具有抗菌活性的多肽混合物的制作方法

文檔序號：1294412閱讀：322來源：國知局

具有抗菌活性的多肽混合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物學領域，具體地涉及一種第一酶促活性結構域的源與第二酶促活性結構域的源的組合并且涉及包含所述組合的組合物。本發(fā)明進一步涉及一種用作藥物的包含所述組合的組合物，涉及所述組合物作為抗微生物劑的用途并且涉及一種用于控制食品產品或飼料產品中、食品或飼料加工設備上和/或食品或飼料加工設備中、食品或飼料容器上和/或食品或飼料容器中的微生物污染的方法。
【專利說明】具有抗菌活性的多肽混合物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物學領域，具體地涉及第一酶促活性結構域的源與第二酶促活性結構域的源的組合、多肽、多核苷酸并且涉及包含所述組合、多肽和/或多核苷酸的組合物。本發(fā)明進一步涉及一種用作藥物的包含所述組合、多肽和/或多核苷酸的組合物，涉及所述組合物、多肽和/或多核苷酸作為抗微生物劑的用途并且涉及一種用于控制食品產品或飼料產品中、食品或飼料加工設備上和/或中、食品或飼料容器上和/或中的微生物污染的方法。

【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一種經常造成嚴重傳染性疾病和食物中毒的主要的人類病原體。其治療因為不斷出現抗生素耐藥菌株而變得越來越困難。來自感染了金黃色葡萄球菌的噬菌體的內溶素（endolysin)已顯示出潛在地將這些病原體控制在一定程度上并且可以用于它們的特異性檢測。在大多數情況下，靶向葡萄球菌物種的內溶素的應用中的主要障礙是低酶活性、難以大批量生產和/或蛋白質穩(wěn)定性。
[0003] 因此，仍然需要在例如抗微生物活性和/或穩(wěn)定性上具有改善特性的新抗微生物劑。

【發(fā)明內容】

[0004] 在第一方面，本發(fā)明提供了第一酶促活性結構域的源與第二酶促活性結構域的源的組合（combination),其中所述第一和第二酶促活性結構域表現出不同的（獨特的， distinct)革巴鍵（祀向鍵合，target bond)特異性并且被包含在不同的第一和第二多肽上，艮P，所述第一酶促活性結構域被包含在第一多肽上并且所述第二酶促結構域被包含在第二多肽上，其中所述第一和第二多肽各自具有不同的氨基酸序列。此外，本發(fā)明提供了第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源與第三酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一、第二和第三酶促活性結構域表現出不同的靶鍵特異性并且被包含在不同的第一、第二和第三多肽上，即，所述第一酶促活性結構域被包含在第一多肽上，所述第二酶促結構域被包含在第二多肽上，并且所述第三酶促結構域被包含在第三多肽上，其中所述第一、第二和第三多肽各自具有不同的氨基酸序列。此外，本發(fā)明提供了第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源、第三酶促活性結構域的源與另外的酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域表現出不同的靶鍵特異性并且被包含在不同的第一、第二、第三和另外的多肽上，即，所述第一酶促活性結構域被包含在第一多肽上，所述第二酶促結構域被包含在第二多肽上，所述第三酶促結構域被包含在第三多肽上，并且所述另外的酶促活性結構域被包含在另外的多肽上，其中所述第一、第二、第三和另外的多肽各自具有不同的氨基酸序列。另外的酶促活性結構域在本文中指的是第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多的酶促活性結構域，優(yōu)選第四酶促活性結構域。另外的多肽在本文中指的是第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多的多肽，優(yōu)選第四多肽。
[0005] 表現出肽聚糖水解酶活性的大多數天然金黃色葡萄球菌噬菌體內溶素由 C-末端細胞壁結合結構域（CBD)、中央的N-乙?；邗；?L-丙氨酸酰胺酶結構域 (N-acetylmuramoyl-L-Alanine amidase domain)以及具有半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)同源性的N-末端丙氨酰-甘氨酰肽鏈內切酶結構域組成，或在 Ply2638的情況下由具有肽酶_M23同源性的N-末端甘氨酰-甘氨酸肽鏈內切酶結構域組成，表現出肽聚糖水解酶活性的后三個結構域各自具有不同的靶鍵特異性并且在本文中一般地被稱為酶促活性結構域。在本發(fā)明的范圍內，根據本發(fā)明的第一酶促結構域具有水解特異靶鍵的催化活性，該特異靶鍵不同于被本發(fā)明的第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域水解的靶鍵。此外，在本發(fā)明的范圍內，根據本發(fā)明的第二酶促結構域具有水解特異靶鍵的催化活性，該特異靶鍵不同于被本發(fā)明所述的第一和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域水解的靶鍵。
[0006] 本發(fā)明人們驚奇地發(fā)現，同時應用兩種以上具有不同的靶鍵特異性的酶促活性結構域賦予了協同效應。出人意料的是，這不僅當具有不同特異性的酶促活性結構域如同在天然葡萄球菌內溶素中一樣位于同一分子上時有效，并且當所述具有不同特異性的酶促活性結構域被分離在不同的多肽上時也有效。
[0007] 使不同的酶促活性結構域位于分離的個體多肽上的益處是：所產生的多肽更小，可更容易地生產。此外，這些更小的多肽在特定的環(huán)境中具有更好的擴散性并且可以更耐降解并具有更高的熱穩(wěn)定性。另一個優(yōu)點是，可以以最適合于水解具體細菌靶細胞的比率，將位于獨立的不同的多肽分子上的獨立的不同的酶促活性結構域混合并匯集在可變組合物中?？梢酝ㄟ^使用來自于許多不同來源（包括噬菌體細胞溶素、細菌素、自溶素或任何其他細胞壁溶解酶）的具有幾乎任何靶鍵特異性的幾乎任何功能性酶促活性結構域來增補 (supplement)和/或補充（complement)根據本發(fā)明的組合。
[0008] 在本發(fā)明的上下文中，'組合'是指第一酶促活性結構域的源和第二酶促活性結構域的源被考慮并包括在內。此外，在本發(fā)明的上下文中，'組合'是指第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域的源被考慮并包括在內。每個源可以是與其他源在一起或一起存在或組合在一起或物理上接觸以形成一種單一組合物?？商娲兀總€源可以被包含在不同的組合物中。然而，本發(fā)明提供的認識是，需要或使用第一和第二酶促活性結構域的源兩者以獲得本文所定義的本發(fā)明的效果。如果每個源不存在于相同的單一組合物中，那么可以順序地或同時地使用每個源和/或包含本發(fā)明所述的組合的源的各個不同的組合物。
[0009] '第一酶促活性結構域的源'、'第二酶促活性結構域的源'、'第三酶促活性結構域的源'和'另外的酶促活性結構域的源'優(yōu)選地包含基于蛋白質的（蛋白質類， protein-based)來源（即，多肽、蛋白質、蛋白質的消化和/或蛋白質或消化的片段）或非基于蛋白質的（非蛋白質類，non protein-based)來源（即，編碼蛋白質或衍生的肽或蛋白質片段的核酸）。以下，我們定義了包括于本發(fā)明中的優(yōu)選的第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源、第三酶促活性結構域的源和另外的酶促活性結構域的源。由于本發(fā)明涉及第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域的源的組合，所以本文中定義的第一酶促活性結構域的源的每一個均可以與本文中定義的第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域的源的每一個進行組合。本發(fā)明還包括使用基于蛋白質的第一酶促活性結構域的源與非基于蛋白質的第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域的源的組合，反之亦然。
[0010] 本文中定義的"酶促活性結構域"是具有裂解活性（細胞溶解酶的活性，lytic activity)、優(yōu)選表現出肽聚糖水解酶活性的結構域。包含在根據本發(fā)明的不同的第一、第二、第三和/或另外的多肽上的根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性結構域的裂解活性可以由本領域技術人員熟知的方法來評估。在一個實施方式中，以分光光度法通過測量底物細胞懸浮液的池度（turbidity)下降來評估裂解活性。通過測量595nm波長下的光密度來評估濁度，通常當在595nm波長下培養(yǎng)物表現出至少0. 30D的光密度時，將該培養(yǎng)物稱為是混濁的。優(yōu)選地，以分光光度法通過測量金黃色葡萄球菌懸浮液的濁度的下降下評估裂解活性，其中通過分光光度（Libra S22, Biochrom)測量OD595來量化池度。更優(yōu)選地，在37°C下，在PBS緩沖液pH 7. 4、120mM氯化鈉中，將200nM本文中識別的第一、第二和/或第三多肽與由分光光度評估（Libra S22, Biochrom)具有1±0. 05的初始OD595 的金黃色葡萄球菌懸浮液一起孵育30min。通過從孵育30min前的所述OD595中減去孵育 30min后的OD 595來計算濁度的下降。在本發(fā)明的上下文中，當使用這種測定法時，如果檢測到至少10、20、30、40、50或60%的濁度下降，那么第一、第二和/或第三多肽可以被認為具有裂解活性。優(yōu)選地，檢測到至少70%的濁度下降。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及第一、第二、第三和/或另外的多肽，其表現出至少為30、40、50、60、70、80、90、100、150或200%或更多的裂解活性，該裂解活性為由SEQ ID NO: 1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體Φ2638a內溶素（由 SEQ ID N0:2識別的Ply2638內溶素）的裂解活性。
[0011] '表現出不同的靶鍵特異性'在本文中是指由任何根據本發(fā)明的第一、第二、第三或另外的酶促活性結構域針對靶鍵表現出酶促活性，該靶鍵不同于由任何其他的所述第一、第二、第三或另外的酶促活性結構域表現出酶促活性時所針對的靶鍵。
[0012] '被包含在不同的多肽上'在本文中是指任何所述第一、第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域被包含在多肽上，該多肽不同于任何其他的所述第一、第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域被包含在之上的多肽。
[0013] 根據本發(fā)明的多肽優(yōu)選是分離的多肽。根據本發(fā)明的核酸優(yōu)選是分離的核酸。根據本發(fā)明的核酸構建體優(yōu)選是分離的核酸構建體。
[0014] 在一個優(yōu)選的實施方式中，根據本發(fā)明的多肽包含編碼為易于純化的標簽（tag) 的序列。所述標簽選自但不限于由FLAG-標簽、聚（His)-標簽、HA-標簽和Myc-標簽所組成的群組。更優(yōu)選地，所述標簽是6xHis-標簽。甚至更優(yōu)選地，所述標簽是與SEQ ID N0:74 同一的并且由SEQ ID NO: 73編碼的N-末端6xHis-標簽（本文中表示為HXa)。
[0015] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的不同的靶鍵是細菌細胞的肽聚糖層中必不可少的鍵，優(yōu)選所述細菌細胞是葡萄球菌。在本文中，將革蘭氏陽性細菌細胞的肽聚糖層中的必不可少的鍵定義為所述肽聚糖中的鍵合（linkage)，該鍵合對于所述肽聚糖為所述細菌細胞提供形狀和耐滲透壓沖擊的剛性結構是必不可少的。優(yōu)選地，革蘭氏陽性細菌細胞的肽聚糖層中的所述必不可少的鍵是主干肽（stem peptide)的D-丙氨酸與橫橋肽（cross-bridge P印tide)的甘氨酸之間的鍵（本文中也定義為N-末端丙氨酸與甘氨酸之間的鍵）、五甘氨酸（pentaglycin)橫橋中的鍵（本文中也定義為五甘氨酸橋甘氨酰-甘氨酰鍵）、N-乙酰基胞壁?；cL-丙氨酸之間的鍵或N-乙?；诎罚∟-acetylmuramine)與N-乙酰葡糖胺之間或N-乙酰葡糖胺與N-乙?；诎分g的鍵（圖1)。革蘭氏陽性細菌細胞的肽聚糖層中的其他優(yōu)選的必不可少的鍵是Y -谷氨酰基主干肽中的鍵、主干肽中的L-丙氨酰基-異-D-谷氨酸之間的鍵和主干肽中的異-D-谷氨酸-L-賴氨酸之間的鍵。
[0016] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域是從由半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)結構域，肽鏈內切酶結構域和酰胺酶結構域組成的群組中選擇的結構域。此外，優(yōu)選地，所述第一、第二、第三和/或另外的酶促活性結構域是從由半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)結構域，肽鏈內切酶結構域，酰胺酶結構域和糖基水解酶結構域組成的群組中選擇的結構域。所述糖基水解酶結構域可以是胞壁質酶（muramidase)結構域或氨基葡萄糖苷酶（glycosaminidase)結構域。
[0017] 優(yōu)選地，所述CHAP結構域切割肽聚糖層內的N-末端丙氨酰和甘氨酰之間的鍵。更優(yōu)選地，所述CHAP特異性地切割肽聚糖層內的N-末端丙氨酰和甘氨酰之間的鍵。優(yōu)選地，所述肽鏈內切酶結構域切割肽聚糖層內的五甘氨酸橋甘氨酰-甘氨酰鍵。更優(yōu)選地，所述肽鏈內切酶特異性地切割肽聚糖層內的五甘氨酸橋甘氨酰-甘氨酰鍵。優(yōu)選地，所述酰胺酶結構域切割肽聚糖層內的中央N-乙酰基胞壁?；蚅-丙氨酸之間的鍵。更優(yōu)選地，所述酰胺酶結構域特異性地切割肽聚糖層內的中央N-乙?；邗；蚅-丙氨酸之間的鍵。優(yōu)選地，所述胞壁質酶結構域裂解肽聚糖層內的N-乙酰基胞壁胺和N-乙酰葡糖胺之間的鍵。更優(yōu)選地，所述胞壁質酶結構域特異性地切割肽聚糖層內的N-乙酰基胞壁胺和N-乙酰葡糖胺之間的鍵。優(yōu)選地，所述氨基葡萄糖苷酶結構域切割肽聚糖層內的N-乙酰葡糖胺和N-乙?；诎分g的鍵。更優(yōu)選地，所述氨基葡萄糖苷酶結構域特異性地切割肽聚糖層內的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰基胞壁胺之間的鍵。優(yōu)選地，所述肽聚糖層是革蘭氏陽性細菌細胞、優(yōu)選葡萄球菌、更優(yōu)選金黃色葡萄球菌的肽聚糖層。優(yōu)選地，如果使用本文中定義的酶促活性結構域對一種鍵的水解比使用所述酶促活性結構域對上文所定義的任何其他鍵的水解至少2、10、50或100倍更加有效，那么由所述酶促活性結構域對該種鍵的切割是特異性的。
[0018] 優(yōu)選地，涵蓋于本發(fā)明內的CHAP結構域來源于葡萄球菌噬菌體K和/或葡萄球菌噬菌體Twort。優(yōu)選地，涵蓋于本發(fā)明內的CHAP結構域是與SEQ ID NO: 10或12具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 % 的同一性的結構域。優(yōu)選地，涵蓋于本發(fā)明內的肽鏈內切酶結構域來源于金黃色葡萄球菌噬菌體 Φ2638&和/或模仿葡萄球菌（S. simulans)。優(yōu)選地，涵蓋于本發(fā)明內的肽鏈內切酶結構域與 SEQ ID 吣：14或16具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100%的同一性。優(yōu)選地，涵蓋于本發(fā)明內的酰胺酶結構域來源于金黃色葡萄球菌噬菌體〇2638a。優(yōu)選地，本發(fā)明的酰胺酶結構域與SEQ ID NO: 18具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0019] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多肽包含不同多重性的（a different multiplicity of)根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性結構域。"多重性（multiplicity)"在本文中定義為拷貝的數目。"不同多重性"在本文中定義為：包含于本發(fā)明的特異性多肽（即本文中識別的第一、第二、第三或另外的多肽）內的本發(fā)明的特異性酶促活性結構域（即本文中確定的第一、第二、第三或另外的酶促活性結構域）的多重性或拷貝的數目，不同于所述相同的酶促活性結構域在本發(fā)明的組合的另一種多肽內的多重性或拷貝的數目。例如，本發(fā)明的組合包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含具體數目的第一酶促活性結構域的拷貝，而所述第二多肽包含不同數目的所述第一酶促活性結構域的拷貝。此外，所述本發(fā)明的示例性組合的所述第一多肽可以進一步包含具體數目的第二酶促活性結構域的拷貝，該數目不同于包含于所述組合的所述第二多肽上的所述第二酶促活性結構域的拷貝的數目。此外，所述本發(fā)明的示例性組合的任何另外的多肽可以包含一定數目的另外的酶促活性結構域的拷貝，該數目不同于包含于所述組合的所述第一和第二多肽上的所述另外的酶促活性結構域的拷貝的數目。雖然相比于每個單獨的多肽的裂解活性，各自包含單個不同的酶促活性結構域的不同的多肽的組合顯示出了協同裂解活性，但本發(fā)明人們驚奇地發(fā)現，與包含單個酶促活性結構域的多肽相比，包含多重性的酶促活性結構域的多肽顯示出更優(yōu)異的裂解活性。
