生物激活的骨替代材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明總體上涉及骨替代材料的領(lǐng)域，并且特別涉及生物激活的骨替代材料。更具體地，本發(fā)明涉及一種特定的試劑，所述試劑包含檸檬酸鹽、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤，其用于改善或促進(jìn)骨替代材料的骨整合，涉及提供有所述特定試劑的涂層的骨替代材料，并且涉及用在安裝骨替代材料的方法中的試劑盒，所述試劑盒包括骨替代材料以及檸檬酸鹽、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
【專利說明】生物激活的骨替代材料 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明總體上涉及骨替代材料領(lǐng)域，并且具體涉及生物激活的骨替代材料。更具 體地，本發(fā)明涉及一種特定的試劑，其包含檸檬酸鹽、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌 呤，其用于改善或促進(jìn)骨替代材料的骨整合，涉及提供有所述特定試劑的涂層的骨替代材 料，并且涉及用于在安裝骨替代材料的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包括骨替代材料 以及檸檬酸鹽、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 骨替代材料用于補充或替代自體癌性骨。與癌性骨的移植相比，骨替代具有這樣 的優(yōu)點：其是充分可獲得的并且能夠儲存。骨替代材料充當(dāng)填充材料通過提供框架結(jié)構(gòu)而 機械性加固缺損部位并且支持骨愈合。
[0004] 骨替代材料按其生物學(xué)機制可以分類為：骨傳導(dǎo)，骨誘導(dǎo)和骨發(fā)生。
[0005] 骨傳導(dǎo)在骨替代材料充當(dāng)新骨生長的框架（該框架由天然骨永久延續(xù)）時發(fā)生。 來自缺損部位邊緣的成骨細(xì)胞使用所述骨替代材料作為骨架，在其上產(chǎn)生新的骨骼。最至 少地，骨替代材料應(yīng)該是骨傳導(dǎo)性的。典型的骨傳導(dǎo)性的材料包括合成的材料，如磷酸鈣 (例如，羥基磷灰石和磷酸三鈣）的陶瓷，生物聚合物，生物玻璃和磷酸鈣，以及同種異體的 和異種的材料，如牛的材料。
[0006] 骨誘導(dǎo)涉及刺激骨祖細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，然后其起始新骨形成。最廣泛研究的 骨誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)控劑的類型是骨形態(tài)生成蛋白（BMP's)。骨傳導(dǎo)性的和骨誘導(dǎo)性的骨替代材 料不僅充當(dāng)現(xiàn)有的成骨細(xì)胞的框架，而且還引發(fā)新的成骨細(xì)胞的形成。除了 BMP之外，骨誘 導(dǎo)性材料包括去礦物質(zhì)的骨基質(zhì)和粉碎的骨的自體骨移植物。
[0007] 當(dāng)來源于所述骨替代材料的活的成骨細(xì)胞與由另外兩種機制產(chǎn)生的骨生長一起 促進(jìn)新骨生長時，發(fā)生骨生成。表現(xiàn)出骨生成作用的材料包括自體骨和組織工程材料。
[0008] 骨替代材料通常具有多孔結(jié)構(gòu)，并且以顆粒狀、塊狀和油灰狀（putty)形式可用， 其是軟的且易彎折的，或硬的且保持形狀。所有的骨替代材料需要血液滲透，以能夠在愈合 過程中形成纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)?？晌盏墓翘娲牧蠎?yīng)該在骨形成的同時降解或再吸收。不可 吸收的骨替代材料應(yīng)該被骨整合。骨整合的先決條件是在活的骨骼與所述骨替代材料之間 直接的結(jié)構(gòu)和功能連接，而沒有結(jié)締組織插入。
[0009] 已經(jīng)提示骨替代材料的可濕性對骨整合具有高度的影響。例如，當(dāng)疏水性骨替代 材料（如基于聚已內(nèi)酯的聚氨酯脲）暴露于血液時，其在多孔結(jié)構(gòu)中不表現(xiàn)出纖維蛋白的 滲透。另一方面，親水性骨替代材料可以在材料的周圍誘導(dǎo)加速的血小板激活，但是凝結(jié)的 血液可能在所述替代材料周圍形成囊（capsule)，這抑制完全的血液滲透。因此，盡管良好 的可濕性是重要的因素，但是還存在其他的仍然是未知的附加于良好的骨整合性的特性。
[0010] 綜上所述，本發(fā)明要解決的目的是提供具有改善骨替代材料的骨整合性的能力的 試劑以及提供具有極佳的骨整合特性的骨替代材料。
[0011] 發(fā)明概沭
