持續(xù)釋放制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明廣泛涉及持續(xù)釋放制劑領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明描述涉及用純化的沒(méi)食子酸酯對(duì)蛋白和/或肽進(jìn)行制劑化的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)例中，沒(méi)食子酸酯是五沒(méi)食子酰葡萄糖（PGG），在另一實(shí)例中，沒(méi)食子酸酯是表兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）。
【專利說(shuō)明】持續(xù)釋放制劑
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年4月25日，申請(qǐng)?zhí)枮?00580012459.2，發(fā)明名稱為“持續(xù)釋放制劑”的發(fā)明專利的分案申請(qǐng)。
[0002]本申請(qǐng)要求2004年4月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/565，247的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明廣泛涉及持續(xù)釋放制劑領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明描述涉及用純化的沒(méi)食子酸酯對(duì)蛋白和/或肽進(jìn)行制劑化的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)例中，沒(méi)食子酸酯是五沒(méi)食子酰葡萄糖(PentaGalloylGlucose, PGG),其中沒(méi)食子酸也稱作3,4, 5三羥基苯甲酸,在另一實(shí)例中，沒(méi)食子酸酯是表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。
[0004]背景
[0005]為了實(shí)現(xiàn)蛋白或肽的體內(nèi)連續(xù)送遞，需要持續(xù)釋放或持續(xù)送遞制劑來(lái)避免重復(fù)施用的需要。持續(xù)藥物送遞的一種方法是通過(guò)微膠囊包封，其中活性成分包封在聚合物膜中以產(chǎn)生微粒。
[0006]已經(jīng)證明可以將生物活性或藥學(xué)活性劑包封在生物相容性、生物可降解的壁形成材料如聚合物中，以提供持續(xù)或延遲的釋放。在這些方法中，試劑或藥物典型地是用攪拌器、振蕩器或其它動(dòng)力學(xué)混合技術(shù)溶解、分散或乳化在一種或多種含有壁形成材料的溶劑中。然后除去溶劑，導(dǎo)致形成包封試劑或藥物的微粒。然后可以將這些微粒施用于患者。
[0007]目前已經(jīng)確立了作為腸胃外藥物送遞系統(tǒng)的載體的生物相容性和/或生物可降解的聚合物的重要性。要施用的含有活性劑的生物相容性、生物可降解的和相對(duì)惰性的物質(zhì)如聚(丙交酯)(PLA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)微球或膜通常利用持續(xù)釋放裝置(綜述參見(jiàn) M.Chasin, Biodegradable polymers for controlled drug delivery.1n:J.0.Hollinger Editor, Biomedical Applications of Synthetic BiodegradablePolymers CRC, Boca Raton, FL (1995), pp.1-15 ；T.Hayashi, Biodegradable polymers
for biomedical uses.Prog.Polym.Sc1.194(1994)，pp.663-700 ;和 Harjit Tamber, PM
Johansen, HansP.Merkle and Bruno Gander, Formulation aspects of biodegradablepolymeric microspheres for antigen delivery Advanced Drug Delivery Reviews,Volume57,Issue3,10January2005, Pages357_376)。
[0008]但是，設(shè)計(jì)活性劑的送遞系統(tǒng)仍然存在很多挑戰(zhàn)。所述送遞系統(tǒng)的基本要求是使用的材料是腸胃外應(yīng)用可接受的。如上文所提到的，需要使用的材料對(duì)于意欲重復(fù)施用的制劑是生物可降解的。另一個(gè)通常需要的質(zhì)量是生物相容性:材料應(yīng)該是耐受良好的，生物降解應(yīng)該產(chǎn)生無(wú)害的化合物，這些化合物可以從身體除去或整合到中間代謝中。通常用于制造腸胃外制劑的材料是有限的，并且對(duì)于腸胃外蛋白制劑仍然是短缺的。