[0020] 此外，相比于其中所有所述不同的多肽均只包含單個不同的酶促活性結構域的組合，發(fā)現不同的酶促結構域在不同的多肽上（其中至少一個所述不同的多肽包含多重性的酶促活性結構域）的組合更優(yōu)異。另外發(fā)現，其中根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多肽分別包含多重性的根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性結構域的根據本發(fā)明的組合，相比于其中所述第一、第二、第三和/或另外的多肽分別包含單個拷貝的所述第一、第二、第三和/或另外的酶促活性結構域的根據本發(fā)明的組合而言更加優(yōu)異，并且優(yōu)選其中本文所定義的所述多重性為2,即兩重。在優(yōu)選的實施方式中，發(fā)現，根據本發(fā) 明的組合（其中根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多肽分別包含多重性的根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的酶促活性結構域）的協同效應，相比于其中所述第一、第二、第三和另外的多肽分別包含單個拷貝的所述第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域的本發(fā)明所述的組合而言更加優(yōu)異，并且優(yōu)選地其中本文所定義的所述多重性為2,即兩重。
[0021] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一和/或第二多肽包含不同多重性的根據本發(fā)明的第一和/或第二酶促活性結構域。如前文定義，所述第一和第二結構域的多重性為所述第一和第二結構域的拷貝的數目，優(yōu)選地由以下所示的k、1、η和p來表示：
[0022] k表示所述第一多肽上的所述第一酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0023] 1表示所述第一多肽上的所述第二酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0024] η表示所述第二多肽上的所述第一酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0025] ρ表示所述第二多肽上的所述第二酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0026] 并且其中 k和 ρ 獨立地為來自 1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3 或優(yōu)選 1-2 的整數，且1和η獨立地為來自0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3或優(yōu)選0-2的整數，并且其中k為不同于η的整數和/或1是不同于ρ的整數，最優(yōu)選k和ρ為2且1和η為 0〇
[0027] 優(yōu)選地，本發(fā)明的第一、第二和第三多肽包含不同多重性的根據本發(fā)明的第一、第二和第三酶促活性結構域。
[0028] 所述第一、第二和第三結構域的多重是如前文定義為所述第一、第二和第三結構域的拷貝的數目，優(yōu)選地由如下所示的k、1、m、n、p、q、r、s和t來表示：
[0029] k表示所述第一多肽上的所述第一酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0030] 1表示所述第一多肽上的所述第二酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0031] m表示所述第一多肽上的所述第三酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0032] η表示所述第二多肽上的所述第一酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0033] ρ表示所述第二多肽上的所述第二酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0034] q表示所述第二多肽上的所述第三酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0035] !表示所述第三多肽上的所述第一酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0036] s表示所述第三多肽上的所述第二酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0037] t表示所述第三多肽上的所述第三酶促活性結構域的拷貝的數目；
[0038] 并且其中 k、p 和 t 獨立地為來自 1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3 或優(yōu)選 1-2 的整數，并且1、m、n、q、r和s獨立地為來自0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3或優(yōu)選 0-2的整數，并且其中k是不同于η和/或r的整數，和/或1是不同于ρ和/或s的整數，和/或t是不同于m或q的整數，最優(yōu)選地k、ρ和t是2且l、m、n、q、r和s是0。
[0039] 優(yōu)選地，本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的多肽包含不同多重性的根據本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域。鑒于所述第一、第二和第三酶促活性結構域，所述另外的酶促活性結構域的多重性在本文中應以類似于上文為第一、第二和第三酶促活性結構域定義的方式進行解釋。
[0040] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三或另外的多肽具有至少140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 個氨基酸的長度和 / 或至多 850、800、750、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、 410、400、390、380或370個氨基酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二或第三多肽具有 140-850、140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、140-490、 140-480、140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、140-400、 140-390、140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、200-850、 210-850、220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、290-850、 300-850、310-850、320-850 或 330-850 個氨基酸的長度。
[0041] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一和第二多肽各自具有至少140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 個氨基酸的長度和 / 或至多 800、850、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、 380或370個氨基酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一和第二多肽各自具有140-850、 140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、140-490、140-480、 140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、140-400、140-390、 140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、200-850、210-850、 220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、290-850、300-850、 310-850、320-850或330-850個氨基酸的長度。
[0042] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二和第三多肽各自具有至少140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 個氨基酸的長度和 / 或至多 800、850、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、 400、390、380或370個氨基酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二和第三多肽各自具有 140-850、140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、140-490、 140-480、140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、140-400、 140-390、140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、200-850、 210-850、220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、290-850、 300-850、310-850、320-850 或 330-850 個氨基酸的長度。
[0043] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的多肽各自具有至少140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320 或 330 個氨基酸的長度和 / 或至多 800、850、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、 410、400、390、380或370個氨基酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的多肽各自具有 140-850、140-800、140-750、140-700、140-650、140-600、140-550140-500、 140-490、140-480、140-470、140-460、140-450、140-440、140-430、140-420、140-410、 140-400、140-390、140-380、140-370、150-850、160-850、170-850、180-850、190-850、 200-850、210-850、220-850、230-850、240-850、250-850、260-850、270-850、280-850、 290-850、300-850、310-850、320-850 或 330-850 個氨基酸的長度。
[0044] -個實施方式提供了根據本發(fā)明的第一和第二酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一和第二酶促活性結構域被包含在不同的本發(fā)明的第一和第二多肽上，其中所述第一多肽不含所述第二酶促活性結構域并且所述第二多肽不含所述第一酶促活性結構域。此夕卜，提供了根據本發(fā)明的組合，其中1和η均為0。
[0045] 另一個實施方式提供了根據本發(fā)明的第一、第二和第三酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一、第二和第三酶促活性結構域被包含在不同的第一、第二和第三多肽上，其中所述第一多肽不含所述第二和第三酶促活性結構域，所述第二多肽不含所述第一和第三酶促活性結構域，并且所述第三多肽不含所述第一和第二酶促活性結構域。此外，提供了根據本發(fā)明的組合，其中l(wèi)、m、n、q、r和s均為0。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的組合，其中1、m、n、q、r和s均為0且k、p和t均為2。
[0046] 另一個實施方式提供了根據本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域被分別包含在不同的第一、第二、第三和另外的多肽上，其中：
[0047] 優(yōu)選所述第一多肽不含所述第二、第三和另外的酶促活性結構域；
[0048] 優(yōu)選所述第二多肽不含所述第一、第三和另外的酶促活性結構域；
[0049] 優(yōu)選所述第三多肽不含所述第一、第二和另外的酶促活性結構域；并且，
[0050] 優(yōu)選所述另外的多肽不含所述第一、第二和第三酶促活性結構域。
[0051] 優(yōu)選地，所述第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域分別一式兩份地包含在所述第一、第二、第三和另外的多肽內，即，其中本文所確定的多重性為2。還涵蓋的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一、第二和/或第三多肽含有根據本發(fā)明的第一、第二和 /或第三酶促活性結構域，但是所述第一、第二和/或第三多肽在所述第一、第二和/或第三酶促活性結構域的多重性上是不同的。此外，涵蓋的是根據本發(fā)明的組合，其中k、l、m、n、 p、q、r、s或t中的至少一個是2并且其中任何其他的k、1、m、np、q、r、s和/或t是1或 0〇
[0052] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的多肽進一步包含細胞壁結合結構域。此外，各自包含至少一種本文所定義的酶促活性結構域的根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多肽，進一步包含細胞壁結合結構域。本發(fā)明的細胞壁結合結構域被定義一種要素，優(yōu)選處于所述不同的多肽內的多肽，其將所述不同的多肽引導至細菌的細胞壁。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞壁結合結構域是一個要素，優(yōu)選處于所述不同的多肽內的多肽，其將所述不同的多肽引導至革蘭氏陽性細菌細胞的肽聚糖細胞壁（優(yōu)選葡萄球菌屬細菌細胞的肽聚糖細胞壁）。
[0053] 可以使用本領域技術人員眾所周知的檢定法（assay)來評估結構域與葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁的結合。在一個優(yōu)選的實施方式中，使用免疫組化技術或產生標記的構建體的基因融合技術來評估肽、多肽或蛋白質與葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁的特異性結合。在上述免疫組化或融合技術中使用的信號的定量方法為本領域技術人員所熟知。
[0054] 在一個實施方式中，使用包含目標細胞壁結構域的熒光融合構建體來定量葡萄球菌膚聚糖細胞壁結合。由 Loessner 等（Molecular Microbiology2002, 44 (2) : 335 - 349)對此種細胞壁結合測定法進行了詳細的描述。在這種測試法中，使包含所述熒光融合構建或陰性對照（優(yōu)選綠色熒光蛋白（GFP))的溶液經受（subjected to)葡萄球菌細胞（優(yōu)選金黃色葡萄球菌細胞，更優(yōu)選金黃色葡萄球菌BB255)指定的一段時間，之后，通過離心將細胞與結合的熒光融合構建體一起沉淀。將暴露于熒光融合構建體的葡萄球菌細胞的熒光信號減去暴露于陰性對照（優(yōu)選GFP)的葡萄球菌細胞的熒光信號即為本公開所指的細胞結合的量度。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，當使用這種測定法檢測到沉淀的細胞的熒光信號提高至本文所定義的陰性對照之上時，則認為結構域結合葡萄球菌屬的肽聚糖細胞壁。優(yōu) 選地，本發(fā)明涉及細胞壁結合結構域，其表現出本發(fā)明定義的結合的至少50、60、70、80、90 或100、150或200%的由SEQ ID N0:1編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體〇2638a內溶素（由 SEQ ID NO:2定義的Ply2638內溶素）的肽聚糖細胞壁結合。