[0012] 本發(fā)明已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在骨替代材料的表面上存在檸檬酸鹽、磷酸鹽、右旋 糖和腺嘌呤在其上誘導(dǎo)血液蛋白包被、血小板激活和與所述表面的緊密的纖維蛋白纖維連 接。這些作用，即，改善的血液蛋白包被、改善的血小板激活和緊密的纖維蛋白纖維連接，是 骨替代材料的極好的骨整合性的基本要求。
[0013] 鑒于上述發(fā)現(xiàn)，在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于改善或促進(jìn)骨替代材料的骨整 合的試劑，其中所述試劑包含朽1檬酸三鈉、朽1檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺噪呤。
[0014] 在第二方面，本發(fā)明涉及試劑用于在骨替代材料上產(chǎn)生涂層的應(yīng)用，其中所述試 劑包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
[0015] 在第三方面，本發(fā)明涉及一種骨替代材料，其特征在于，所述骨替代材料提供有至 少一個涂層，其中所述涂層可通過將所述骨替代材料浸沒在包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸 二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤的水溶液中而獲得。
[0016] 在第四方面，本發(fā)明涉及一種用于在安裝骨替代材料的方法中使用的試劑盒，其 中所述試劑盒包括骨替代材料、檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
[0017] 附圖簡沭
[0018] 圖Ia顯示Artelon膜暴露于未凝結(jié)的血液后的SEM照片（放大倍數(shù)= 1，000-倍），其中所述Artelon1「膜未提供有如本申請所述的涂層。
[0019] 圖Ib顯示根據(jù)本發(fā)明的Artelongl膜暴露于未凝結(jié)的血液后的SEM照片（放大倍 數(shù)=1，000-倍）。
[0020] 圖2a顯示Cerasorb明膠型骨替代材料在暴露于未凝結(jié)的血液后的SEM照片（放 大倍數(shù)=14, 000-倍），其中所述骨替代膜未提供有如本申請所述的涂層。
[0021] 圖2b顯示根據(jù)本發(fā)明的Cerasorb明膠型骨替代材料在暴露于未凝結(jié)的血液后的 SEM照片（放大倍數(shù)=14, 000-倍）。
[0022] 詳沭
[0023] 按照第一方面，本發(fā)明提供一種用于在改善或促進(jìn)骨替代材料的骨整合的方法中 使用的試劑，其中所述試劑包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
[0024] 按照本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，所述試劑溶解在水中形成水溶液。特別優(yōu)選的是， 該用于改善或促進(jìn)骨替代材料的骨整合的水溶液包含：
[0025] -1. 32 至 105. 20g/l，優(yōu)選 2. 63 至 26. 3g/l 檸檬酸三鈉，
[0026] -0? 16 至 13. 08g/l，優(yōu)選 0? 33 至 3. 27g/l 檸檬酸，
[0027] -0? 11 至 8. 88g/l，優(yōu)選 0? 22 至 2. 22g/l 磷酸二氫鈉，
[0028] _1.60至127.6(^/1，優(yōu)選3.19至31.9(^/1右旋糖，和
[0029] -0? 01 至 I. lg/1，優(yōu)選 0? 03 至 0? 28 腺嘌呤。
[0030] 如上文定義的所述水溶液（在下文中還稱為"包被溶液"）是優(yōu)選的，原因在于含 有26. 3g/l檸檬酸三鈉、3. 27g/l檸檬酸、2. 22g/l磷酸二氫鈉、31. 9g/l右旋糖和0. 275g/l 腺嘌呤的水溶液是已經(jīng)得到FDA和歐洲當(dāng)局核準(zhǔn)的溶液。所述溶液，即所謂的CPDA-I溶液， 確定為用于血袋的抗凝劑-防腐劑和輔藥，以允許在基本上不損失血細(xì)胞活力的前提下保 存35天。
[0031] 按照特別優(yōu)選的實施方案，用于按照本發(fā)明的應(yīng)用的溶液是上文提及的CPDA-I 溶液的5至40體積％溶液。按照最優(yōu)選的實施方案，使用上文提及的CPDA-I溶液的10至 20體積％溶液。
