間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用細(xì)胞外小泡用于誘導(dǎo)和/或促進成骨分化的方法及其用途。
【專利說明】間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)或促進細(xì)胞分化的方法，用于在誘導(dǎo)或促進所述分化中使用的細(xì)胞外小泡，所述小泡的用途以及一種使用所述小泡的治療方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在植入物表面處或在損傷部位處的早期骨形成的機制以及影響骨-植入物接觸、穩(wěn)定性和功能的維持的因素未得到完全理解。炎性細(xì)胞和干細(xì)胞與祖細(xì)胞在植入物的表面上通訊的途徑的增加的知識對于理解應(yīng)該如何優(yōu)化下一代用于臨床使用的植入物而言是重要的。伴隨更多的知識，在將來，我們將有希望能夠生產(chǎn)用于改進的骨整合的新的且更好的植入物或用于骨愈合的更好的藥物。
[0003]單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在宿主防御、傷口愈合以及生物材料表面處的免疫調(diào)控上發(fā)揮核心作用。單核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞迅速迀移至植入的材料表面并且在細(xì)胞外基質(zhì)沉積和骨形成之前被定位成彼此靠近。已經(jīng)顯示，來自人類單核細(xì)胞，包含例如促炎細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)基促進人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的成骨分化。單核細(xì)胞如何與MSC通訊未被完全確定，盡管已經(jīng)提議它們在不存在直接的細(xì)胞間接觸的情況下通訊。
[0004]細(xì)胞外小泡(EV)(包括外體)在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞間通訊的一種提議的普遍機理涉及經(jīng)由外體傳遞而遞送RNA，很可能發(fā)生在微環(huán)境中但是潛在地還可能發(fā)生在遠(yuǎn)處。外體是內(nèi)吞起源的小膜泡(40-100nm)，當(dāng)多泡體與質(zhì)膜融合時，其被釋放進細(xì)胞外環(huán)境中。外體提供了一種細(xì)胞之間的通訊方式，其中一個細(xì)胞可以釋放在微環(huán)境中或在一段距離上可以影響其他細(xì)胞的外體。外體釋放自許多細(xì)胞并且其功能取決于細(xì)胞起源以及給予外體其特征性組成的產(chǎn)生細(xì)胞的情況。例如，起源自暴露于氧化應(yīng)激的細(xì)胞的外體顯示出賦予對抗受體細(xì)胞中的應(yīng)激的保護性信息。
[0005]然而，對EV是否及如何影響受體細(xì)胞的分化所知甚少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于誘導(dǎo)和/或促進細(xì)胞的成骨分化的方法，優(yōu)選是間充質(zhì)干細(xì)胞，更優(yōu)選是人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)。本發(fā)明還涉及細(xì)胞外小泡用于增加骨再生及用于支持植入物的骨整合的用途。
[0007]在一個第一方面中，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)和/或促進靶標(biāo)干細(xì)胞的成骨分化的方法，該方法包括:
[0008]a.提供來自非靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或分離自非靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞外小泡；并且
[0009]b.將該培養(yǎng)基或這些細(xì)胞外小泡添加至這些靶標(biāo)干細(xì)胞中。
[0010]在一個第二方面中，本發(fā)明涉及用于在靶標(biāo)干細(xì)胞的成骨分化中使用的分離的細(xì)胞外小泡。
[0011]在一個第三方面中，本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括由非靶標(biāo)細(xì)胞獲得的用于在靶標(biāo)干細(xì)胞的成骨分化中使用的細(xì)胞外小泡。
[0012]在一個第四方面中，本發(fā)明涉及一種植入物表面，該表面包括一種暴露于細(xì)胞外小泡的涂層。
[0013]在一個第五方面中，本發(fā)明涉及一種植入物表面，該表面包括一種固定的經(jīng)刺激的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞的涂層，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生外體。
