí)間內(nèi)收集基線測量。在治療 后，在8周內(nèi)連接監(jiān)測小鼠。任何治療都不引起水平（A、C、E和G)或垂直（B、D、F和H)活 動改變。給出每天的逐點(diǎn)95%置信帶。
[0084] 圖38.單劑量的人抗體延長SODl G86R突變體轉(zhuǎn)基因小鼠的存活。在55日齡時(shí)， 小鼠用單劑量的rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。跟蹤小鼠直到漸死,然后處死用 于病理學(xué)。一些小鼠死于疾病。所有小鼠在死亡前都有極度的體重減輕。使用Kaplan-Meir 曲線繪制存活率，使用非參數(shù)Mantel-Cox檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。與PBS治療或未治療小鼠 相比，用rHIgM12治療的小鼠中存活率提高，P=O. 008。所有分析和治療以不知情方式進(jìn)行， 使得做出處死小鼠決定的研究人員不了解治療組。在該分析中研究了共45只小鼠。同窩 野生型SOD +/+小鼠具有正常的存活率且無體重減輕（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0085] 圖39表示在50日齡時(shí)施用單次200 Pg劑量的rHIgM12的小鼠與施用PBS的對 照小鼠中，G86R SODl小鼠的體重減輕作為時(shí)間的函數(shù)。施用rHIgM12的小鼠顯示在單次 抗體注射后，在60天時(shí)間內(nèi)較少體重減輕。
[0086] 圖40. SODl G86R突變體轉(zhuǎn)基因小鼠中單劑量的人抗體減少脊髓軸突變性。在55 日齡時(shí)，小鼠用單次250 μ g劑量的rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。在位于胸正 中水平的脊髓中，統(tǒng)計(jì)變性軸突特有的髓磷脂螺環(huán)（whorl)的數(shù)目。與PBS治療（P=O. 003， T檢驗(yàn)）和未治療小鼠相比，用rHIgM12治療的SODl突變體小鼠的變性軸突數(shù)減少。注意， 與SODl+/+突變體小鼠相比，野生型SOD-/-小鼠脊髓中的變性軸突數(shù)最少。在處死時(shí)，小 鼠用Trump固定液（4%甲醒，0· 1%戊二醒（gluataraldehyde))灌注，將脊髓切成Imm塊。 將塊包埋在Araldite塑料中，將來自T6水平的1微米切片用對苯二胺染色以顯現(xiàn)髓磷脂 環(huán)繞（wrapping)。顯示野生型SOD-/-(右上）和SODl+/+突變體（右下）的脊髓切片。 [0087] 圖41.單劑量的人抗體保護(hù)SODl G86R突變體轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中的前角和后角 神經(jīng)元兩者。在55日齡時(shí)，小鼠用rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。在胸正中水 平處脊髓的石蠟切片中，統(tǒng)計(jì)用特異性標(biāo)記神經(jīng)元的抗NeuN抗體染色的前角和后角細(xì)胞 數(shù)目。rHIgM12治療小鼠中前角和后角細(xì)胞的數(shù)目比用PBS治療的小鼠或未治療小鼠顯著 更多（P=O. 0025和P=O. 018,通過T檢驗(yàn)）。用rHgM12治療的SOD突變體小鼠的前角和后 角細(xì)胞的數(shù)目與野生型SOD-/-小鼠中觀察到的數(shù)目類似。
[0088] 圖42.重組人抗體rHIgM12與各物種的神經(jīng)元結(jié)合。小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元（A、B、C、 D)、小鼠海馬神經(jīng)元（E、F)和人皮質(zhì)神經(jīng)元（G、H)用rHIgM12 (A、C、E和G)活染，相同細(xì) 胞用抗神經(jīng)絲抗體（B、D)或β微管蛋白（F、G)共標(biāo)記。rHIgM12用帶熒光標(biāo)簽的第二抗 體檢測。
[0089] 圖43.⑶-1小鼠中的腦缺血。A.顯示24H時(shí)腦缺血區(qū)域（高信號區(qū)域）的 DWI-MRI圖像掃描。B.腦缺血之后小鼠腦上的缺血性損傷（腦右半球上的灰白圓形區(qū)域）。 C.顯示受損組織（黑色突出顯示）的x4 H&E切片。
[0090] 圖44.神經(jīng)元結(jié)合抗體（rHIgM12)的單次i. p.劑量改善經(jīng)受光血栓形成腦缺血 的CDl小鼠中的水平㈧和垂直⑶活動。小鼠用200 Pg rHIgM12 (n=5)或PBS (n=5) 的單次劑量治療。rHIgM12治療組中的活動從第三天改善。C.在小動物MRI系統(tǒng)中掃描小 鼠，以測量圖中表示為mm 3的腦缺血的總體積。
[0091] 圖45. MT-MRI量度表明改善結(jié)果。使小鼠經(jīng)受腦缺血并用rHIgM12或PBS治療。 缺血性損傷后三天，計(jì)算腦的缺血（紅色輪廓）和對側(cè)（綠色輪廓）半球的MTR圖（A小 圖）。與用PBS治療的組相比，用rHIgM12治療的組表明中風(fēng)ROI內(nèi)MTR的相對增加（小圖 B，藍(lán)色條代表在對照側(cè)上計(jì)算的值）和中風(fēng)體積的降低（小圖C)。