[0032] 換言之，按照本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案，使用由下述組成的水溶液：2. 63至 5. 26g/l檸檬酸三鈉、0? 327至0? 654g/l檸檬酸、0? 222至0? 444g/l磷酸二氫鈉、3. 19至 6. 38g/l右旋糖和0. 0275至0. 055g/l腺嘌呤，并且其余的是水。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的"骨替代材料"可以是本領(lǐng)域已知的任意得益于改善的骨整合的骨 替代材料。按照本發(fā)明使用的骨替代材料可以是可吸收性的或不可吸收性的。此外，按照 本發(fā)明使用的骨替代材料可以具有骨傳導(dǎo)特性或骨傳導(dǎo)加骨誘導(dǎo)特性。本發(fā)明中所用的典 型的骨替代材料包括合成的、人造的和天然的骨替代材料。可以提及作為實例的是基于陶 瓷的骨替代材料，如基于陶瓷的磷酸三鈣，磷酸鈣粘固劑，牛來源的羥基磷灰石和基于聚合 物的物質(zhì)，例如，由聚已內(nèi)酯和/或聚氨酯制成的基于聚合物的材料。按照本發(fā)明的優(yōu)選的 實施方案，所述骨替代材料包含磷酸三鈣。按照甚至更優(yōu)選的實施方案，所述骨替代材料是 磷酸三鈣或￠-磷酸三鈣和豬明膠的混合物。
[0034] 還可能的是，所述骨替代材料另外提供有改善或促進(jìn)所述骨替代材料的骨誘導(dǎo)和 /或成骨特性的方式。還可能使用具有提供有生長因子、優(yōu)選轉(zhuǎn)化生長因子3、例如骨形態(tài) 生成蛋白（BMP-2,-4,-7)、或與富血小板血漿（PRP)組合的表面的牙支持部件。生長因子可 以進(jìn)一步包括選自由下述組成的組的任一種：血小板衍生生長因子（PDGF)，血管內(nèi)皮生長 因子（VEGF)，胰島素樣生長因子（IGF)，成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)，分化因子5 (GDF-5)。 [0035] 骨整合是活的骨骼與骨替代材料表面之間直接的結(jié)構(gòu)和功能連接。骨替 代材料表面的濃厚的血液蛋白涂層和濃密的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)整合將影響細(xì)胞-詢問 (cell-interrogation)、招募、增殖、分化和基質(zhì)成熟的級聯(lián)。形成初級基質(zhì)的纖維蛋白纖 維是"高速路"，在其上軟組織和硬組織形成細(xì)胞沿著其移動至骨替代材料的表面。由激 活的血小板釋放出來的蛋白和生長因子支持并組織細(xì)胞通信。所述血小板釋放的因子還 誘導(dǎo)并且放大內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，并且由此起始血管發(fā)生。血管的侵入和出芽 (sprouding)是高度活性再生細(xì)胞所需要的充分的營養(yǎng)和氧供應(yīng)的先決條件。通過最優(yōu)化 在骨替代材料表面上的創(chuàng)面愈合過程，接觸-骨發(fā)生將較早發(fā)生，并且最終骨整合將被加 速。
[0036] 按照本發(fā)明的第二方面，上文定義的試劑用于產(chǎn)生上文定義的骨替代材料的涂 層。如上文所解釋的，按照本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，將所述試劑溶解在水中形成水溶 液。優(yōu)選地，用于在骨替代材料的表面形成涂層的水溶液如上文所定義。
[0037] 用上文定義的試劑涂覆骨替代材料的方法沒有特別的限制，并且可以使用任意已 知的方法。
[0038] 在使用上文定義的水溶液形式的試劑的情形中，可以將所述骨替代材料在室溫 (25°C )浸沒在所述水溶液中，S卩，上文定義的水溶液中，例如，浸沒10分鐘。在多孔骨替代 材料的情形中，推薦施加低真空（例如，600mbar)，例如，約10分鐘，以確保涂覆溶液滲透到 孔中。然后，將所述骨替代材料從所述溶液中取出，并且晾干，例如，在37°C 30分鐘。然而， 涂覆的材料的干燥不是必需的。備選地，還可以直接使用所述包被的骨替代材料（即，不經(jīng) 過干燥）進(jìn)行移植。
[0039] 如果需要，上文示例的方法可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦薷摹＠?，可以先對所述骨替代材?施加真空，由此去除表面上吸收的水。在多孔的骨替代材料的情形中，這樣的預(yù)處理是優(yōu)選 的，原因在于在進(jìn)行涂覆步驟之前去除孔中吸收的水是有益的。然后，將這樣處理的材料用 涂覆溶液涂覆，例如，通過將所述骨替代材料浸沒在涂覆溶液中進(jìn)行。
[0040] 尤其是在無孔性骨替代材料的情形中，其中涂覆溶液向孔中的滲透不是問題，可 以在將所述骨替代材料插入到硬組織或軟組織中之前立即將所述涂覆溶液直接傾倒在患 者的創(chuàng)面中，即，缺損部位。由此，可以獲得用所述涂覆溶液對所述骨替代材料的覆蓋。