[0009]另一個(gè)需要的特性是釋放包封的活性劑的足夠良好的控制。通常重要的是在足夠獲得需要的效果并且避免過(guò)量濃度的有效時(shí)間窗內(nèi)維持活性劑的濃度，所述過(guò)量濃度可能導(dǎo)致副作用或不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。用單片微粒作為施用后第一天內(nèi)釋放的活性劑的級(jí)份達(dá)到需要的釋放動(dòng)力學(xué)通常是困難的，通常取決于藥物的加載水平。[0010]持續(xù)送遞技術(shù)的另一個(gè)需要的特征，特別是當(dāng)應(yīng)用于大分子送遞時(shí)，是在制造過(guò)程中維持活性劑的完整性。這通常是一個(gè)困難的挑戰(zhàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白和肽藥物的生物活性依賴于三維構(gòu)象，該構(gòu)象很容易被破壞。例如，用于制造控釋腸胃外制劑的大多數(shù)聚合物在水中不溶解，因此蛋白或肽在包封步驟中暴露于有機(jī)溶解。與制造控釋制劑相關(guān)的、可能破壞任何特定活性劑的完整性的其它不利脅迫是用于在連續(xù)相中形成聚合物液滴的高剪切力、暴露于聚合反應(yīng)、高溫和不利的低或高PH值。
[0011]持續(xù)釋放形式的另一個(gè)需要的特性是在釋放過(guò)程中，在微粒內(nèi)保持活性劑，特別是蛋白或肽的完整性。根據(jù)選擇的釋放持續(xù)時(shí)間，該階段可以是幾天到幾個(gè)月。對(duì)于由PLGA形成的常規(guī)聚合物基質(zhì)系統(tǒng)，在聚合物的生物降解過(guò)程中形成的酸性微環(huán)境可能在體外和體內(nèi)溫育過(guò)程中降解摻入其中的活性劑。
[0012]現(xiàn)有技術(shù)描述了多種持續(xù)送遞組合物和制備它們的方法，例如，美國(guó)專利US5, 916，597 ;5，019，400 ;5，922，253 ;和6，531，154。在很多情況下，摻入的活性劑從生物相容性和生物可降解聚合物中的體內(nèi)釋放最初是高或低的，因此在送遞裝置的壽命中是不均一的。此外，用聚合物進(jìn)行的微膠囊包封容易提供從2周到9個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間的肽持續(xù)送遞，而對(duì)于某些藥物來(lái)說(shuō)，需要較短期的送遞譜。因此，本領(lǐng)域需要具有小于大約一周或兩周的釋放譜的持續(xù)釋放組合物。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定的持續(xù)釋放復(fù)合物的藥物組合物，所述復(fù)合物包含蛋白和/或肽和沒(méi)食子酸酯，該組合物允許在施用復(fù)合物后在體內(nèi)持續(xù)送遞蛋白或肽。因此，本發(fā)明的復(fù)合物可以允許 在小于大約I或2周的時(shí)間段中將藥物活性肽連續(xù)送遞給受試者。
[0015]本發(fā)明的復(fù)合物是通過(guò)在使得形成復(fù)合物的條件下組合蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯形成的。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，復(fù)合物是沒(méi)食子酸酯和蛋白或肽的鹽。復(fù)合物在水中是典型地難溶的，并且可以從多種水溶液中純化。由于復(fù)合物是固體形式(如糊、顆粒、分泌或凍干物)，可以制備復(fù)合物，用于作為穩(wěn)定的液體懸浮液或半固體分散體施用給受試者。
[0016]在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，適用于與肽或蛋白形成復(fù)合物的基團(tuán)是沒(méi)食子酸酯。優(yōu)選地，酯本身是通過(guò)沒(méi)食子酸的酸基團(tuán)與諸如糖的另一個(gè)化合物上的醇部分的連接而形成的。在一種具體實(shí)施方案中，沒(méi)食子酸酯是五沒(méi)食子?；咸烟?PGG)，其中沒(méi)食子酸也稱作3，4，5_三羥基苯甲酸。在另一實(shí)施方案中，沒(méi)食子酸酯是表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。
[0017]發(fā)明詳述
[0018]本發(fā)明涉及包含持續(xù)釋放復(fù)合物的組合物，所述復(fù)合物包含蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯，還涉及制備所述組合物的方法和使用所述組合物的方法。盡管沒(méi)食子酸酯是公知的丹寧酸的成分，但是，還沒(méi)有描述過(guò)如此處描述的用高度純化的丹寧酸的成分如特定的沒(méi)食子酸酯與肽和多肽制備鹽，以產(chǎn)生持續(xù)釋放的制劑。本發(fā)明的組合物的優(yōu)點(diǎn)包括在控制的時(shí)間段中(如典型地小于大約I或2周)系統(tǒng)或局部送遞復(fù)合物的肽或蛋白部分。也涉及送遞更長(zhǎng)的時(shí)間段。
[0019]如此處用到的術(shù)語(yǔ)“蛋白”和“肽”理解為包含通過(guò)酰胺鍵連接的氨基酸的聚合物。典型地，肽包含少于約50個(gè)氨基酸，更典型地少于約30個(gè)氨基酸殘基，甚至更典型地，少于約20個(gè)氨基酸殘基。而蛋白典型地包含超過(guò)50個(gè)氨基酸，并且具有結(jié)構(gòu)和生物活性。蛋白的生物活性可以是酶活性或可以是賦予構(gòu)象改變的結(jié)合活性。這些術(shù)語(yǔ)意欲包括模擬蛋白或肽的成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)的類似物和衍生物。類似物的例子包括含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的肽或蛋白。示例的衍生物包括含有氨基酸側(cè)鏈、肽主鏈和/或經(jīng)過(guò)衍生的氨基或羧基末端的肽或蛋白。