[0014]在一個第六方面中，本發(fā)明涉及一種治療患者的方法，該方法包括從該患者收集血液或組織樣品，分離非靶標(biāo)細(xì)胞，培養(yǎng)并刺激這些非靶標(biāo)細(xì)胞，分離由這些非靶標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生的外體并且將這些外體給予至該患者。
[0015]在一個第七方面中，本發(fā)明涉及分離的細(xì)胞外小泡用于治療骨損傷、骨質(zhì)疏松、骨發(fā)生或在骨固定中的用途。
[0016]在一個第八方面中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括用于治療骨損傷、骨空隙、骨質(zhì)疏松或骨發(fā)生的分離的細(xì)胞外小泡。
[0017]在一個第九方面中，本發(fā)明涉及一種骨空隙填充物，該填充物包括分離的細(xì)胞外小泡。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1.從人類單核細(xì)胞細(xì)胞系HMC-1的條件培養(yǎng)基分離的并且經(jīng)針對⑶63免疫金標(biāo)記的外體的透射電鏡術(shù)圖片。
[0019]圖2.與抗-CD63乳膠珠粒軛合的從單核細(xì)胞衍生的外體的流式細(xì)胞術(shù)分析。將外體針對四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81 (右圖)以及同型匹配的對照(左圖)進行免疫染色。
[0020]圖3.從單核細(xì)胞外體及其供體細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0021]圖4.對來自單核細(xì)胞的外體的和細(xì)胞的總RNA和小RNA進行檢測。電泳圖譜披露了(a)單核細(xì)胞外體和細(xì)胞(b)中的總RNA以及外體(c)和細(xì)胞⑷中的小RNA的核苷酸大小分布(nt)和熒光強度(FU)。
[0022]圖5.將流式細(xì)胞術(shù)分析(與用于單核細(xì)胞外體的類似)應(yīng)用于從間充質(zhì)干細(xì)胞中檢測外體。數(shù)據(jù)顯示間充質(zhì)干細(xì)胞釋放對于⑶9、⑶63和⑶81呈陽性的外體。
[0023]圖6.MSC外體的納米顆粒跟蹤分析。
[0024]圖7.用針對⑶63的免疫金標(biāo)記的MSC外體的透射電鏡術(shù)圖片(條20nm)。
[0025]圖8.電泳圖譜披露了 MSC和分離自MSC培養(yǎng)物的外體的總RNA的核苷酸大小分布(nt)和熒光強度(FU) ?
[0026]圖9.MSC外體向單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
[0027]將MSC外體分離，用一種綠色熒光染料(PKH67，西格瑪(SIGMA))標(biāo)記并且添加至培養(yǎng)物中的單核細(xì)胞里。24h后，通過(a)流式細(xì)胞儀和(b)熒光顯微鏡對標(biāo)記的小泡的攝取進行分析。對照；PKH6染色的PBS。將DAPI用于細(xì)胞核染色。綠色細(xì)胞是對綠色外體呈陽性的單核細(xì)胞，顯示它們已經(jīng)攝取外體或附接至其表面的外體。
[0028]圖10.MSC外體向MSC的轉(zhuǎn)移與圖9中的類似，將MSC外體分離，用一種綠色熒光染料(PKH67，西格瑪)標(biāo)記并且添加至MSC培養(yǎng)物中。24h后，通過(a)流式細(xì)胞儀和(b)熒光顯微鏡對攝取進行分析。對照；PKH6染色的PBS。將DAPI用于細(xì)胞核染色。綠色細(xì)胞是對綠色外體呈陽性的MSC，顯示它們已經(jīng)攝取外體或附接至其表面的外體。
[0029]圖11.將釋放自用LPS刺激的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的外體分離，用一種綠色熒光染料(PKH67，西格瑪)標(biāo)記并且添加至培養(yǎng)中的MSC里。將MSC在綠色外體的存在下培養(yǎng)大約72h，然后通過流式細(xì)胞儀(a)在熒光顯微鏡(b)中對細(xì)胞進行分析。將DAPI用于細(xì)胞核染色。綠色細(xì)胞是對綠色外體呈陽性的MSC，顯示它們已經(jīng)攝取外體或附接至其表面的外體。來自單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的外體被攝取/附接至間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0030]圖12.在hMSC中培養(yǎng)72h的Runx2和BMP-2在非條件對照培養(yǎng)基(對照)、在單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)或在補充有外體的培養(yǎng)基(外體)中的基因表達(dá)。

【具體實施方式】
[0031]在本發(fā)明中，術(shù)語“一個靶標(biāo)干細(xì)胞”或“多個靶標(biāo)干細(xì)胞”意指有待被條件培養(yǎng)基或來自非靶標(biāo)細(xì)胞的額外的細(xì)胞小泡誘導(dǎo)成骨分化的一個細(xì)胞或多個細(xì)胞。