[0041] 還可以使用單組分溶液逐步應(yīng)用對所述骨替代材料表面的涂覆。例如，可以首先 將所述骨替代材料浸沒在含有檸檬酸三鈉的溶液中，然后浸沒在含有檸檬酸的溶液中，然 后將所述骨替代材料浸沒在含有磷酸二氫鈉的溶液中，這之后，將這樣處理的材料浸沒在 含有右旋糖的溶液中，并且最后，將所述材料浸沒在含有腺嘌呤的溶液中。單組分溶液可以 以任意順序應(yīng)用到所述骨替代材料的表面上。備選地，還可以在涂覆步驟之前制備兩種、三 種或四種上文提及的試劑的溶液。
[0042] 在試劑不溶于水的情形中，作為對骨替代材料應(yīng)用涂覆的備選方法，可以提及化 學(xué)氣相沉積和暴露于干燥的結(jié)晶試劑。
[0043] 按照第三方面，本發(fā)明提供了一種提供有至少一個涂層的骨替代材料，其中所述 涂層可通過將所述骨替代材料浸沒在包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌 呤的水溶液中獲得。所述水溶液與上文所規(guī)定的相同。
[0044] 涂層的厚度沒有特別限制，并且可以在幾個微米至幾個毫米之間。涂層的厚度取 決于涂覆溶液的濃度和涂覆的條件。通常，可以說，較高濃縮的涂覆溶液增加骨替代材料上 的涂層的厚度。備選地，如果意欲增加骨替代材料上的涂層的量，則可以按需要那樣經(jīng)常重 復(fù)涂覆步驟。
[0045] 此外，涂覆有上文定義的試劑、特別是上文定義的包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸 二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤的涂覆溶液的骨替代材料的表面優(yōu)選是超親水性的。涂覆的骨替 代材料的可濕性可以通過按照座滴法（Sessile-Drop-Method)測量接觸角進(jìn)行確定。根據(jù) 本發(fā)明的涂覆的骨替代材料在時間t = Os(水滴與表面的首次接觸的時間）表現(xiàn)出低于 30°的接觸角，特別是約20°的接觸角。然而，水滴在幾秒鐘內(nèi)完全擴散在表面上，諸如低 于50ms，更具體地約5至IOms完全擴散。這樣的濕潤行為是親水性表面所特有的。
[0046] 在第四方面，本發(fā)明涉及用于在安裝骨替代材料的方法中使用的試劑盒，其中所 述試劑盒包括骨替代材料、檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
[0047] 可能的是，按照第四方面所述的試劑盒包含作為以干燥粉末的形式包裝的干燥的 試劑的檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。所述干燥粉末可以分開包裝或 作為兩種或更多種或所有干燥的試劑的混合物包裝。在涂覆骨替代材料之前，這些干燥的 粉末可以溶解在適量的水中以制備上文定義的涂覆溶液。
[0048] 按照本發(fā)明第四方面的更優(yōu)選的實施方案，所述試劑盒包含含有檸檬酸三鈉、檸 檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤的水溶液。優(yōu)選地，所述試劑盒包含根據(jù)上述優(yōu)選的實 施方案的水溶液。例如，要包含在本發(fā)明的試劑盒中的水溶液由下述組成：2. 63至5. 26g/ 1檸檬酸三鈉、〇? 327至0? 654g/l檸檬酸、0? 222至0? 444g/l磷酸二氫鈉、3. 19至6. 38g/l 右旋糖和〇. 0275至0. 055g/l腺嘌呤，并且其余的是水。 實施例
[0049] 實施例I
[0050] 已經(jīng)使用膜形式的骨替代材料Artelonu。Artelonu是一種可生物降解的聚氨脂 脲。該材料已被涂覆有具有下述組成的涂覆溶液：
[0051] -2. 63g/l檸檬酸三鈉，
[0052] -0? 327g/l 檸檬酸，
[0053] -0? 222g/l 磷酸二氫鈉，
[0054] -3. 19g/l 右旋糖，和
[0055] -0.0275g/l 腺嘌呤。
[0056] 所述骨替代材料已被浸沒在所述涂覆溶液中10分鐘。然后，施加 600mbar的低真 空。10分鐘后，將所述骨替代材料從所述涂覆溶液中取出，并且在37°C干燥20分鐘。
[0057] 為了確定與所述骨替代材料的表面直接接觸的血液的凝結(jié)，將涂覆的材料暴露于 新鮮的（即，未凝結(jié)的）人血液。凝結(jié)特性作為允許骨整合的有益條件的指征。因此，將涂 覆的材料放置在Eppendorf小瓶中，并且加入血液。10分鐘后，去除所述材料，并且在甲醛 溶液中固定。將這樣固定的材料在4°C保存過夜。
[0058] 為了比較的原因，將膜形式的但未提供有上述涂層的相同的骨替代材料 Artelon ?用血液以與上文所述相同的方式處理。
[0059] 圖Ia顯示所述骨替代材料暴露于未凝結(jié)的血液后的SEM照片（放大倍數(shù)= 1，000-倍），其中所述材料未提供有根據(jù)本發(fā)明的涂層。