[0020]適于本發(fā)明的制劑的肽包括但不限于enfuvirtide(由Trimeris和Roche以
Fuzeon?的商品名出售)、血管緊張素原、糊精、acth、腎素底物、殺菌肽A-蜂毒肽酰胺、
殺菌肽B、爪蟾抗菌肽1、腎素抑制劑肽、鈴蟾肽、骨鈣蛋白、緩激肽、BI抑制劑肽、緩激肽肽拮抗劑，包括公開(kāi)于2004年10月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)N0.10/972，236的緩激肽肽拮抗劑、血管舒張肽、降鈣素、縮膽囊素、促皮質(zhì)素釋放因子、強(qiáng)啡肽A、內(nèi)啡素、角蛭毒素、腦啡肽、Exendin、血纖肽、Galanin、胃泌素、胃泌素釋放肽、胰高血糖樣肽、生長(zhǎng)激素釋放因子、OVA肽、促黃體生成激素釋放激素、心房利鈉肽、黑色素濃集激素、腦利鈉肽、Vasonatrin、神經(jīng)激肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)降壓素、Orexin、催產(chǎn)素、加壓素、甲狀旁腺素肽、促乳素釋放肽、生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)抑素腫瘤抑制類似物、促甲狀腺素釋放激素及其變體和衍生物(也參見(jiàn) Latham, (1999)Nat.Biotech.，17:755)。[0021]可以根據(jù)本發(fā)明制劑化的肽包括但不限于Flt3配體、⑶40配體、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、降鈣素、Fas配體、NF-K B的受體激活劑的配體(RANKL)、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、ORK/Tek、胸腺基質(zhì)衍生的淋巴生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、RANTES、生長(zhǎng)素、胰島素、促胰島素分泌素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、胰高血糖素、白介素1-18、集落刺激因子、淋巴毒素-β、腫瘤壞死因子、白血病抑制因子、制癌蛋白M和細(xì)胞表面分子Elk和Hek的多種配體(如印h相關(guān)激酶或LERKS的配體)。制備所述蛋白的說(shuō)明可以參見(jiàn)，例如，人細(xì)胞因子:Handbook for Basic and Clinical Research, Vol.1I (Aggarwal and Gutterman, Eds.Blackwell Sciences, Cambridge MA, 1998);生長(zhǎng)因子:A Practical Approach(McKay and Leigh,Eds.0xford University Press Inc.,New York,1993)和 The Cytokine Handbook(AW Thompson, ed.；Academic Press, San Diego CA ；1991)。
[0022]也可以根據(jù)本發(fā)明對(duì)前述任何蛋白的受體制劑化，前提是它們是適于施用給受試者的分子的可溶部分。實(shí)例包括以下物質(zhì)的受體:兩種形式的腫瘤壞死因子受體(稱作P55和p75)、白介素-1受體(I型和2型)、白介素-4受體、白介素-15受體、白介素-17受體、白介素-18受體、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體、粒細(xì)胞集落刺激因子受體、制癌蛋白M和白血病抑制因子的受體、NF-kB的受體激活劑(RANK)、TRAIL的受體，以及包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體，如Fas或凋亡誘導(dǎo)受體(AIR)。一種特別優(yōu)選的受體是可溶形式的II型IL-1受體；所述蛋白描述于美國(guó)專利N0.5，767，064，在此全文引入作為參考。
[0023]可以根據(jù)本發(fā)明制劑化的其它蛋白包括分化抗原簇的可溶性變體(稱作CD蛋白)，例如，公開(kāi)于 Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth InternationalWorkshop and Conference ；Kishimoto, Kikutani et al., Eds.Kobe, Japan, 1996)中的那些，或公開(kāi)于后續(xù)的專題學(xué)術(shù)討論會(huì)的⑶分子。所述分子的例子包括⑶27、⑶30、⑶39、⑶40及其配體(⑶27配體、⑶30配體和⑶40配體)。這些中的一些是TNF受體家族的成員，該家族也包括41BB和0X40 ;配體通常是TNF家族的成員(如同41BB配體和0X40配體)；因此，也可以用本發(fā)明制備TNF和TNFR家族的成員。