[0055] 涵蓋于本發(fā)明內的細胞壁結合結構域可以是本領域技術人員已知的任何細胞壁結合結構域。優(yōu)選的本發(fā)明的細胞壁結合結構域是與本文中由SEQ ID N0:4定義且由SEQ ID NO:3編碼的模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素的細胞壁結合結構域具有至少80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的細胞壁結合結構域。還優(yōu)選的是分離自天然葡萄球菌噬菌體內溶素的細胞壁結合結構域。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞壁結合結構域與本文中由SEQ ID NO: 6定義且由SEQ ID NO: 5編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體〇2638a內溶素的細胞壁結合結構域具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。還優(yōu)選的是分離自天然金黃色葡萄球菌噬菌體phiNM3內溶素的細胞壁結合結構域。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞壁結合結構域與本文中由SEQ ID N0:8定義且由SEQ ID N0:7編碼的金黃色葡萄球菌噬菌體phi匪3內溶素的細胞壁結合結構域具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99 或 100%的同一性。
[0056] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的細胞壁結合結構域位于所述不同的第一、第二、第三和/或另外的多肽中的酶促活性結構域的C-末端側。但應當進一步理解的是，涵蓋的是根據本發(fā) 明的組合，其中根據本發(fā)明的不同的第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽的不同之處不僅在于它們的特異性酶促活性結構域，還在于它們的特異性細胞壁結合結構域。即使是這樣的根據本發(fā)明的組合也處于本發(fā)明的范圍內，其中根據本發(fā)明的不同的第一、第二和可選的第三多肽不含根據本發(fā)明的細胞壁結合結構域。此外，這樣的根據本發(fā)明的組合也在本發(fā)明的范圍內，其中一個或兩個根據本發(fā)明的第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽不含細胞壁結合結構域。
[0057] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多肽是與從由 SEQ ID N0:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、 64、66、68、70或72組成的群組中選擇的多肽具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的多肽。
[0058] 在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了第一酶促活性結構域和第二酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一和第二酶促活性結構域被包含在不同的第一和第二多肽上，并且其中所述第一酶促活性結構域是半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域，或者其中所述第一酶促活性結構是半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是酰胺酶結構域，或者其中所述第一酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是酰胺酶結構域，其中所述不同的第一和第二多肽各自進一步包含細胞壁結合結構域，并且其中所述不同的第一和第二多肽的每一個均包含多重性的所述第一或第二酶促活性結構域，優(yōu)選地所述多重性是2,即兩重。此外，在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了第一和第二酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一和第二酶促活性結構域被包含在不同的第一和第二多肽上，并且其中所述第一酶促結構是組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域，或者所述第一酶促活性結構域是半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是酰胺酶結構域，或者所述第一酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是酰胺酶結構域，并且其中所述第一和第二多肽各自進一步包含細胞壁結合結構域。
[0059] 在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了第一酶促活性結構域和第二酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一和第二酶促活性結構域被包含在不同的第一和第二多肽上，并且其中所述第一酶促活性結構域是半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域，并且其中所述組合進一步包含第三酶促活性結構域的源，該第三酶促活性結構域被包含在不同的第三多肽上，其中所述第三酶促活性結構域是酰胺酶結構域并且所述不同的第一、第二和第三多肽各自進一步包含細胞壁結合域，并且其中所述第一、第二和第三酶促活性結構域的每一個均包含多重性的所述第一、第二或第三酶促活性結構域，優(yōu)選地所述多重性是2,即兩重。此外，在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了第一、第二和第三酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一、第二和第三酶促活性結構域被包含在不同的第一、第二和第三多肽上，并且其中所述第一酶促結構域是組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域，所述第二酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域并且所述第三酶促活性結構域是酰胺酶結構域，并且其中所述第一、第二和第三多肽各自進一步包含細胞壁結合結構域。
[0060] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中，根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域與SEQ ID NO: 10 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域與SEQ ID NO: 16具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0061] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中，根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域與SEQ ID NO: 10 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域與SEQ ID NO: 18具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0062] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中，根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域與SEQ ID NO: 16 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域與SEQ ID NO: 18具有至少80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0063] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0064] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0065] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:46具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0066] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0067] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:52具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0068] 更優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:70具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:52具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0069] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0070] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0071] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:70具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:34具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0072] 更優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:70具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:28具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0073] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:52具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:34具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0074] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:52具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性并且根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0075] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域與SEQ ID NO: 10 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域與SEQ ID NO: 16具有至少80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三酶促活性結構域與SEQ ID N0:18具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0076] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0077] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:32具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0078] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0079] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:36具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:48具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:30 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0080] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:32具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0081] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:26 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0082] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:32具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0083] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:32具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0084] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:44具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0085] 優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID NO:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0086] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:50 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0087] 進一步優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:56 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與 SEQ ID 吣：50具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99或100%的同一性。
[0088] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:60具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:72具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:54 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0089] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:56具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:50 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0090] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:50 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0091] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:56具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0092] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:65具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0093] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:68具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0094] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0095] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0096] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0097] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:52 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0098] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:58具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:46具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID NO:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。