[0032]術(shù)語“條件培養(yǎng)基”意指在已經(jīng)除去培養(yǎng)的細(xì)胞后用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
[0033]通常將至細(xì)胞的信號傳導(dǎo)認(rèn)為是以可溶態(tài)呈現(xiàn)的和/或表面上的分子的作用，是與細(xì)胞的質(zhì)膜或基質(zhì)相關(guān)的。本發(fā)明涉及由細(xì)胞來源的，大約20-400nm或50_200nm，包含例如蛋白質(zhì)、mRNA和微小RNA的細(xì)胞外小泡介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。這些小泡附接至、融合至靶標(biāo)細(xì)胞或被靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)化并且在靶標(biāo)細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用。這種通訊可以誘導(dǎo)和/或促進細(xì)胞(例如干細(xì)胞，尤其是人類間充質(zhì)干細(xì)胞)的成骨分化。
[0034]諸位發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種誘導(dǎo)和/或促進靶標(biāo)細(xì)胞的成骨分化的方法。該方法包括提供來自非靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或釋放自非靶標(biāo)細(xì)胞的分離的細(xì)胞外小泡。在一個實施例中，這些細(xì)胞外小泡是外體。這些額外的細(xì)胞小泡是通過培養(yǎng)非靶標(biāo)細(xì)胞，任選地在非靶標(biāo)細(xì)胞的刺激以釋放所述小泡以及條件培養(yǎng)基或小泡的分離的過程中提供。可以將這些非靶標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)不同時間，例如I小時或更久、或I天或更久、或2天或更久、或3天或更久。將該培養(yǎng)基或這些小泡添加至或接觸可以是干細(xì)胞的靶標(biāo)細(xì)胞。然后，這些小泡被誘導(dǎo)和/或促進成骨分化的靶標(biāo)細(xì)胞攝取或附接其上。
[0035]這些靶標(biāo)細(xì)胞可以是任何適合的細(xì)胞類型或細(xì)胞系，但是也可以是祖細(xì)胞或干細(xì)胞。這些細(xì)胞可以例如是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)(例如人類MSC)。
[0036]據(jù)諸位發(fā)明人所知，沒有描述經(jīng)由細(xì)胞外體或具有類似特性的其他細(xì)胞外小泡的細(xì)胞之間的相互作用(cross-talk)的公開案，這些細(xì)胞是例如炎性細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞)，該相互作用用于誘導(dǎo)和/或促進成骨分化。諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞(如炎性細(xì)胞)向其他細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞)發(fā)送信息，導(dǎo)致骨分化基因在受體細(xì)胞(例如干細(xì)胞)中的增加的表達(dá)。這些信息是外體和/或其他細(xì)胞外小泡。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)干細(xì)胞的成骨分化的誘導(dǎo)和/或促進可以通過刺激除靶標(biāo)細(xì)胞以外的細(xì)胞(在此稱為非靶標(biāo)細(xì)胞)而進行。這些刺激的非靶標(biāo)細(xì)胞可以是任何適合的細(xì)胞并且可以例如是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、破骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或任何其他炎性細(xì)胞或非炎性細(xì)胞以及干細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞)。優(yōu)選地，這些非靶標(biāo)細(xì)胞是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或干細(xì)胞，并且在一個優(yōu)選實施例中，這些非靶標(biāo)細(xì)胞是人類單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或干細(xì)胞(例如hMSC)。該方法可以在體內(nèi)和體外進行。