[0092] 圖46.在聚-D-賴氨酸上生長5天且在缺氧條件（2. 7 % 02，5 % CO2)下孵育 4-44小時(shí)的皮層神經(jīng)元（CN)的Western印跡分析。顯示與對照（44小時(shí)，在印跡中孵育0 小時(shí)）相比缺氧處理4小時(shí)、21小時(shí)和44小時(shí)之后裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性 印跡。
[0093] 圖47描繪了顯示來自使用髓鞘標(biāo)志物MBP和凋亡標(biāo)志物裂解的胱天蛋白酶-3的 三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的Western印跡的定量分析的條形圖。使混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物在含有FBS (10 %)的培養(yǎng)基中生長4天，并在具有促進(jìn)髓鞘再生的IgM rHIgM22、再生的mAb rHIgM12、同種 型對照sHIgM116 (各10 yg/ml)的化學(xué)定義的培養(yǎng)基或僅培養(yǎng)基中處理7天。每兩天更 換具有新鮮抗體的培養(yǎng)基。在4天結(jié)束時(shí)，使用Western印跡評價(jià)培養(yǎng)物的MBP或胱天蛋 白酶-3,通過OD/面積定量，并繪圖。
[0094] 圖48提供了顯示各種蛋白和標(biāo)志物的水平的代表性Western印跡：少突膠質(zhì)細(xì) 胞祖細(xì)胞（OPC)標(biāo)志物I3DGFa R、髓鞘標(biāo)志物CNPase和M0G、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物⑶68和 Lyn、增殖標(biāo)志物Ki-67和組蛋白H3、凋亡標(biāo)志物裂解的胱天蛋白酶-3和細(xì)胞周期標(biāo)志物 pRbS795。將OPC-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物在具有促進(jìn)髓鞘再生的mAbs A2B5、04、01、78. 09、 94. 03、rHIgM22,再生的 mAb rHIgM12,同種型對照（LEAF、5A5、ChromPure IgM、rHIgM42、 SHIgM14、SHIgM24、sHIgM26)(各10 yg/ml)的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 如所示。
[0095] 圖49描繪了顯示來自使用標(biāo)志物⑶68 (用于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞）和Lyn激酶（小 膠質(zhì)細(xì)胞中的高豐度激酶，在OPC中程度較低，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞中不存在）的三次獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)的Western印跡的定量分析的條形圖?；旌吓囵B(yǎng)物（0PC小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)物）用如上 對于圖48所述的抗體處理并標(biāo)明。
[0096] 圖50提供了代表性免疫熒光圖像，其顯示在mAb處理之前培養(yǎng)第4天和用 rHIgM12、rHIgM22和同種型對照sHIgM24 (各10 Pg/ml)處理7天之后培養(yǎng)第11天混合 膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中CD68 (綠色）和核標(biāo)志物DAPI (藍(lán)色）的水平。
[0097] 圖51提供了顯示缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF1 α)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物NG2、TOGFa、 〇lig-2、髓鞘標(biāo)志物MBP和CNPase、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物⑶68、細(xì) 胞周期標(biāo)志物pRbS795和凋亡標(biāo)志物裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性Western印跡， 其中β肌動蛋白用作上樣對照。使混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物在含有FBS (10 %)的培養(yǎng)基中生 長4天，并在缺氧條件（3 % 02)(與常氧條件（21% 02)相比）下在化學(xué)定義的培養(yǎng)基中處 理直至額外7天。如所示在第1、3、5和7天通過Western印跡評價(jià)蛋白。
[0098] 圖52描繪了圖51的Western印跡的定量分析，以提供蛋白標(biāo)志物的表達(dá)的定量 值和蛋白標(biāo)志物的缺氧和常氧條件的比較。