[0099] 還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，其中根據本發(fā)明的第一多肽與SEQ ID N0:34具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，根據本發(fā)明的第二多肽與SEQ ID N0:70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，并且根據本發(fā)明的第三多肽與SEQID N0:28 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性。但應當理解的是，根據本發(fā)明的組合包含不同比例的根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域的源的混合物。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的組合包含根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源和第二酶促活性結構域的源，其中所述第一和第二酶促活性結構域以等摩爾量存在。還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，包含根據本發(fā)明的第一的源、第二的源和第三酶促活性結構域的源，其中所述第一、第二和第三酶促活性結構域以等摩爾量存在。還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合，包含第一酶促活性結構域的源、第二酶促活性結構域的源、第三酶促活性結構域的源和另外的酶促活性結構域的源，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域以等摩爾量存在。
[0100] 在第二方面，本發(fā)明提供了根據第一方面的組合，其中根據本發(fā)明的第一方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域包含多肽。所述多肽可以是蛋白質、蛋白質的消化物（digest)和/或蛋白質或消化物的片段，其可以是純化的形式或可以被包含于粗制組合物，優(yōu)選為生物來源，例如細菌裂解液、酵母裂解液、真菌裂解液、超聲處理液或固定液（sonicate or fixate)?？商娲?，所述多肽可以是化學合成的多肽或在體外產生的重組多肽。
[0101] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源包含根據本發(fā)明的第一方面的第一多肽，根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域包含根據本發(fā)明的第一方面的第二多肽并且根據本發(fā)明的可選的第三酶促活性結構域包含根據本發(fā)明的第一方面的第三多肽并且根據本發(fā)明的可選的另外的酶促活性結構域包含根據本發(fā)明的第一方面的另外的多肽。更優(yōu)選地，所述第一酶促活性結構域的所述源由根據本發(fā)明的第一方面的第一多肽組成，所述第二酶促活性結構域由根據本發(fā)明的第一方面的第二多肽組成，所述第三酶促活性結構域由根據本發(fā)明的第一方面的第三多肽組成，并且所述另外的酶促活性結構域由根據本發(fā)明的進一步方面的第三多肽組成。
[0102] 一個實施方式包括根據本發(fā)明的組合，其中本發(fā)明的第一、第二和/或可選的第三和/或另外的多肽是變體第一、第二和/或第三和/或另外的多肽。變體多肽可以是多肽的非天然存在的形式。多肽變體可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離出的多肽。變體可以由編碼本文中定義且由SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71 或 73 表示的多肽的核苷酸序列開始通過定位誘變來制得。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的多肽變體與任何的 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72 或 74 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的同一性。優(yōu)選地，在根據本發(fā)明的組合中，多肽變體含有不會改變所編碼的多肽的生物學功能的突變。
[0103] 根據本發(fā)明的多核苷酸與任何的SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71 或 73 可以具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 %的同一性，或者可替代地在嚴格條件下與這些給定的序列雜交。嚴格雜交條件是如本領域中理解的那些，例如在56°C下在6x SSC(20xSSC每1000ml:175.3g NaCl，107. Ig檸檬酸鈉.5!120，口!17.0)、0.1%505、0.05%焦磷酸鈉、5和6111^1肚氏溶液和2(^8/1111變性青魚精DNA中雜交18?24小時，隨后在56°C下在5x SSC、0. 1 % SDS中洗滌兩次，每次各30 分鐘，并且在56°C下在2x SSC、0. 1% SSC中洗滌兩次，每次各30分鐘。
[0104] 根據一個優(yōu)選的實施方式，如在本文先前所確定的測定法中測量的，多肽變體表現出的溶解或細胞壁結合活性與SEQ ID N0:2的溶解和/或細胞壁結合活性相比是相同的或增強。
[0105] 應當理解的是，根據本發(fā)明的組合包括不同比例的根據本發(fā)明的第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽的混合物。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的組合包含根據本發(fā)明的第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽，其中第一和第二酶促活性結構域以等摩爾量存在。還優(yōu)選的是根據本發(fā)明的組合包含等摩爾量的根據本發(fā)明的第一、第二和可選的第三和/ 或另外的多肽，其中第一、第二和第三和/或另外的酶促活性結構域以等摩爾量存在。
[0106] 在第三方面，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的第一方面的組合，其中根據本發(fā)明的第一方面的第一酶促活性結構域的源包含編碼所述第一酶促活性結構域的多核苷酸，根據本發(fā)明的第一方面的第二酶促活性結構域的源包含編碼所述第二酶促活性結構域的多核苷酸，并且可選地根據本發(fā)明的第一方面的第三酶促活性結構域的源包含編碼所述第三酶促活性結構域的多核苷酸，并且可選地根據本發(fā)明的第一方面的進一步酶促活性結構域的源包含編碼所述另外的酶促活性結構域的多核苷酸。所述多核苷酸可以是RNA或DNA分子。
[0107] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的組合，其中第一多核苷酸編碼根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域并且第二多核苷酸編碼根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域。優(yōu)選地，在根據本發(fā)明的組合中，根據本發(fā)明的第一和/或第二多核苷酸進一步編碼本文中定義的細胞壁結合結構域。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的組合，其中第一多核苷酸編碼根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域，第二多核苷酸編碼根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域，第三多核苷酸編碼根據本發(fā)明的第三酶促活性結構域并且另外的多核苷酸編碼根據本發(fā)明的另外的酶促活性結構域。優(yōu)選地，在根據本發(fā)明的組合中，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸進一步編碼本文中定義的細胞壁結合結構域。
[0108] 本發(fā)明進一步提供了根據本發(fā)明的組合，其中本發(fā)明的第一、第二和/或可選的第三和/或另外的多肽是由天然存在的或改造的（retrofit)多核苷酸構建體編碼的嵌合的第一、第二、第三和/或另外的多肽。改造的構建體在本文中被定義為包含異源核苷酸序列的多核苷酸。本文所用的術語異源序列或異源多核苷酸是非天然發(fā)現的可操作地連接為鄰近序列的所述第一核苷酸序列。本文中使用的術語異源可以是指重組體。重組體是指一種遺傳實體，其不同于通常在自然界中發(fā)現的遺傳實體。當適用于核苷酸序列或核酸分子時，這意味著所述核苷酸序列或核酸分子是克隆、限制（restriction)和/或連接步驟以及導致產生與在自然界中發(fā)現的序列或分子不同的構建體的其他工序的各種組合的產物。優(yōu)選地，在根據本發(fā)明的組合中，所述嵌合多肽包含至少一個如上文所定義的第一、第二或第三多肽并且進一步包含至少一種如上文所定義的細胞結合結構域。
[0109] 一個可替代的實施方式提供了本發(fā)明的組合，其中嵌合多肽包含本文所定義的內溶素，該內溶素共價地連接至其C-末端的疏水性五肽，優(yōu)選所述疏水性五肽是 Phe-Phe-Val-Ala-Pro,這增加了所述內溶素的殺菌作用，特別是針對革蘭氏陰性菌的殺菌作用，如 Ibrahim 等，1994 (JBC 1994Vol. 269, P. 5053-5063)的報道。
[0110] 優(yōu)選地，在根據本發(fā)明的組合中，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸具有至少 420、450、480、510、540、570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、 870、900、930、960 或 990 個核苷酸的長度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、 1650、1500、1470、1440、1410、1380、1350、1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040 或 1100 個核苷酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸具有 420-2550、420-2400、420-2250、420-2100、420-1950、420-1800、420-1650、420-1500、 420-1470、420-1440、420-1410、420-1380、420-1350、420-1320、420-1290、420-1260、 420-1230、420-1200、420-1070、420-1040 或 420-1100、450-2550、480-2550、510-2550、 540-2550,570-2550,600-2550,630-2550,660-2550,690-2550,720-2550,750-2550, 780-2550、810-2550、840-2550、870-2550、900-2550、930-2550、960-2550 或 990-2550 個核苷酸的長度。
[0111] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一和第二多核苷酸各自具有至少420、450、480、510、540、 570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、870、900、930、960 或 990 個核苷酸的長度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、1650、1500、1470、1440、1410、1380、1350、 1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040或1100個核苷酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā) 明的第一和第二多核苷酸各自具有 420-2550、420-2400、420-2250、420-2100、420-1950、 420-1800、420-1650、420-1500、420-1470、420-1440、420-1410、420-1380、420-1350、 420-1320、420-1290、420-1260、420-1230、420-1200、420-1070、420-1040 或 420-1100、 450-2550、480-2550、510-2550、540-2550、570-2550、600-2550、630-2550、660-2550、 690-2550、720-2550、750-2550、780-2550、810-2550、840-2550、870-2550、900-2550、 930-2550、960-2550 或 990-2550 個核苷酸的長度。
[0112] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二和第三多核苷酸各自具有至少420、450、480、 510、540、570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、870、900、930、960 或 990 個核苷酸的長度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、1650、1500、1470、1440、1410、1380、 1350、1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040 或 1100 個核苷酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二和第三多核苷酸各自具有420-2550、420-2400、420-2250、420-2100、 420-1950、420-1800、420-1650、420-1500、420-1470、420-1440、420-1410、420-1380、 420-1350、420-1320、420-1290、420-1260、420-1230、420-1200、420-1070、420-1040 或 420-1100,450-2550,480-2550,510-2550,540-2550,570-2550,600-2550,630-2550, 660-2550、690-2550、720-2550、750-2550、780-2550、810-2550、840-2550、870-2550、 900-2550、930-2550、960-2550 或 990-2550 個核苷酸的長度。
[0113] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的多核苷酸各自具有至少420、450、 480、510、540、570、600、630、660、690、720、750、780、810、840、870、900、930、960 或 990 個核苷酸的長度和 / 或至多 2550、2400、2250、2100、1950、1800、1650、1500、1470、1440、1410、 1380、1350、1320、1290、1260、1230、1200、1070、1040 或 1100 個核苷酸的長度。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和另外的多核苷酸各自具有420-2550、420-2400、420-2250、 420-2100、420-1950、420-1800、420-1650、420-1500、420-1470、420-1440、420-1410、 420-1380、420-1350、420-1320、420-1290、420-1260、420-1230、420-1200、420-1070、 420-1040、或 420-1100、450-2550、480-2550、510-2550、540-2550、570-2550、600-2550、 630-2550、660-2550、690-2550、720-2550、750-2550、780-2550、810-2550、840-2550、 870-2550、900-2550、930-2550、960-2550 或 990-2550 個核苷酸的長度。