[0038]不被理論所束縛，這些靶標(biāo)細(xì)胞或非靶標(biāo)細(xì)胞的表型在誘導(dǎo)和/或促進成骨分化的成功中可以發(fā)揮一定作用。已知的是，來自具有不同表型的非靶標(biāo)細(xì)胞的EV也具有不同表型和功能。此外，這些靶標(biāo)細(xì)胞的表型可以影響EV是否可以結(jié)合至并且將其信息遞送至靶標(biāo)細(xì)胞，并且進一步影響該靶標(biāo)細(xì)胞是否可以被定向在一個特定方向上。在本發(fā)明的一個實施例中，這些非靶標(biāo)細(xì)胞是自體的或非自體的。在另一個實施例中，這些靶標(biāo)細(xì)胞是自體的或非自體的。使用自體的益處可以是有限的免疫應(yīng)答，而來自健康個體或未罹患有待治療的疾病的個體的非自體細(xì)胞在其達(dá)到再生或愈合過程時可以是有益的。
[0039]能以多種方式刺激這些細(xì)胞，例如通過使用一種刺激劑，如脂多糖(LPS)、細(xì)胞因子、趨化因子或任何其他刺激物或其組合。刺激劑的量的范圍可以是I至100ng/ml，例如lng/ml或更多、或5ng/ml或更多、或10ng/ml或更多、或20ng/ml或更多、或100ng/ml或更少、或70ng/ml或更少、或50ng/ml或更少、或30ng/ml或更少。在一個實施例中，刺激劑的濃度范圍是I至20ng/ml，在另一個實施例中，該濃度是5至50ng/ml，并且在又另一個實施例中，該濃度是5至15ng/ml。
[0040]不被理論所束縛，認(rèn)為非靶標(biāo)細(xì)胞(尤其是刺激的非靶標(biāo)細(xì)胞)產(chǎn)生額外的分化刺激細(xì)胞小泡(釋放自細(xì)胞的膜的小囊，例如外體)，當(dāng)與靶標(biāo)干細(xì)胞接觸或被其攝取時，這些小泡誘導(dǎo)成骨分化。這些小泡(誘導(dǎo)和/或促進成骨分化小泡)可以分離自來自非靶標(biāo)細(xì)胞中的任一個的條件培養(yǎng)基，這些非靶標(biāo)細(xì)胞是例如單核細(xì)胞、巨■細(xì)胞、紅細(xì)胞、破骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及干細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞)。這些小泡可以與其他生物分子(例如生長因子)混合。這些細(xì)胞外小泡的大小的范圍可以是20至400nm，例如20nm或更大、或50nm或更大、或80nm或更大、或10nm或更大、或400nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小。圖1披露了分離自條件培養(yǎng)基的外體。
[0041]在一個實施例中，這些分離的EV是釋放自兩種或更多種不同細(xì)胞類型的EV的組合。在另一個實施例中，這些分離的EV是釋放自使用兩種或更多種不同類型的刺激劑刺激的細(xì)胞的EV的組合。在又另一個實施例中，這些分離的EV是釋放自兩種或更多種不同細(xì)胞類型的EV的組合，其中使用至少一種不同類型的刺激劑對每種細(xì)胞類型進行刺激。
[0042]負(fù)責(zé)分化的細(xì)胞因子、生長因子或其他信號物質(zhì)或物質(zhì)的組合仍未被完全確定。這些細(xì)胞因子、生長因子和其他信號物質(zhì)也可以用來刺激這些非靶向細(xì)胞，以釋放例如具有一種特定表型和/或功能的細(xì)胞外小泡。其他信號物質(zhì)可以例如是激素。潛在的細(xì)胞因子是 IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 11-19、 IL-20、 IL-21、 IL-22、 IL-23、 IL-24、 IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35 或 IFN-類型，或其組合。潛在的生長因子是BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其組合。趨化因子的實例將是類型CC、CXC、CX3C 及 XC 中的任一種，例如 CCL 2、CCL 3、CCL 5、CCL 7、CCL 8, CCLlU CCL 13、CCL 17,CCL 22,CCL 24,CCL 26、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5 或其組合。其他信號物質(zhì)可以例如是激素。
[0043]這些小泡可以進一步包括其他物質(zhì)，例如其他蛋白質(zhì)、生長因子(BMP、TGF、VEGF,TNF或FGF或其組合)、mRNA、miRNA或siRNA或其他調(diào)控小RNA。
[0044]在一個實施例中，使用脂多糖(LPS)、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子(BMP、TGF、VEGF.TNF或FGF或其組合)或任何其他刺激物或其組合刺激這些非靶向細(xì)胞，以釋放包含蛋白質(zhì)、生長因子(BMP、TGF、VEGF, TNF或FGF或其組合)、mRNA, miRNA或siRNA或其他調(diào)控小RNA或其組合的額外的細(xì)胞小泡。