[0099] 圖53提供了增殖標(biāo)志物Ki-67、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1、⑶68和iNOS、凋亡標(biāo)志 物裂解的胱天蛋白酶-3、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、細(xì)胞周期標(biāo)志物pRbS795和pRbS80、 少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物H)GF a R、NG2、01ig_l和01ig-2和髓鞘標(biāo)志物MBP的代表性Western 印跡。使混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物在常氧條件下在含有FBS (10 %)的培養(yǎng)基中生長4天，隨后 在缺氧（3 % 02)下在具有人再生抗體rHIgM12的化學(xué)定義的培養(yǎng)基或僅培養(yǎng)基中處理1-7 天。
[0100] 圖54提供了顯示在常氧和缺氧條件下生長且用rHIgM12或rHIgM22抗體處理（相 比于單獨(dú)的培養(yǎng)基）的第7天混合培養(yǎng)物中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-I和CD68、細(xì)胞凋亡標(biāo) 志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物TOGF a R、NG2、 01ig-2和髓鞘標(biāo)志物MBP和CNPase的水平的代表性Western印跡。將混合膠質(zhì)細(xì)胞如前 所述培養(yǎng)，并在缺氧或常氧條件下在具有rHIgM12、rHIgM22的化學(xué)定義的培養(yǎng)基或僅培養(yǎng) 基中處理7天。
[0101] 圖55提供了來自P13的缺氧和常氧C57/B16新生小鼠的皮層的各種標(biāo)志物的 RT-PCR分析。C57/B16新生小鼠通過CDl母獸（dams)交叉培育，并從P3至P7暴露于缺氧 (10% 02) 4天。隨后將小鼠暴露于室內(nèi)空氣，持續(xù)額外6天，并在P13處死。從兩個(gè)處理組的 皮層中分離RNA，并探測髓鞘標(biāo)志物PLP1、MOG、MBP1、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞標(biāo)志物TOGF a R 和Olig-I、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、神經(jīng)元標(biāo)志物巢蛋白和β 3-微管蛋白、缺氧誘導(dǎo)因 子Ia和肌長蛋白蛋白SSPN。表達(dá)水平通過RT-PCR分析，并將結(jié)果針對β肌動蛋白的水 平均一化。
[0102] 圖56提供了表明如各小圖中所注來自對照（假操作）和中風(fēng)小鼠（孟加拉玫瑰紅 方案）的各種組織中放射性標(biāo)記的rIgM12抗體（如所示通過放射性測量為cpm/?θθμ?)的 量的圖。在中風(fēng)后30至40 min，將500 ul體積鹽水中10百萬cpm的35S標(biāo)記的rHIgM12(約 60 ug IgM)腹膜內(nèi)施用于每只小鼠。在IgM處理后6、12和24小時(shí)，從小鼠收集血液，用 30 ml生理鹽水洗滌脈管系統(tǒng)，并快速收集組織。對于中風(fēng)組織中放射性標(biāo)記的分析，將含 有病變區(qū)域的腦右前皮質(zhì)去除，作為75 mg組織塊（在小圖中表示為腦）。去除一部分其他 組織，稱重并處理。CB=小腦，cord=脊髓。
[0103] 發(fā)明詳沭 根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)分子生物學(xué)、 微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整解釋。參見例如
【權(quán)利要求】
1. 分離的人IgM抗體或其片段，其特異性地結(jié)合神經(jīng)元并保護(hù)神經(jīng)元免于細(xì)胞死亡， 并且其不促進(jìn)髓鞘再生，其中所述抗體或片段包含下列序列： (a) 如圖5中所示的可變重鏈氨基酸⑶R結(jié)構(gòu)域序列CDRI GGSVSLYY (SEO iD N0.3〗} 、CDR2GYIYSSGST(SEQ ? NO:32:和 CDR3.ARSASIRSWro (SEQID 嶋:33：,及輕鏈 CDR 序列 CDRi QSISSY {SEQ !0N0; 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35) CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO:36) ； ^ (b) 如圖6中所示的可變重鏈氨基酸CDR結(jié)構(gòu)域序列CDR! GRfSTYA {SEO ID NO: 37} 、001?2_00^11味0 0?:38:'和〇^3￥1^50?0剛539細(xì):既0?嶋:39),及輕鏈〇)1?序列 CDF? QGIG (SEQ ID NO: ?)、CDR2 HS (SEO ID N0:41}和 C0R3 QKYNSAPRT (SEO ID NO: 42), 其用于治療或減輕腦缺血或中風(fēng)，改善中風(fēng)或腦缺血之后動物中的神經(jīng)功能，或保護(hù) 神經(jīng)元或神經(jīng)細(xì)胞免于中風(fēng)或腦缺血之后的損害或細(xì)胞死亡。
2. 權(quán)利要求1的分離的抗體，其包含SEQ ID NO: 1中所示的可變重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 11中所示的可變輕鏈氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 17中所示的可變重鏈氨基酸序 列和SEQ ID N0:27中所示的可變輕鏈氨基酸序列，或者其高度同源的變體，其中所述變體 保持神經(jīng)元結(jié)合和神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)再生活性。