[0114] 在第四方面，本發(fā)明提供了上文所定義的多肽和/或多核苷酸。優(yōu)選地，所述多肽是任何本發(fā)明的第二方面中定義的第一、第二、第三和/或另外的多肽。優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼任何所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。優(yōu)選地，所述多核苷酸是任何本發(fā) 明的第三方面中定義的第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸。優(yōu)選地，所述多肽包含活性結構域、細胞壁結合結構域和可選的本文中定義的為了便于純化的標簽和/或由酶促活性結構域、細胞壁結合結構域和可選的本文中定義的為了便于純化的標簽組成，優(yōu)選地所述酶促活性結構域是半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域、肽鏈內切酶結構域或酰胺酶結構域，并且優(yōu)選地所述多肽包含多重性的所述酶促活性結構域，優(yōu)選地所述多重性是2,即兩重。優(yōu)選地，所述多肽與任何的SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70 或 72 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100% 的同一性。所述多核苷酸與任何的 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69 或 71 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 % 的同一性，或者可替代地在嚴格條件下能夠與這些給定的序列雜交。更優(yōu)選地，所述多肽包含兩重的酰胺酶結構域和細胞壁結合結構域和可選的本文中定義的為便于純化的標簽和/或由兩重的酰胺酶結構域和細胞壁結合結構域和可選的本文中定義的為便于純化的標簽組成，優(yōu) 選地所述酰胺酶結構域是金黃色葡萄球菌噬菌體〇2638a內溶素并且所述細胞壁結合結構域是模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素（Iysostaphin)。最優(yōu)選地，所述多肽包含兩重的肽鏈內切酶結構域和細胞壁結合結構域和可選的本文中定義的為便于純化的標簽和/或由兩重的肽鏈內切酶結構域和細胞壁結合結構域和可選的本文中定義的為便于純化的標簽組成，優(yōu)選地所述肽鏈內切酶結構域是模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素的肽酶_M23結構域并且所述細胞壁結合結構域是模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素。
[0115] 優(yōu)選地，所述多肽與 SEQ ID 勵:28、34、46、52、58或70具有至少80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，更優(yōu)選地，所述多肽與 SEQ ID 勵：28、46、52或70具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99或100%的同一性，甚至更優(yōu)選地，所述多肽與SEQ ID N0:46或70具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%的同一性，最優(yōu)選地所述多肽與 SEQ ID N0:70 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。優(yōu)選地所述多核苷酸編碼任何所示的優(yōu) 選的多肽。
[0116] 優(yōu)選地，所述多核苷酸與SEQ ID勵:27、33、45、51、57或69具有至少80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，或可替代地能夠在嚴格條件下與這些給定的序列雜交。優(yōu)選地，所述多肽與SEQ ID N0:27、45、51或 69 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100% 的同一性，或可替代地能夠在嚴格條件下與這些給定的序列雜交。甚至更優(yōu)選地，所述多肽與 SEQ ID N0:45 或 69 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100 %的同一性，或可替代地在嚴格條件下能夠與這些給定的序列雜交。最優(yōu)選地,所述多肽與 SEQ ID N0:69 具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性，或者可替代地在嚴格條件下能夠與這些給定的序列雜交。
[0117] 在另一個實施方式中，所述多肽不是SEQ ID NO:70和/或所述多核苷酸不是SEQ ID N0:69。
[0118] 在第五方面，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明的第三方面的組合和/或第四方面的多核苷酸，其中根據本發(fā)明的第三方面和/或第四方面的多核苷酸存在于表達構建體中。此外，所述第一、第二和/或第三和/或另外的多核苷酸可以存在于表達構建體中。所述表達構建體可以是優(yōu)選地包含于囊泡或脂質體中的'裸' DNA或RNA，或都可以是包含于表達載體中。優(yōu)選地所述表達構建體是表達載體，更優(yōu)選地是質粒、粘粒、噬菌體或通過導入編碼如上文中定義的第一、第二或第三多肽的多核苷酸而轉化的病毒，并且其中所述多核苷酸可操作地連接至一個或多個控制子（control)，所述控制子引導該編碼的多肽在細胞、受試者或非細胞體系中的生產或表達。視待轉化的宿主生物體而定的這樣的轉化載體為本領域技術人員所熟知并且廣泛地描述于文獻中。所述表達構建體也可以是任何DNA或RNA病毒，例如但不限于腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、改良型牛痘Nakara病毒或禽痘病毒或適用于賦予將多肽表達到選定的受試者中的任何其他病毒載體。DNA載體可以是非整合的，例如另外的型（印isomally)復制載體，或者可以是通過隨機整合或通過同源重組而整合到宿主基因組中的載體。表達載體可以被視為一種重組表達載體。
[0119] 在本發(fā)明的范圍內，根據本發(fā)明的第一、第二、第三和/或第四多核苷酸可以存在于不同的表達構建體上或者可以組合地存在于單個表達構建體上。此外，在本發(fā)明的組合中，所述第一多核苷酸可以存在于第一表達構建體上而第二多核苷酸可以存在于第二表達構建體上。此外，在本發(fā)明的組合中，所述第一多核苷酸可以存在于第一表達構建體上，所述第二多核苷酸存在于第二表達構建體上，所述第三多核苷酸存在于第三表達構建體上，并且所述另外的多核苷酸存在于另外的表達構建體上。還包括在本發(fā)明的范圍內的是，第一、第二、第三和/或另外的多核苷酸被包含在單個表達構建體上。其中本發(fā)明的兩個多肽存在于單個表達構建體上，而它們中的一個存在于不同的表達構建體上組合也是可能的。
[0120] 在第六方面，提供了一種根據本發(fā)明的第三方面的組合和/或第四方面的多核苷酸，其中根據本發(fā)明的第五方面所述的表達構建體存在于表達系統中。在本發(fā)明的范圍內，所述表達系統可以是細胞，優(yōu)選地是微生物、原核或真核細胞，其適合于表達本發(fā)明的多肽。在優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是大腸桿菌（E. coli)。在甚至更優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是大腸桿菌XLlBlue MRF'。
[0121] 在第七方面，提供了一種用于轉化宿主生物體或細胞的方法，其通過導入至少一種根據本發(fā)明的多核苷酸，所述轉化可以通過已經廣泛地描述于專業(yè)文獻且特別是本申請引用的參考文獻中的任何適合的已經方法來實施，更特別地是通過本發(fā)明所述的載體來實施。在本發(fā)明的范圍內，本文所定義的所述第一、第二、第三和/或另外的多肽可以存在于單個轉化的宿主生物體或細胞中或者存在于不同的轉化的宿主生物體或細胞中。細胞可以是適合于表達本發(fā)明的多肽的任何微生物、原核或真核細胞。在優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是大腸桿菌。在甚至更優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是大腸桿菌XLlBlue MRF'。用于生產、可選地純化和可選的冷凍干燥如本文中定義的第一、第二、第三和/或另外的多肽的優(yōu) 選方法包括下列步驟：
[0122] i)在包含如本文中定義的表達構建體的細胞中生產所述第一、第二、第三和/或另外的多肽，可選地
[0123] ii)純化所述第一、第二、第三和/或另外的多肽，并且可選地
[0124] iii)冷凍干燥所述經純化的第一、第二、第三和/或另外的多肽。
[0125] 在一個優(yōu)選的實施方式中，利用重組技術在步驟i)中使用大腸桿菌以生產所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。更優(yōu)選地，利用重組技術在步驟i)中使用大腸桿菌 XLlBlueMRF以生產所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。優(yōu)選地，在步聚ii)中，使用裝填有5mL低密度鎳螯合瓊脂糖珠（ABT珠）的IMAC和Econo-Pac色譜柱（Biorad)、結合重力流以純化所述第一、第二、第三和/或另外的多肽。所述洗脫出的第一、第二、第三和/或另外的多肽可以相對于3x 11凍干緩沖液進行透析2、4和12小時，所述緩沖液優(yōu)選地包含 50mM磷酸鹽、500mM蔗糖、200mM甘露糖醇、0. 005%聚山梨酯20, pH 7. 4。
[0126] 甚至更優(yōu)選地的，用于生產、可選地純化和冷凍干燥如本文中定義的第一、第二、第三和/或另外的多肽的所述方法，進一步包括一種處理所述由上述的方法獲得的第一、第二、第三和/或另外的多肽的方法。所述處理包括取代二價金屬離子用于增加相比于未經處理的第一、第二、第三和/或另外的多肽的裂解活性，優(yōu)選地所述方法包括步驟：
[0127] iv)相對于包含螯合化合物的緩沖液透析所述多肽；
[0128] V)相對于含有二價金屬離子的緩沖液透析所述多肽，優(yōu)選地所述二價金屬離子是從由Mn 2+、Co2+、Cu2+和Zn2+組成的群組中選擇的。
[0129] "螯合化合物"在本文中被定義為結合金屬離子的化合物。眾所周知的螯合化合物是乙二胺四乙酸（EDTA)和乙二醇四乙酸（EGTA)。優(yōu)選地在本文所述的方法的步驟V)中使用EDTA。優(yōu)選地，所述方法的步驟V)的二價金屬離子是從由Mn 2+、Co2+、Cu2+組成的群組中選擇的，更優(yōu)選地，所述二價金屬離子是從由Mn 2+和Co2+組成的群組中選擇的，甚至更優(yōu)選地所述二價金屬離子是Μη2+。
[0130] 在本發(fā)明的第八方面，根據本發(fā)明的第一方面的組合存在于至少兩種不同的組合物中。此外，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明的組合，其中第一組合物包含根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源并且第二組合物包含根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域的源，其中所述第一和第二酶促活性結構域被包含在根據第一方面的不同的第一和第二多肽上，優(yōu)選地其中所述第一組合物不含所述第二酶促活性結構域的源并且所述第二組合物不含所述第一酶促活性結構域的源。此外，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的組合，其中第一組合物包含根據本發(fā) 明的第一酶促活性結構域的源，第二組合物包含根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域的源，第三組合物包含根據本發(fā)明的第三酶促活性結構域的源，并且另外的組合物包含根據本發(fā) 明的另外的酶促活性結構域的源，其中所述第一、第二、第三和另外的酶促活性結構域被包含在根據本發(fā)明的第一方面的不同的第一、第二、第三和另外的多肽上，優(yōu)選地其中所述第一組合物不含所述第二、第三和另外的酶促結構域的所述源，所述第二組合物不含所述第一、第三和另外的酶促活性結構域的所述源，所述第三組合物不含所述第一、第二和另外的酶促活性結構域的所述源并且所述另外的組合物不含所述第一、第二和第三酶促活性結構域的所述源。
[0131] 此外，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的組合，其中第一組合物包含根據本發(fā)明的第一多肽的源，第二組合物包含根據本發(fā)明的第二多肽的源，并且可選地第三和/或另外的組合物包含根據本發(fā)明的第三和/或另外的各自的多肽的源。優(yōu)選地，所述第一組合物不含所述第二多肽的源、不含所述第三多肽的源并且不含所述進一步各自多肽的源。優(yōu)選地，所述第二組合物不含所述第一多肽的源、不含所述第三多肽的源并且不含所述進一步各自的多肽的源。優(yōu)選地，所述第三組合物不含所述第一多肽的源、不含所述第二多肽的源并且不含所述進一步各自的多肽的源。優(yōu)選地，所述另外的組合物不含所述第一多肽的源、不含所述第二多肽的源并且不含所述第三多肽的源。
[0132] 在第九方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含任何本發(fā)明的第四方面的第一、第二、第三和/或另外的多肽和/或核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了組合物，其包含任何如本發(fā)明的第二方面中所定義的第一、第二、第三和/或另外的多肽和/或如本發(fā)明的第三方面中所定義的核苷酸。
[0133] 在第十方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含根據本發(fā)明的第一方面的組合。此外，本發(fā)明提供了單一組合物，其包含根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源和根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域的源，其中所述第一和第二酶促活性結構域被包含在不同的第一和第二多肽上。此外，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的組合物，其包含根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源和根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域的源，其中所述第一酶促活性結構域被包含在根據本發(fā)明的第一方面的第一多肽上并且所述第二酶促活性結構域被包含在根據本發(fā) 明的第一方面的第二多肽上，其中所述第一多肽不含所述第二酶促活性結構域并且所述第二多肽不含所述第一酶促活性結構域。
[0134] 此外，本發(fā)明提供了一種單一組合物，其包含根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源、根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域的源和根據本發(fā)明的第三和/或另外的酶促活性結構域的源，其中所述第一、第二和第三和/或另外的酶促活性結構域被包含在根據本發(fā) 明的第一方面的不同的第一、第二和第三和/或另外的多肽上。此外，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含根據本發(fā)明的第一酶促活性結構域的源、根據本發(fā)明的第二酶促活性結構域的源以及根據本發(fā)明的第三和/或另外的酶促活性結構域的源，其中所述第一酶促活性結構域被包含在根據本發(fā)明的第一方面的第一多肽上，所述第二酶促活性結構域被包含在根據本發(fā)明的第一方面的第二多肽上，并且所述第三和/或另外的酶促活性結構域被包含在根據本發(fā)明的第一方面的第三和/或另外的多肽上，其中所述第一多肽不含所述第二酶促活性結構域和第三和/或另外的酶促活性結構域，所述第二多肽不含所述第一和第三和/ 或另外的酶促活性結構域，并且所述第三和/或另外的多肽不含所述第一和第二酶促活性結構域。