[0045]在又另一個實施例中，使用脂多糖(LPS)、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其組合)或任何其他刺激物或其組合刺激這些非靶向細(xì)胞，以釋放包含蛋白質(zhì)、生長因子(BMP、TGF、VEGF, TNF或FGF或其組合)、mRNA, miRNA或siRNA或其他調(diào)控小RNA或其組合的額外的細(xì)胞小泡。然后，將這些小泡添加至或接觸靶標(biāo)細(xì)胞，這些靶標(biāo)細(xì)胞與脂多糖(LPS)、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子或任何其他刺激物或其組合處于組合形式。
[0046]諸位發(fā)明人已經(jīng)證明，MSC和單核細(xì)胞兩者都釋放包含RNA的細(xì)胞外小泡(圖1-8)，并且諸位發(fā)明人還已經(jīng)證明，靶標(biāo)MSC攝取釋放的細(xì)胞外小泡(圖9-10)。諸位發(fā)明人還已經(jīng)證明，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明處理hMSC時，成骨分化被促進，如通過RUNX2和BMP-2的增加的基因表達(dá)所示例(圖12)。
[0047]可以將這些細(xì)胞外小泡與一種例如PBS緩沖液或任何其他鹽水緩沖液或任何其他培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)基(或條件培養(yǎng)基)混合。該培養(yǎng)基可以包含來自多于一種類型的非靶標(biāo)細(xì)胞(例如兩種、三種或四種細(xì)胞類型)的小泡。例如，該培養(yǎng)基可以包含來自單核細(xì)胞和hMSC，或單核細(xì)胞、hMSC和巨噬細(xì)胞的小泡的混合物。這些細(xì)胞外小泡可以在體外和體內(nèi)提供給革巴標(biāo)細(xì)胞。
[0048]可以將來自非靶標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或分離的細(xì)胞外小泡添加至需要骨再生的部位。該條件培養(yǎng)基或這些小泡也可以與靶標(biāo)細(xì)胞一起被遞送。通過將該培養(yǎng)基或這些小泡遞送至靶標(biāo)細(xì)胞定位的部位，成骨分化將得以誘導(dǎo)?？梢酝ㄟ^注射或經(jīng)由遞送運載體的植入進行遞送。與例如合成脂質(zhì)體相比，細(xì)胞外小泡(例如外體)具有導(dǎo)致中度免疫應(yīng)答或不導(dǎo)致免疫應(yīng)答的益處。
[0049]將這些細(xì)胞外小泡以足夠誘導(dǎo)和/或促進成骨分化的量添加至或接觸靶標(biāo)細(xì)胞。
[0050]此外，可以通過將這些小泡涂層或固定在表面上，例如在植入物的表面上，或作為藥物遞送系統(tǒng)的一部分來將這些小泡提供給干細(xì)胞。該植入物表面可以是一種金屬表面(例如鈦或氧化鈦)或一種陶瓷表面(例如磷酸鈣表面)。該藥物遞送系統(tǒng)可以例如是一種將緩慢釋放這些小泡的水凝膠或生物降解材料。該水凝膠可以例如是透明質(zhì)酸或殼聚糖或聚乙烯醇或其組合。在另一個實施例中，利用用于體內(nèi)釋放細(xì)胞外小泡的細(xì)胞涂覆或固定植入物表面。例如，可以用可釋放增加數(shù)目的外體的經(jīng)刺激的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞涂覆或固定表面，以在植入物部位處誘導(dǎo)和/或促進成骨分化。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于治療患者。該方法包括
[0052]-使用任何可得的適合技術(shù)從人(例如該患者本人)中收集血液或組織樣品；
[0053]-分離非靶標(biāo)細(xì)胞并且培養(yǎng)這些細(xì)胞并且任選地刺激這些非靶標(biāo)細(xì)胞，以產(chǎn)生誘導(dǎo)和/或促進細(xì)胞外小泡；
[0054]-分離由這些非靶標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生的所述細(xì)胞外小泡；并且
[0055]-向該患者給予這些細(xì)胞外小泡。
[0056]可以通過任何適合的技術(shù)全身地或局部地進行給予，例如通過至需要或想要成骨分化的位置的注射器。
[0057]可以將本發(fā)明用作骨外科、植入物外科、骨愈合治療或骨或牙齒固定治療過程中的輔助治療?？梢詫⑦@些分離的細(xì)胞外小泡固定在不同支架和植入物上，例如用于牙科應(yīng)用(例如牙齒)、髖關(guān)節(jié)或膝蓋的植入物或任何其他骨植入物。還可以將這些小泡固定在骨固定植入物(例如螺釘或固定板)上。此外，本發(fā)明可以用于治療各種骨有關(guān)疾病和損傷，例如骨空隙填充材料、骨贅、顱縫早閉、骨關(guān)節(jié)炎，各種骨病、骨硬化、骨質(zhì)疏松或骨發(fā)生。
[0058]實例
[0059]實例I
[0060]過程的一般描述
[0061]單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng):使用磁力分離從人類血液中分離單核細(xì)胞并且在不同生物材料上進行培養(yǎng)并且用或不用刺激(例如LPS)。間充質(zhì)干細(xì)胞是通過梯度分離獲得自人類骨髓。72h后，收獲細(xì)胞并且從條件培養(yǎng)基中分離外體。