[0060] 圖Ib顯示根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料暴露于未凝結(jié)的血液后的SEM照片（放大倍 數(shù)=1，000-倍）。
[0061] 從圖Ia與圖Ib的比較清楚可見，與未處理的骨替代材料相比，在根據(jù)本發(fā)明的骨 替代材料的表面上，血液蛋白包被、血小板激活和纖維蛋白纖維連接得到極大地改善。
[0062] 實施例2
[0063] Cerasorb明膠型的骨替代材料已經(jīng)以與實施例1所述相同的方式進(jìn)行涂覆。
[0064] 將涂覆的骨替代材料用血液以與實施例1所述相同的方式進(jìn)行處理。
[0065] 此外，為了比較的原因。將未涂覆的骨替代材料用血液以相同的方式進(jìn)行處理。
[0066] 血液處理的骨替代材料的表面顯示在圖2a和2b中。由圖2a與圖2b的比較清楚 看出，與未處理的骨替代材料相比，在根據(jù)本發(fā)明的骨替代材料的表面上，血液蛋白包被、 血小板激活和纖維蛋白纖維連接得到極大地改善。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于改善或促進(jìn)骨替代材料的骨整合的試劑，其中所述試劑包含檸檬酸三鈉、 檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中所述骨替代材料包含磷酸三鈣。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述試劑溶解在水中形成水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其中所述水溶液包含： -1. 32至105. 20g/l檸檬酸三鈉， -0? 16 至 13. 08g/l 檸檬酸， -0? 11至8. 88g/l磷酸二氫鈉， -1.60至127. 60g/l右旋糖，和 -0.01 至 1. 10g/l 腺嘌呤。
5. 試劑用于產(chǎn)生骨替代材料上的涂層的應(yīng)用，其中所述試劑包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、 磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述骨替代材料包含磷酸三鈣。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其中所述試劑溶解在水中形成水溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述水溶液包含： -1. 32至105. 20g/l檸檬酸三鈉， -0? 16 至 13. 08g/l 檸檬酸， -0? 11至8. 88g/l磷酸二氫鈉， -1.60至127. 60g/l右旋糖，和 -0.01 至 1. 10g/l 腺嘌呤。
9. 一種骨替代材料，其特征在于，其提供有至少一個涂層，其中所述涂層能夠通過將所 述骨替代材料浸沒在包含檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤的水溶液中獲 得。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的骨替代材料，其中所述骨替代材料包含磷酸三鈣。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的骨替代材料，其中所述水溶液包含： -1. 32至105. 20g/l檸檬酸三鈉， -0? 16 至 13. 08g/l 檸檬酸， -0? 11至8. 88g/l磷酸二氫鈉， -1.60至127. 60g/l右旋糖，和 -0.01 至 1. 10g/l 腺嘌呤。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項所述的骨替代材料，其中所述骨替代材料的表面是親 水性的。
13. -種用于在安裝骨替代材料的方法中使用的試劑盒，其中所述試劑盒包含骨替代 材料、檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和腺嘌呤。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中檸檬酸三鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、右旋糖和 腺嘌呤存在于水溶液中。
【文檔編號】A61L27/28GK104428015SQ201380036852
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月14日
【發(fā)明者】京特·烏爾 申請人:諾貝爾生物服務(wù)公司