[0135] 根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物和/或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物可以是液體、固體或半液體或半固體形式。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物和/或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物為抗微生物劑，優(yōu)選食品防腐劑或消毒劑。優(yōu) 選地，所述抗微生物劑用于殺滅細菌，優(yōu)選葡萄球菌屬的細菌，更優(yōu)選物種金黃色葡萄球菌的細菌。優(yōu)選地，根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物和/或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物進一步包含藥學上可接受的載體和 /或從由噬菌體、抑菌劑、殺細菌劑、抗生素、表面活性劑和/或酶組成的群組中選擇的另外的活性成分。本發(fā)明的抗生素可以是本領域中已知的任何抗生素，包括抗生素和化療劑，并且包括但不限于萬古霉素、尼生素（nisin)、達氟沙星（danofloxacin)和新霉素。有用于本發(fā)明的組合物中的酶包括但不限于有助于破裂生物膜（例如在食品加工設備中發(fā)現的生物膜）的酶，例如但不限于多糖解聚酶和蛋白酶。有用于本發(fā)明的組合物中的表面活性劑協助潤濕表面，以便本發(fā)明的活性成分（包括本發(fā)明的組合）被適當地分布在各種表面上，并且協助溶解并且去除污垢，以便葡萄球菌可以接觸到本發(fā)明的活性成分。適合的表面活性劑包括但不限于聚山梨酯（吐溫）80、20和81以及Dobanols(Shell Chemical Co. RTM)。
[0136] 本發(fā)明的抗微生物消毒劑組合物可以進一步包含本領域已知的表面消毒劑，例如但不限于苯甲酸和PBT，優(yōu)選可以與本發(fā)明的第一方面的組合、優(yōu)選本發(fā)明的表達系統、甚至更優(yōu)選（重組）噬菌體相容的消毒劑。
[0137] 本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物和/或本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物可以進一步包含藥學上可接受的載體。此類組合物優(yōu) 選地作為藥品或藥物來使用。
[0138] 在第十一方面，本發(fā)明提供了一種根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物的組合和/或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物作為藥物的用途。優(yōu)選地，所述藥物用于在受試者中預防或延遲葡萄球菌相關性病癥，例如傳染性疾病。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種用于治療與葡萄球菌有關的病癥的藥學組合物或醫(yī) 學組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種用于治療由細菌（優(yōu)選葡萄球菌屬的細菌，更優(yōu)選物種金黃色葡萄球菌的細菌）引起的傳染性疾病的藥學組合物或醫(yī)學組合物。優(yōu)選地，所述傳染性疾病是皮膚感染、乳腺炎、肺炎、腦膜炎、心內膜炎、毒性休克綜合征（TSS)、膿毒癥、敗血癥、菌血癥或骨髓炎。優(yōu)選地，所述皮膚傳染是從由丘疹、膿皰病、癤子、疔瘡（furuncle)、蜂窩組織炎毛囊炎、癰腫、燙傷樣皮膚綜合征（scaled skin syndrome)和膿腫組成的群組中選擇的。
[0139] 根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物的組合和 /或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物，當能夠減少患者中或所述患者的細胞中或細胞系中或游離在體外系統的細胞中存在的葡萄球菌屬的量并且優(yōu)選地是指仍然能夠檢測到葡萄球菌屬的起始量的99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%、5%或更少時，優(yōu)選地其被視為是活性、功能性或治療活性的或能夠治療、預防和/或延遲傳染性疾病。更優(yōu)選地，不能檢測到葡萄球菌屬。在本段落中，表述"葡萄球菌屬的量" 優(yōu)選地是指存活的葡萄球菌。可以使用本領域技術人員已知的標準技術來檢測所有屬的葡萄球菌，例如使用葡萄球菌特異性抗體的免疫組化技術、檢測葡萄球菌凝固酶或"游離凝固酶"的試管凝固酶試驗、檢測表面蛋白如凝集因子（滑動凝固酶試驗）和/或蛋白A(商業(yè) 乳膠試驗）?？梢允褂帽绢I域技術人員已知的標準技術來檢測存活的葡萄球菌，例如微生物細菌培養(yǎng)技術和/或實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應以用于細菌mRNA的測定。
[0140] 根據本發(fā)明的減少優(yōu)選地是通過在個體或患者的組織或細胞中、通過與在使用本發(fā)明的所述組合物或多肽進行治療前的所述個體或患者中的存在量進行比較來評估的?？?替代地，在局部治療的情況下，可以用尚未用所述組合物或多肽治療的所述個體或患者的組織或細胞來進行比較。
[0141] 包括在本發(fā)明的范圍內的是一種用于在個體中治療、預防或延遲微生物相關性病癥的方法，包括向所述個體給予根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物的組合。此外，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明的第八方面的組合用于制造藥物、優(yōu) 選地為用于治療、預防或延遲微生物相關性病癥的藥物的用途，其中所述第一、第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域被包含在不同的第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽上，其中所述第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽被包含在單獨的組合物中。
[0142] 根據本發(fā)明的第八方面的第一、第二和可選的第三和/或另外的組合物的組合和 /或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物可以用來治療感染有金黃色葡萄球菌的動物，包含人類。任何合適的給予途徑均可用于給予所述組合物的組合或所述單一組合物，包括但不限于：口服、氣霧劑或用于遞送到肺的其他設備、鼻部噴霧、靜脈內、肌肉內、腹膜內、鞘內、陰道、直腸、局部、腰椎穿刺、鞘內以及直接應用至腦和/或腦膜。至少一周、一個月、六個月、一年或更長時間向患者或所述患者的細胞、組織或器官給予本發(fā)明的組合物的組合或單一組合物。在一個實施方式中，分別地給予根據本發(fā)明的第七方面所述的組合物的組合。在一個可替代的實施方式中，所述組合被分開存儲并且在立即給予之前時混合。優(yōu)選地，混合所述組合以包含等摩爾量的所述第一、第二和可選的第三和/或另外的多肽。甚至更優(yōu)選地，混合所述組合以包含等摩爾量的所述第一、第二和可選的第三和/或另外的酶促活性結構域。
[0143] 在第十二方面，本發(fā)明提供了一種根據本發(fā)明的第八方面的組合物的組合或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的單一組合物作為抗微生物劑（優(yōu)選食品防腐劑或消毒劑）的用途?？刮⑸飫┯糜诳刂萍毦?，優(yōu)選所述細菌是葡萄球菌，更優(yōu)選地所述細菌是金黃色葡萄球菌。優(yōu)選地，抗微生物劑用于殺滅細菌，優(yōu)選所述細菌是葡萄球菌，更優(yōu)選地所述細菌是金黃色葡萄球菌。消毒劑是一種專用于在無生命的物體上使用的抗微生物劑。
[0144] 在第十三方面，本發(fā)明提供了一種用于控制食品產品或飼料產品中、在食品或飼料加工設備或醫(yī)療器械上和/或在食品或飼料加工設備或醫(yī)療器械中、在食品或飼料容器上和/或食品或飼料容器中的微生物污染的方法，包括使根據本發(fā)明的第八方面的組合物的組合或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的組合物接觸所述食品或飼料產品、所述食品或飼料加工設備或醫(yī)療器械和/或所述食品或飼料容器。
[0145] 優(yōu)選地，根據本發(fā)明的方法被用于控制葡萄球菌屬的細菌，更優(yōu)選地是物種葡萄球菌的細菌。優(yōu)選地，所述控制的方法包括降低金黃色葡萄球菌細菌的計數和/或首先防止它們在食品產品（包括但不限于乳品行業(yè)）以及食品加工裝置（plant)(其中加工所述食品產品）中的生長，例如它們在加工設備和食品工業(yè)設施中的其他位置上（例如食品儲藏容器）的生長。此外，所述控制方法包括降低葡萄球菌細菌的計數和/或首先防止它們在醫(yī)療器械中的生長。優(yōu)選地，所述控制的方法是用于清洗和消毒醫(yī)療器械（例如纖維內窺鏡如胃內照相機、腹腔鏡、胸腔鏡和關節(jié)鏡）和醫(yī)療用品（如具有很長的管道或空心部分且趨向于通過導入到人體中而重復利用的導管和管）。
[0146] 本發(fā)明的方法包括，通過包括但不限于混合、噴霧或直接施用根據本發(fā)明的第八方面的組合物的組合和/或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的組合物的若干方式，將根據本發(fā)明的第八方面的組合物的組合和/或根據本發(fā)明的第九和/或第十方面的組合物施用到食品產品上或食品產品中、和/或食品加工裝置內的各物理位置中、食品加工設備上或中。
[0147] 在另外的實施方式中，本發(fā)明的所述第一方面的源的組合可以從所述源中分離出來，其中所述源是一種表達系統，例如重組細胞或重組噬菌體可以直接施用或給予而不分離出所述多肽。例如，生產本發(fā)明的第一和第二和可選的第三和/或另外的多肽的細胞可以給予到受試者（人類或動物）或者施用到表面上，在該表面上，本發(fā)明的所述第一和第二和可選的第三和/或另外的多肽會被分泌到食品中、到表面上或進入受試者的內臟（gut) 中。然后，本發(fā)明的組合可以結合并且可選地溶解存在于這樣的環(huán)境中的細菌細胞，優(yōu)選葡萄球菌屬的細菌，更優(yōu)選物種金黃色葡萄球菌的細菌。本文中定義的應用顯著地降低了本來會存在的葡萄球菌細菌的數量，
[0148] 可選地，本發(fā)明的方法可以與本領域中已知的任何滅菌法或消毒劑例如超聲波清洗、照射或加熱滅菌組合使用，通過將設備浸入到消毒液（如乙醇、銨、碘和/或醛消毒劑）中，或者通過將器件保留在密閉的氣氛（如福爾馬林氣體或環(huán)氧乙烷氣體）中通過使用氣體滅菌。
[0149] 定義
[0150] 在氨基酸序列或核酸序列的上下文中的"序列同一性"或"同一性"在本文中定義為通過比較序列確定的兩個或更多個氨基酸（肽、多肽或蛋白質）序列或者兩個或更多個核酸（核苷酸、多核苷酸）序列之間的關系。在本領域中，視情況而定，"同一性"也指通過這些序列的字符串之間的匹配來確定的氨基酸或核苷酸序列之間的序列相關性程度。在本發(fā)明的范圍內，與特定序列的序列同一性優(yōu)選地是指在所述特定多肽或多核苷酸序列的整個長度上的序列同一性。本文中所提供的序列信息不應被狹隘地解釋為需要包括被錯誤鑒定的堿基。本領域技術人員能夠識別此類被錯誤鑒定的堿基并且知道如何糾正這類錯誤。
[0151] 兩個氨基酸序列之間的"相似性"是通過將一個肽或多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代與第二肽或多肽的序列進行比較來確定的。在一個優(yōu)選的實施方式中，同一性或相似性是在本文中所確定的整個SEQ ID NO上來計算的。"同一性"和"相似性"可容易地通過已知方法來計算，包括但不限于在以下中描述的那些：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編,Oxford University Press, New York, 1988 ； Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.編，Academic Press, New York, 1993 !Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.編，Humana Press, New Jersey, 1994 !Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine,G. , Academic Press, 1987 ；以及 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和 Devereux，J.編，M Stockton Press，New York，1991 ;以及 Carillo，H.和 Lipman，D·，SIAM J. Applied Math. , 48:1073(1988) 〇
[0152] 設計用于確定同一性的優(yōu)選的方法以給出待測試序列之間的最大匹配。用于確定同一性和相似性的方法被編入到公眾可獲得的計算機程序中。優(yōu)選的用于確定兩個序列之間的同一'丨生和相似性的計算機程序方法包括，例如GCG程序包（Devereux, J.等，Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul，S. F.等，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))。BLAST X 程序可以公開地從 NCBI 及其他來源 (BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894 ;Altschul，S.等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990))獲得。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用來確定同一性。
[0153] 優(yōu)選的用于多肽序列比較的參數包括如下：算法：Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);比較矩陣：BL0SSUM62,來自 Hentikoff 和 Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992);空位罰分：12 ;以及空位長度罰分：4。有用的使用這些參數的程序可公開地從位于Madison, WI的Genetics Computer Group作為"Ogap"程序而獲得。上述的參數是用于氨基酸比較的默認參數（且對于末端空位沒有罰分）。
[0154] 用于核酸比較的優(yōu)選的參數包括如下：算法：Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);比較矩陣：匹配=+10,錯配=0 ;空位罰分：50 ;空位長度罰分： 3。可以從位于Madison, Wis的Genetics Computer Group作為Gap程序而獲得。以上給出的是用于核酸比較的默認參數。
[0155] 可選地，在確定氨基酸相似性的程度時，本領域技術人員還可以考慮所謂的"保守"氨基酸替代，這對本領域技術人員而言是清楚的。保守氨基酸替代是指具有相似側鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺的側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替代組是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公開的氨基酸序列的替代變體是，其中所公開的序列中的至少一個殘基被除去且在其位置中插入了不同的殘基的那些。優(yōu)選地，氨基酸改變是保守的。每一個天然存在的氨基酸的優(yōu)選的保持替代如下：Ala替代為ser ;Arg替代為Iys ;Asn替代為gin或his ;Asp替代為 glu ;Cys替代為ser或ala ;Gln替代為asn ;Glu替代為asp ;Gly替代為pro ;His替代為 asn 或 gin ;Ile 替代為 leu 或 val ;Leu 替代為 ile 或 val ;Lys 替代為 arg ;gln 或 glu ;Met 替代為leu或ile ;Phe替代為met, leu或tyr ;Ser替代為thr ;Thr替代為ser ;Trp替代為tyr ;Tyr替代為trp或phe ;以及，Val替代為ile或leu。
[0156] 多核苷酸由核苷酸序列表示。多肽由氨基酸序列表示。核酸構建體被定義為一種從天然存在的基因中分離出的多核苷酸、或者經修飾而含有以本來不會在自然界中存在的方式組合或并置的多核苷酸的區(qū)段的多核苷酸?？蛇x地，存在于核酸構建體中的多核苷酸被操作地連接至一個或多個控制序列，該控制序列引導所述肽或多肽在細胞或受試者中的生產或表達。
[0157] 本文中使用的術語"異源序列"或"異源核酸"是指非天然發(fā)現的可操作地連接為所述第一核苷酸序列的鄰近序列的序列或核酸。本文中使用的術語"異源"可以是指"重組體"。"重組體"是指一種遺傳實體，其不同于通常在自然界中發(fā)現的遺傳實體。當適用于核苷酸序列或核酸分子時，這意味著所述核苷酸序列或核酸分子是克隆、限制和/或連接步驟以及導致產生與在自然界中發(fā)現的序列或分子不同的構建體的其他工序的各種組合的產物。
[0158] "可操作地連接"在本文中被定義為一種結構（configuration)，其中控制序列被適當地放置在相對于編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的位置上，使得所述控制序列引導本發(fā) 明的肽或多肽在細胞中和/或在受試者中的生產/表達。
[0159] "可操作地連接"也可以用來定義一種結構，其中將一個序列適當地放置在相對于另一個編碼功能性結構域的序列的位置上，從而在細胞中和/或在受試者中編碼出嵌合多肽。