[0062]外體分離與檢測:將使用以下的方法分離外體，該方法是基于重復(fù)的離心與過濾步驟以除去細(xì)胞碎片、凋亡小體等，隨后超速離心以沉淀外體。還可以使用替代性分離方法。將使用包括電子顯微術(shù)以及使用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測多種標(biāo)記物的方法的組合來檢測外體，這些標(biāo)記物是通常發(fā)現(xiàn)于外體上的標(biāo)記物(例如⑶9、⑶63、⑶81、TsglOl)和應(yīng)該不存在于外體中的標(biāo)記物(鈣聯(lián)蛋白)。
[0063]外體的mRNA與微小RNA含量:將在來自暴露于不同刺激的單核細(xì)胞和MSC的外體上進行微陣列，以評估m(xù)RNA與微小RNA含量。
[0064]攝取實驗:將分離的外體用一種熒光染料標(biāo)記，添加至培養(yǎng)中的MSC里并且在不同時間點后使用熒光顯微術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)對攝取進行分析。
[0065]骨發(fā)生的評估:使用RT-PCR對組織學(xué)染色(馮.科薩法(von Kossa))和骨形成的標(biāo)記物(骨鈣素，runx2, I型膠原)進行評估。
[0066]材料與方法
[0067]人類單核細(xì)胞是通過磁力分離獲得自血沉棕黃層(純度90% -95%，η = 4)。將這些單核細(xì)胞用LPS(10ng/ml)處理72h并且將條件培養(yǎng)基(CM)進行收集。對人類脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)進行培養(yǎng)并且將條件培養(yǎng)基進行收集。將外體通過重復(fù)的離心與過濾步驟從CM中分離并且使用流式細(xì)胞術(shù)進行檢測。對于流式細(xì)胞術(shù)分析，將外體與抗-⑶63乳膠珠粒進行軛合并且針對四次跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81進行免疫染色。還使用透射電鏡術(shù)和納米顆粒跟蹤分析將外體可視化。提取來自不同類型的小泡及其供體細(xì)胞的RNA并且使用一個生物分析儀分析大小分布圖案。將hMSC在補充有單核細(xì)胞外體的培養(yǎng)基、CM或?qū)φ张囵B(yǎng)基中培養(yǎng)72h。使用實時PCR分析評估成骨分化(Runx2，ΒΜΡ-2，η =4) ο通過dd-Ct方法計算靶標(biāo)基因表達(dá)的相對定量。在單獨的實驗中，將人類單核細(xì)胞或hMSC在補充有PKH67染色的小泡的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并且使用流式細(xì)胞術(shù)和顯微術(shù)對攝取進行檢查。
[0068]結(jié)果
[0069]流式細(xì)胞術(shù)分析揭示，LPS-刺激的單核細(xì)胞和MSC釋放對于四次跨膜蛋白CD9、⑶63和⑶81呈陽性的外體，這些四次跨膜蛋白是通常用于外體檢測的標(biāo)記物，參見圖2和5。
[0070]圖11披露了來自單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的外體被攝取/附接至間充質(zhì)干細(xì)胞。與陰性對照相比，在綠色PKH67染色的外體的存在下培養(yǎng)的MSC在FL-1中是陽性的，表明這些外體附接至或與MSC融合或被MSC內(nèi)化。此外，在補充有PKH67標(biāo)記的綠色MSC外體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hMSC顯示MSC對該綠色染料呈陽性，說明MSC經(jīng)由外體與其他MSC通訊，參見圖10。另外，用綠色MSC外體培養(yǎng)單核細(xì)胞也揭示，一部分單核細(xì)胞已經(jīng)攝取或內(nèi)化綠色外體，參見圖9。
[0071]與對照培養(yǎng)基相比，在單核細(xì)胞CM或在補充有分離自CM的純外體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hMSC持續(xù)72h，導(dǎo)致Runx2 (倍數(shù)變化，分別是1.7 ±0.3和1.4±0.2)和BMP-2 (倍數(shù)變化，分別是15.4±1.7和2.3±0.3)的顯著增加的表達(dá)水平，參見圖12。
[0072]這些結(jié)果證明，LPS-刺激的人類單核細(xì)胞釋放增強間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的因子并且這種作用的至少一部分歸因于經(jīng)由外體的通訊。
[0073]實例2
[0074]人類初級LPS刺激的單核細(xì)胞。培養(yǎng)3天后，分離外體并且提取RNA。對細(xì)胞的和外體的總RNA和小RNA進行生物分析器分析。電泳圖譜示出了(圖4) (a)外體和細(xì)胞(b)中的總RNA以及外體(c)和細(xì)胞⑷中的小RNA的核苷酸大小分布(nt)和熒光強度(FU)。