3. 權(quán)利要求1的分離的抗體，其是重組抗體rHIgM42并包含如圖6中所示的SEQ ID NO: 17中所示的可變重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:27中所示的可變輕鏈氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求1的分離的抗體，其進(jìn)一步包含人J鏈序列。
5. 權(quán)利要求4的抗體，其中所述J鏈包含SEQ ID NO: 15中所示的氨基酸序列。
6. 權(quán)利要求4或5的抗體，其是重組抗體rHIgM12并包含SEQ ID NO: 1中所示的可變 重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 11中所示的可變輕鏈氨基酸序列。
7. 權(quán)利要求5的分離的抗體或片段，其是包含重鏈和輕鏈可變區(qū)的完全人抗體或其抗 體片段，或者其高度同源的變體，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)含有選自氨基酸序列SEQ ID N0:1 和11的氨基酸序列，其中所述變體保持神經(jīng)元結(jié)合和神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)再生活性。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的分離的抗體或其片段，其用于中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷（TBI)、 腦缺血或其中對腦或腦細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞存在血流或氧不足的其他病況。
9. 權(quán)利要求1的分離的抗體，其配制用于治療或減輕中風(fēng)或腦缺血，并組合有一種或 多種作為溶栓劑、抗血小板藥、抗高血壓藥或他汀類藥物的藥劑。
10. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體，其標(biāo)記有可檢測標(biāo)記或功能標(biāo)記。
11. 權(quán)利要求10的抗體，其中所述標(biāo)記是酶、特異性結(jié)合配偶體、配體、染料、熒光標(biāo)簽 和/或放射性元素。
12. 分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體或片段的序列。
13. 制備權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)限定的抗體或片段的方法，其包括在引起所述抗體或 片段表達(dá)的條件下表達(dá)權(quán)利要求12的核酸，和回收所述抗體或片段。
14. 用于治療或減輕中風(fēng)或腦缺血的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)限定 的抗體或片段和藥學(xué)上可接受的媒介物、載體或稀釋劑。
15. 用于治療或減輕動物中的中風(fēng)或腦缺血的試劑盒，其包含權(quán)利要求14的藥物組合 物的藥物劑型和含有一種或多種另外的神經(jīng)活性劑或治療劑、溶栓劑、抗高血壓劑、抗血小 板劑、抗炎劑、神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)受體配體或激動劑或拮抗劑、鈣通道藥劑、免疫調(diào) 節(jié)劑、或其他CNS反應(yīng)性抗體的單獨(dú)的藥物劑型。
16. 用于治療或減輕動物中的中風(fēng)或腦缺血的方法，其包括向疑似或確定患有中風(fēng)或 腦缺血的動物施用有效量的權(quán)利要求14的藥物組合物。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物作為單一劑量施用于所述疑似或確定患有中 風(fēng)或腦缺血的動物。
18. 用于檢測患有或疑似患有中風(fēng)或腦缺血的哺乳動物的神經(jīng)損傷、死亡或損害的存 在情況或程度的方法，其包括： A. 將來自其中懷疑中風(fēng)或腦缺血的哺乳動物的生物樣品與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的 抗體或片段在允許所述抗體或片段與所述樣品中的神經(jīng)元結(jié)合發(fā)生的條件下接觸；和 B. 檢測來自所述樣品的所述神經(jīng)元與抗體間是否已發(fā)生結(jié)合或者測定來自所述樣品 的所述神經(jīng)元與抗體已發(fā)生結(jié)合的量； 其中檢測到結(jié)合表明在所述樣品中存在神經(jīng)細(xì)胞損傷、死亡或損害，且結(jié)合的量表明 神經(jīng)細(xì)胞損傷、死亡或損害的相對量。
【文檔編號】A61K39/395GK104379167SQ201380027368
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月17日
【發(fā)明者】M.羅德里格斯, A.E.沃林頓, L.R.皮斯 申請人:梅奧醫(yī)學(xué)教育和研究基金會