[0160] "表達"應當理解為包括涉及生產肽或多肽的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
[0161] 可選地，由存在于核酸構建體中的核苷酸序列表示的啟動子被可操作地連接至另一種編碼本文中確定的肽或多肽的核苷酸序列。
[0162] 術語"轉化（transformation) "是指在并入新DNA(即，對細胞為外源性的DNA) 后，在所述細胞中誘導的永久性或暫時性的遺傳變化。當所述細胞是細菌細胞時，如本發(fā)明所意指的，該術語是指染色體外的、自我復制的載體，其攜帶有（harbor)可選擇的抗生素抗性。
[0163] 表達載體可以是能夠方便地進行重組DNA工序并且能夠在細胞中和/或在受試者中引起編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的表達的任何載體。本文中使用的術語"啟動子"是指一種核酸片段，其功能是控制一個或多個基因或核酸的轉錄，其位于該基因的轉錄起始位點的轉錄方向的上游。其涉及由用于DNA依賴性RNA聚合酶的結合位點、轉錄起始位點和任何其他DNA序列（包括但不限于轉錄因子結合位點、抑制子和激活子蛋白結合位點）、以及本領域技術人員已知直接或間接地調控由所述啟動子開始的轉錄的量的任何其他的核苷酸序列的存在所確定的結合位點。在本發(fā)明的上下文中，啟動子優(yōu)選地終止于轉錄起始位點（TSS)的核苷酸-1上。
[0164] 本文中使用的"多肽"是指任何肽、寡肽、多肽、基因產物、表達產物或蛋白質。多肽是由連續(xù)氨基酸構成。術語"多肽"包括天然存在的或合成的分子。
[0165] 術語"控制序列"在本文中被定義為包括對于多肽的表達是必要的或有利的任何組件。每個控制序列對于編碼所述多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。這樣的控制序列包括但不限于前導序列、最佳翻譯起始序列（如Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266:19867-19870中所描述的）、聚腺苷酸化序列、前肽序列、前原肽序列、啟動子、信號序列和轉錄終止子。在最低限度下，控制序列包括啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號。
[0166] 控制序列可以提供有接頭，目的是用于引入特異性限制位點以便于該控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進行連接。
[0167] 控制序列可以是適當的啟動子序列，其為一種核酸序列，由宿主細胞識別用于表達該核酸序列。啟動子序列含有轉錄控制序列，該轉錄控制序列調節(jié)多肽的表達。啟動子可以是在細胞中顯示出轉錄活性的任何核酸序列，包括但不限于突變的、截短的和雜種的 (hybrid)啟動子，并且可以獲自編碼相對于細胞為同源或異源的胞外或胞內多肽的基因。
[0168] 控制序列也可以是合適的轉錄終止子序列，其為一種由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。終止子序列可操作地連接到編碼多肽的核酸序列的3'末端。在細胞中發(fā)揮功能的任何終止子均可以在本發(fā)明中使用。
[0169] 控制序列也可以是合適的前導序列，其為一種對于由宿主細胞翻譯是重要的mRNA 的非翻譯區(qū)。前導序列被可操作地連接至編碼多肽的核酸序列的5'末端。在細胞中發(fā)揮功能的任何前導序列均可以在本發(fā)明中使用。
[0170] 控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其為一種可操作地連接至核酸序列的3 '末端的序列并且當轉錄時由宿主細胞識別為向轉錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號。在細胞中發(fā)揮功能的任何聚腺苷酸化序列均可以在本發(fā)明中使用。
[0171] 在本文件及其權利要求中，動詞"包含（to comprise)"及其詞形變化是在其非限制性意義上來使用的，是指跟隨在該詞語后的項目被包括在內，但不排除沒有具體提及的項目。此夕卜，動詞"由…組成（to consist) "可以替換為"基本上由......組成（to consist essentially of) "，是指本文中定義的產品或組合物或核酸分子或肽或多肽或核酸構建體或載體或細胞除了所具體指明的組分之外還可以包含一種或多種另外的組分；所述一種或多種另外的組分不改變本發(fā)明的獨特特性。此外，由不定冠詞"一個（a)"或"一種（an)" 提到的要素不排除存在多于一個所述要素的可能性，除非上下文清楚地要求有且僅有一個要素。因此，不定冠詞一個（a)"或"一種（an)"通常是指"至少一個/至少一種（at least one)"。
[0172] 本說明書中引用的所有專利和參考文獻均在此通過參考而以它們的整體并入本文。
[0173] 下列提供的實施例僅用于說明性目的并且不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0174] 圖1 :半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶（CHAP)結構域、肽鏈內切酶結構域（肽酶_M23)、酰胺酶結構域（Ami2638)、胞壁質酶結構域和氨基葡萄糖苷酶結構域的靶鍵位點。
[0175]圖 2:部分純化的蛋白質的 SDS PAGE。I :HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)， 2:HXaM23-LST_CWT-匪3(SEQ ID N0:48)，3:HXaM23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:44)， 4:HXaCHAPTw_CWT-匪3(SEQ ID N0:42)，5:HXaCHAPTw_CWT-LST(SEQ ID N0:40)，6: HXaCHAPTw_CBD2638(SEQ ID NO:38), 7 ：HXaCHAPK_CWT-NM3(SEQ ID NO:36), 8 ：HXaCHAPK_ CWT-LST(SEQ ID NO:34),9 ：HXaCHAPK_CBD2638 (SEQ ID NO:32),10 ：HXaAmi2638_ CWT-匪3(SEQ ID N0:30),ll:HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28),12:HXaAmi2638_ CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0176] 圖 3 :部分純化的蛋白質的 SDS PAGE。I :HXaCHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:32)，2 : HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), 3 ：HXaCHAPK_CWT-NM3(SEQ ID NO:36), 4 ：HXaCHAPK_ CHAPK_CBD2638(SEQ ID NO:56),5 ：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST (SEQ ID NO :58),6： HXaCHAPK_CHAPK_CWT-NM3(SEQ ID N0:60)〇
[0177] 圖 4 :部分純化的蛋白 SDS PAGE。I :HXaAmi23638_Ami2638_CBD2638(SEQ ID N0:50),2 ：HXaAmi23638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52),3 ：HXaAmi23638_ Ami2638_CWT-NM3(SEQ ID N0:54)，4:HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:68)，5: HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0178] 圖5 :含有CHAPK的溶素（Iysin)在50nM和200nM蛋白質測定濃度下針對金黃色葡萄球菌BB270細胞的效果。所測試的構建體：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58) 和 HXaCHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:56)。
[0179] 圖6 :含有M23-LST的溶素在50nM和200nM蛋白質測定濃度下針對金黃色葡萄球菌 BB270 細胞的效果。所測試的構建體：HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)、 HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:68)和 HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)。
[0180] 圖7 :含有Ami2638的溶素在50nM和200nM蛋白質測定濃度下針對金黃色葡萄球菌 BB270 細胞的效果。所測試的構建體：HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)、 HXaAmi2638_Ami2638_CBD2638(SEQ ID N0:50)、HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28)、 HXaAmi2638_CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0181] 圖8 :50nM具有相等CBD的蛋白質混合物（16. 67nM每種蛋白質）的比較。所測試的構建體：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)、HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:70) ,HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52), HXaCHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQ ID NO:56)、HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID NO:68)、HXaAmi2638_Ami2638_CBD2638(SEQ IDN0:50)、HXaCHAPK_CBD2638(SEQIDN0:32)、HXaM23-LST_CBD2638(SEQIDN0:44)和 HXaAmi2638_CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0182] 圖9 :200nM具有相等CBD的蛋白質混合物（66. 67nM每種蛋白質）的比較。所測試的構建體：HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)、HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:70) ,HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52),HXaCHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:56)、HXaM23-LST_M23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:68)、HXaAmi2638_Ami2638_ CBD2638(SEQ ID N0:50)、HXaCHAPK_CBD2638(SEQ ID N0:32)、HXaM23-LST_CBD2638(SEQ ID N0:44)和 HXaAmi2638_CBD2638(SEQ ID N0:26)。
[0183]圖 10 :HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)、HXaM23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID N0:70)和HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)在（16.67nM 以及 66. 67nM的每種蛋白質）下的蛋白質混合物與50nM和200nM參考蛋白質M23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID NO:70)的比較。
[0184] 圖11 :含有CHAPK、M23和Ami的溶素在30nM蛋白質測定濃度下針對金黃色葡萄球菌 BB270 細胞的效果。所測試的構建體：HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28)、HXaCHAPK_ CffT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46), HXaAmi2638_Ami2638_ CWT-LST(SEQ ID N0:52)、HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_ M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0185] 圖12:30nM蛋白質混合物（15nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaAmi2638_CffT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO: 34), HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)和 HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)。
[0186] 圖13:30nM蛋白質混合物（15nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28),HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46),HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0187] 圖14 :30nM蛋白質混合物（15nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:34)、HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)、HXaCHAPK_ CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0188] 圖15:30nM蛋白質混合物（IOnM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_ CWT-LST (SEQ ID NO:46)、HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52)、HXaCHAPK_CHAPK_ CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70).
[0189] 圖16 :含有CHAPK、M23和Ami的溶素在50nM蛋白質測定濃度下針對金黃色葡萄球菌 BB270 細胞的效果。所測試的構建體：HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID N0:28)、HXaCHAPK_ CffT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46), HXaAmi2638_Ami2638_ CWT-LST(SEQ ID N0:52)、HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_ M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0190] 圖17 :50nM蛋白質混合物（25nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)和 HXaCHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)。
[0191] 圖18 :50nM蛋白質混合物（25nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID NO:46), HXaAmi2638_ Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0192] 圖19 :50nM蛋白質混合物（25nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:34)、HXaM23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:46)、HXaCHAPK_ CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。