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)和/或促進靶標(biāo)細(xì)胞的成骨分化的方法，該方法包括: a.提供釋放自非靶標(biāo)細(xì)胞的誘導(dǎo)和/或促進成骨分化分離的細(xì)胞外小泡；并且 b.將這些細(xì)胞外小泡添加至這些靶標(biāo)細(xì)胞中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中這些非靶標(biāo)細(xì)胞是刺激的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞或其他炎性或非炎性細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中用脂多糖、細(xì)胞因子、趨化因子或任何其他刺激物刺激這些非靶標(biāo)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中以任何其他方式刺激或修飾這些非靶標(biāo)細(xì)胞，以釋放誘導(dǎo)和/或促進間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的細(xì)胞外小泡。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中這些細(xì)胞外小泡釋放自單核細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中提供的這些小泡是釋放自兩種或更多種不同類型的細(xì)胞的小泡的組合，或釋放自使用兩種或更多種不同類型的刺激劑刺激的細(xì)胞的小泡的組合，或釋放自兩種或更多種不同細(xì)胞類型的EV的組合，其中使用至少一種不同類型的刺激劑刺激每個細(xì)胞類型。
7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中這些細(xì)胞外小泡是外體。
8.來自非靶標(biāo)細(xì)胞的分離的誘導(dǎo)和/或促進成骨分化細(xì)胞外小泡用于靶標(biāo)細(xì)胞的成骨分化的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的小泡，其中這些非靶標(biāo)細(xì)胞是經(jīng)刺激的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞或其他炎性或非炎性細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的小泡，其中用脂多糖、細(xì)胞因子、趨化因子或任何其他刺激物刺激這些非靶標(biāo)細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項所述的小泡，其中這些小泡是外體。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項所述的小泡，其中這些小泡懸浮于一種培養(yǎng)基中。
13.—種植入物，該植入物包括一種暴露于誘導(dǎo)和/或促進成骨分化細(xì)胞外小泡的涂層O
14.一種植入物，該植入物包括一種固定的經(jīng)刺激的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞的涂層，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)和/或促進成骨分化細(xì)胞外小泡。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任一項所述的植入物，其中該植入物是一種用于牙科應(yīng)用、髖關(guān)節(jié)、膝蓋的植入物、螺釘或固定板。
16.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項用于治療損傷、骨質(zhì)疏松、骨發(fā)生或在骨固定中的用途。
17.—種組合物，該組合物包括分離的誘導(dǎo)和/或促進成骨分化細(xì)胞外小泡，這些細(xì)胞外小泡用于治療骨損傷、骨空隙填充材料、骨贅、顱縫早閉、骨關(guān)節(jié)炎、各種骨病、骨質(zhì)疏松或骨發(fā)生。
18.—種骨空隙填充物，該骨空隙填充物包括分離的誘導(dǎo)和/或促進成骨分化細(xì)胞外小泡。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的骨空隙填充物，進一步包括靶向干細(xì)胞。
20.一種治療患者的方法，該方法包括從該患者收集血液或組織樣品，分離非革E標(biāo)細(xì)胞，培養(yǎng)并刺激這些非靶標(biāo)細(xì)胞，分離由這些非靶標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外小泡并且將這些細(xì) 胞外小泡給予至該患者。
【文檔編號】A61K35/28GK104487569SQ201380028009
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月10日
【發(fā)明者】卡琳·?？怂固貍? 彼得·湯姆森, 尤卡·勞斯馬, 歐瑪·歐瑪, 王曉勤 申請人:生物材料細(xì)胞公司