[0193] 圖20 :50nM蛋白質混合物（16. 67nM每種蛋白質）的效果。所測試的構建體： HXaAmi2638_CWT-LST(SEQ ID NO:28), HXaCHAPK_CWT-LST(SEQ ID NO:34), HXaM23-LST_ CffT-LST(SEQ ID NO:46),HXaAmi2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID NO:52),HXaCHAPK_CHAPK_ CWT-LST(SEQ ID N0:58)和 HXaM23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70)。實施例
[0194] 實施例I
[0195] 材料和方法
[0196] 細菌、噬菌體和質粒
[0197] 在本研究中使用的用于克隆和蛋白質生產的細菌菌株、噬菌體以及質粒列于表 1 中。大腸桿菌 XLl-Blue MRF (Stratagene, La Jolla, CA, U. S.)和大腸桿菌 Sure(Stratagene)用于克隆和過表達N-末端6xHis_標記的重組融合蛋白質。在大腸桿菌Sure菌株中處理含有重復序列的構建體。在37°C下在補充有100 μ g/ml氨芐青霉素和30 μ g/ml四環(huán)素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌用于克隆，并且在30°C 下在補充有100 μ g/ml氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌以便在蛋白質表達期間進行質粒選擇。金黃色葡萄球菌BB270NCTC8325mec用作溶解測定中的底物，其在37°C下生長在半濃縮的腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion medium) (BHI，Biolife，Milano, Italy)中。從兩升培養(yǎng)物中收獲對數期細胞，用PBST (50mM NaH2PO4, 120mM NaCl，0. 1%吐溫20, pH 7. 4)洗滌，濃縮100倍并且將其等分試樣存貯在-80°C下。
[0198] DNA技術和克隆程序
[0199] 使用標準技術（Loessner 等· Mol Microbiol 2002,44:335-349 ; Sambrook 等.1989Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)來進行融合蛋白質的克隆和構建。酶購自 New England Biolabs (Ipswitch, MA, U. S. ) > Fermentas (Burlington, Canada, Roche Basel, Switzerland)和 Qiagen。來自噬菌體 Φ 2638a、Φ 187、ΦΚ 和 C1Twort 的內溶素和分離的酶促活性域（EAD)編碼區(qū)由純化的噬菌體DNA或噬菌體溶解物進行框架擴增得到。以質粒DNA作為模板使用高保真PCR酶混合物（High Fidelity PCR Enzyme Mix) (Fermentas) 擴增溶葡萄球菌素的EAD編碼基因片段。通過引物導入用于將連接物（ligation)插入到 pQE-30蛋白質表達質粒（Qiagen)及其衍生物中的限制性酶切位點。在本研究中構建或使用的質粒列于表1中。將蛋白質表達質粒轉化到電轉感受態(tài)（electro-competent)大腸桿菌XLlBlueMRF'中并且將含有重復序列的質粒轉化到電轉感受態(tài)大腸桿菌Sure中。使用分光光度計（NanoDrop ND-1000 分光光度計，Thermo scientific, Waltham, MA, U. S.)來確定DNA濃度。通過核苷酸測序（GATC, Konstanz, Germany)來確認序列完整度。
[0200] 分別帶有單個N-末端酶促活性結構域（EAD)和C-末端細胞壁結合結構域（CBD) 或細胞壁靶向結構域（CWT)的構建體是用剪接重疊延伸PCR(SOE)生成各個編碼區(qū)的框內融合體來構建的。將這些片段插入到pQE_30Xa載體DNA的SacI - Sail限制性酶切位點中。在這些載體的基礎上，通過將各個EAD編碼序列導致到StuI - SacI位點中而獲得具有重復兩重EAD的構建體。對于完整的構建原理，請參見表1。
[0201] 重組融合蛋白質的表達及純化
[0202] 如先前其他人所描述的（Loessneret al. · Appl Environ Microbiol 1996, 62:3057-3060 ；Schmelcher et al. Appl Environ Microbiol 2010,76:5745-5756； Eichenseher et al·, unpublished),采用較小的改動以進行蛋白質的過表達和N-末端 6xHis標記的蛋白質的固定化金屬親和色譜法（IMAC)純化。簡略地，通過向在30°C于LB 培養(yǎng)基中生長的對數期大腸桿菌培養(yǎng)物中加入〇. 2-0. 5mM IPTG以誘導異源蛋白質表達。在通過離心收獲前，在相同的溫度下進一步培養(yǎng)細胞。通過穿過在1200psi下操作的弗氏細胞壓碎器（French Pressure Cell Press) (1200psi, SLM Aminco, Urbana, IL, U. S.)的雙通道將大腸桿菌裂解在固定緩沖液（50禮似托?04,500!111恥(：1，51111咪唑，0.1%吐溫20，？!1 7.4)中。通過離心和過濾滅菌（0.2μπι PES薄膜，Millipore)去除不溶性細胞碎片，然后在裝填有低密度 Ni-NTA 超流樹脂（Chemie Brunschwig AG, Basel, Switzerland)的 Micro Biospin (Bio-Rad，Hercules，CA, U. S.)柱中進行重力流IMAC純化。洗滌柱后，使用洗脫緩沖液（50禮恥4?04,5001111似(：1，1251111咪唑，0.1%吐溫20，？!17.4)洗脫出61把8標記的蛋白質，并且相對于透析緩沖液（50mM NaH2PO4, IOOmM NaCl，0. 1 %吐溫20, pH 7. 4)進行透析。使用 EconoPak IODG 柱（Biorad)，使用 CHAP 緩沖液（50mM Tris，5mM CaCl2,10%甘油， pH 7. 4)，使含有CHAP同源結構域的蛋白質經受緩沖液更換。通過SDS-PAGE來估計蛋白質純度并且通過分光光度法（NanoDrop ND-1000分光光度計）或使用Pierce BCA蛋白質測定試劑盒（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, U.S.)根據制造商的手冊來確定蛋白質濃度。將蛋白質存貯在_20°C下的50%甘油中。
[0203] 裂解動力學的光度測定
[0204] 使用 Wallac VICT0R3TM14200 (Perkin Elmer, Waltham, MA, U. S.)多標記計數器裝置以濁度降低測定法來測量裂解活性。用緩沖液洗滌來自冷凍儲備的底物細胞并且使用大比色杯（Macro Cuvette) (Greiner Bio-one, Kremsmiinster, Austria)和分光光度計（BioChrom, Cambridge, UK)將 595nm 下的光密度（OD595nm)調節(jié)為 1+/-0. 05。用緩沖液將葡萄球菌裂解酶稀釋至等摩爾量，并且如果需要，隨后合并以得到的酶的混合物。使用多道移液管，將ι〇μ1蛋白質溶液分配至水晶級多孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)試驗板（SPLLifesciences, Poncheon-Si, Korea)中并且與190μ1底物細胞懸浮液混合。在讀數之間中劇烈搖晃板，在OD595nm下監(jiān)測濁度隨時間的降低。作為用于監(jiān)測在給定條件下的自裂解活性（autolytic activity)的對照，采用10μ1緩沖液或水。測定進行一式三份。如別處所描述的（Korndorfer 等.J Mol Biol2006, 364:678-689 ;Schmelcher 等，Microb Biotechnol. 2011，4(5) :651-662)來得相對活性值的計算值。將反曲的（S形的，Sigmoidal)裂解和對照曲線歸一化為共同初始值1。
[0205] 結果
[0206] 細胞內表達的葡萄球菌裂解蛋白的下游加工產生可溶性蛋白質，其純度取決于所述蛋白質的結構和來源。大多數構建體具有通過SDS-PAGE估計的最高達>90%的純度（圖 2-4)。
[0207] 我們在濁度降低測定法（裂解測定法）中測試了部分純化的蛋白質的選擇性。在 pH 7. 4的PBST緩沖液中并且在不同的蛋白質濃度下針對來自冷凍儲備的金黃色葡萄球菌 BB270細胞測試了個體溶素及它們的組合。CHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58,由SEQ IDN0:47編碼）和CHAPK_CHAPK_CBD2638(SEQIDN0:56，由SEQIDN0:55編碼）蛋白質在50nM測定濃度下針對設定至為?1的595nm處的光密度（0D595nm)的細胞懸浮液幾乎不具有活性，但是在200nM測定濃度下顯示出顯著的活性（圖5)。
[0208] 在相同的測定設置中使用含有M23-LST(SEQIDN0:16，由SEQIDN0 :15編碼）的蛋白質，在 200nM 測定濃度下使用 M23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70,由 SEQ ID NO:69編碼）達到了最好的結果。CWT-LST(SEQ ID NO:4,由SEQ ID NO:3編碼）似乎優(yōu)于 CBD2638(SEQIDN0:6，由SEQIDN0:5編碼）。此外，發(fā)現重復的雙M23-LST變體（SEQID NO: 68 和 70,分別由 SEQ ID NO: 67 和 69 編碼）優(yōu)于單一的 M23-LST(SEQ ID NO: 44 和 46，分別由SEQ ID N0:43和45編碼）。發(fā)現在50nM蛋白質濃度下這種效果更加明顯。對于全部結果，請參見圖6。
[0209] 與CHAPK(SEQIDN0:10，由SEQIDN0:9編碼）和M23-LST(SEQIDN0:16，由 SEQ ID NO: 15 編碼）蛋白質相比，用 Ami2638(SEQ ID NO: 18,由 SEQ ID NO: 17 編碼）構建的所有溶素均顯著地活性更低。此處，CBD2638(SEQ ID N0:6,由SEQ ID N0:5編碼）優(yōu) 于CWT-LST(SEQIDN0:4，由SEQIDN0:3編碼）。當與CBD2638(SEQIDN0:6，由SEQID N0:5編碼）組合時，重復的催化結構域的效果甚微，但是當與CWT-LST(SEQ ID N0:4,由SEQ ID NO:3編碼）組合時，重復對裂解動力學帶來積極的效果（圖7)。
[0210]我們還比較了用 CWT-LST(SEQ ID N0:4,由 SEQ ID N0:3 編碼）或 CBD2638(SEQ ID N0:6,由SEQ ID N0:5編碼）構建的蛋白質的混合物的活性。發(fā)現在低蛋白質濃度（分別為16·67ηΜ每種蛋白質濃度或50nM總蛋白質濃度）下，CWT-LST(SEQ ID N0:58、70和52) 蛋白質的混合物比CBD2638(SEQ ID N0:56、68和50)蛋白質的混合物顯著地更具活性。此夕卜，重復的EAD在CBD2638構建體混合物（SEQ ID NO:56、68和50相比于SEQ ID NO:32、 44和26)中對裂解動力學的影響不大（圖8)。將蛋白質的測定濃度增加至200ηΜ(66. 67nM 每種）導致具有重復的雙EAD的CWT-LST和CBD2638構建體的活性幾乎相等。盡管看起來 CBD2638構建體的裂解曲線（圖9)在CWT-LST構建體的曲線"之上"運行，但是我們估計裂解動力學是相等的。這僅僅是因為測定是在96孔板中實施的，而OD595nm測量不是在賴氨酸（lysine)添加后的同一時間點開始的。曲線的第一次測量已經是在裂解已經開始的階段，因此將曲線歸一化為1的初始〇D595nm將曲線移到到了更高的值。與在50nM的蛋白質濃度不同，未發(fā)現僅具有單個EAD的CBD2638構建體混合物與重復兩倍的EAD-CBD2638構建體具有相等的活性，而是顯示出更低的裂解動力學。
[0211] 最后，我們將由 Ami2638_Ami2638_CWT-LST(SEQ ID N0:52,由 SEQ ID N0:51 編碼）、CHAPK_CHAPK_CWT-LST(SEQ ID N0:58,由 SEQ ID N0:57 編碼）和 M23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID N0:70,由SEQ ID N0:69編碼）組成的最有效的混合物與最有效的參比蛋白質M23-LST_M23-LST_CWT-LST(SEQ ID N0:70,由 SEQ ID N0:69編碼）進行了比較。在兩個測試的濃度（50nM和200nM總蛋白質濃度）下，均發(fā)現該混合物略優(yōu)于M23-LST_M23-LST_ CWT-LST(SEQ ID NO:7〇,由 SEQ ID NO:69 編碼）（圖 10)。
[0212] 實施例2
[0213] 材料與方法
[0214] 使用如在實施例1的材料和方法章節(jié)中所述的濁度降低測定法，測試了根據實施例1生產的單一蛋白質構建體以及蛋白質構建體的組合/混合物的裂解動力學。
[0215] 結果
[0216] 圖11至圖20中示出了蛋白質及混合物的裂解曲線。由這些曲線，使用SigmaPlot 軟件用5-參數反曲擬合模型計算了每種蛋白質或混合物的最大測量活性。斜率的一階導數是光密度（〇D595nm)的最大下降并且被定義為最大測量活性。表3為每種蛋白質或混合物的最大測量活性的匯總表。
[0217] 表1 :細菌菌株、噬菌體和質粒
[0218]

【權利要求】
1. 一種第一酶促活性結構域的源與第二酶促活性結構域的源的組合，其中所述第一酶促活性結構域和第二酶促活性結構域各自表現出不同的靶鍵特異性并且被包含在不同的第一多肽和第二多肽上。
2. 根據權利要求1所述的組合，其中所述不同的靶鍵是細菌細胞的肽聚糖層中必不可少的鍵，優(yōu)選地其中所述細菌細胞是葡萄球菌。
3. 根據權利要求2所述的組合，其中所述第一酶促活性結構域和/或所述第二酶促活性結構域是從由半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域，肽鏈內切酶結構域，酰胺酶結構域和糖基水解酶組成的群組中選擇的結構域。
4. 根據權利要求1-3所述的組合，其中所述第一多肽和所述第二多肽包含不同多重性的所述第一酶促活性結構域和/或所述第二酶促活性結構域。
5. 根據權利要求1-4所述的組合，其中所述不同的第一多肽和第二多肽中的每一個進一步包含細胞壁結合結構域。
6. 根據權利要求5所述的組合，其中： -所述第一酶促活性結構域是半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶結構域并且所述第二酶促活性結構域是肽鏈內切酶結構域， _所述組合進一步包含第三酶促活性結構域的源，所述第三酶促活性結構域被包含在不同的第三多肽上， -所述第三酶促活性結構域是酰胺酶結構域， -所述不同的第三多肽進一步包含細胞壁結合結構域，并且 -所述不同的第一多肽、第二多肽和第三多肽中的每一個包含多重性的所述第一酶促活性結構域、第二酶促活性結構域和第三酶促活性結構域。
7. 根據權利要求6所述的組合，其中所述第一多肽包含與SEQ ID N0:58具有至少80% 序列同一性的序列，所述第二多肽包含與SEQ ID N0:70具有至少80%序列同一性的序列并且所述第三多肽包含與SEQ ID NO:52具有至少80%序列同一性的序列。
8. 根據權利要求1-7中任一項所述的組合，其中所述第一酶促活性結構域的源包含多肽和/或所述第二酶促活性結構域的源包含多肽。
9. 根據權利要求1-7中任一項所述的組合，其中所述第一酶促活性結構域的源包含編碼所述第一酶促活性結構域的多核苷酸和/或所述第二酶促活性結構域的源包含編碼所述第二酶促活性結構域的多核苷酸。
10. 根據權利要求9所述的組合，其中編碼所述第一酶促活性結構域的所述多核苷酸存在于表達構建體中和/或編碼所述第二酶促活性結構域的所述多核苷酸存在于表達構建體中，優(yōu)選地其中所述表達構建體存在于表達系統中。
11. 一種包含根據權利要求1-10中任一項所述的組合的組合物。
12. 根據權利要求11所述的組合物，進一步包含藥物上可接受的載體和/或從由噬菌體、抑菌劑、殺菌劑、抗生素、表面活性劑和/或酶組成的群組中選擇的另外的活性成分。
13. 根據權利要求11或12所述的組合物，用于作為藥物使用，優(yōu)選地用于在受試者中治療、預防或延遲葡萄球菌相關的病癥。
14. 根據權利要求11或12所述的組合物作為抗微生物劑的用途，優(yōu)選地作為食品防腐劑或消毒劑。
15. -種用于控制食品產品或飼料產品中、食品或飼料加工設備或醫(yī)療器械上和/或食品或飼料加工設備或醫(yī)療器械中、食品或飼料容器上和/或食品或飼料容器中的微生物污染的方法，包括使根據權利要求11或12所述的組合物接觸所述食品產品或飼料產品、所述食品或飼料加工設備或醫(yī)療器械和/或所述食品或飼料容器。
【文檔編號】A61K38/52GK104428413SQ201380036354
【公開日】2015年3月18日申請日期:2013年5月7日優(yōu)先權日:2012年5月7日
【發(fā)明者】馬丁·約翰內斯·勒斯納, 弗里茨·艾興澤埃爾申請人:邁克瑞歐斯人體健康有限公司

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