[0024]也可以根據(jù)本發(fā)明對(duì)具有酶活性的蛋白制劑化。實(shí)例包括金屬蛋白酶-解聯(lián)蛋白家族成員、多種激酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活劑、因子VII1、因子IX、載脂蛋白Ε、載脂蛋白A-Ι、球蛋白、IL-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶、TNF-α轉(zhuǎn)化酶和許多其它酶。也可以通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明，對(duì)具有酶活性的蛋白的配體進(jìn)行制劑化。
[0025]本發(fā)明的組合物和方法也可以用于對(duì)其它類型的蛋白進(jìn)行制劑化，包括免疫球蛋白分子或其部分和嵌合抗體(即，具有與鼠抗原結(jié)合區(qū)偶聯(lián)的人恒定區(qū)的抗體)或其片段?？梢酝ㄟ^(guò)許多公知的技術(shù)操作編碼免疫球蛋白分子的DNA，以產(chǎn)生能夠編碼重組蛋白，如單鏈抗體、親和力增強(qiáng)的抗體或其它基于抗體的蛋白的DNA(參見(jiàn),例如，Larrick et al.,1989, Biotechnology?:934-938 ；Reichmann et al.,1988, Nature 332:323-327 ；Robertset al., 1987, Nature328:731-734 ；Verhoeyen et al., 1988, Science239: 1534-1536 ；Chaudhary et al., 1989,Nature339:394-397)。術(shù)語(yǔ)人源化抗體也包括單鏈抗體。參見(jiàn),例如，Cabilly et al.，美國(guó)專利N0.4，816，567 ;Cabilly et al.，歐洲專利N0.0，125，023B1 ;Boss et al.，美國(guó)專利 N0.4，816，397 ；Boss et al.，歐洲專利 N0.0, 120，694B1 ；Neuberger, M.S.et al.，W086/01533 ；Neuberger, M.S.et al.，歐洲專利 N0.0, 194, 276B1 ；Winter，美國(guó)專利 N0.5，225，539 ；ffinter,歐洲專利 N0.0, 239，400B1 ；Queen et al.，歐洲專利 N0.0 451 216B1 ;和 Padlan，E.A.et al.，EP O 519 596 Al。例如，本發(fā)明可以用于制劑化免疫特異性識(shí)別特異性細(xì)胞靶的人和/或人源化抗體，所述細(xì)胞靶如上文提到的任意蛋白、人EGF受體、her-2/neu抗原、CEA抗原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、⑶5、⑶I la、CD18、NGF、CD20、CD45、Ep-cam、其它癌細(xì)胞表面分子、TNF-α , TGF- β 1、VEGF、其它細(xì)胞因子、a4β7整聯(lián)蛋白、IgES、病毒蛋白(例如巨細(xì)胞病毒)等，以上僅僅提到了少數(shù)幾種。
[0026]也可以根據(jù)本發(fā)明制劑化多種融合蛋白。融合蛋白是與異源蛋白或肽融合的蛋白或蛋白的結(jié)構(gòu)域(如可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)。所述融合蛋白的實(shí)例包括表達(dá)為與免疫球蛋白分子的一部分的融合體的蛋白、表達(dá)為具有拉鏈結(jié)構(gòu)部分的融合蛋白的蛋白，和新的多功能蛋白，如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(即，GM-CSF和IL-3、MGF和IL-3)的融合蛋白。W093/08207和W096/40918分別描述了稱作⑶40L的分子的多種可溶性寡聚形式，包括免疫球蛋白融合蛋白和拉鏈結(jié)構(gòu)融合蛋白的制備；其中討論的技術(shù)適用于其它蛋白。另一種融合蛋白是重組TNFR:Fc,也稱作“etanercept”。Etanercept是兩個(gè)分子的p75TNF α受體的細(xì)胞外部分的二聚體，每個(gè)分子由與人IgGl的232個(gè)氨基酸的Fe部分融合的235個(gè)氨基酸的TNFR衍生的蛋白組成。實(shí)際上，前述任何分子都可以表達(dá)為包括但不限于以下成分的融合蛋白:細(xì)胞受體分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、酶、激素、細(xì)胞因子、免疫球蛋白分子的一部分、拉鏈結(jié)構(gòu)域和表位。
[0027]此處用到的術(shù)語(yǔ)“沒(méi)食子酸酯”是指可以與蛋白或肽復(fù)合以形成持續(xù)釋放的復(fù)合物的分子。在一個(gè)實(shí)例中，沒(méi)食子酸酯分子是五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG，本領(lǐng)域也稱作5GG)。據(jù)理解，PGG分子可以具有一個(gè)沒(méi)食子?；?、兩個(gè)沒(méi)食子?；⑷齻€(gè)沒(méi)食子?；蛩膫€(gè)沒(méi)食子?；?。此外，據(jù)理解，葡萄糖可以被其它碳主鏈取代，如醇或多元醇，如甘油、乙二醇或適于使用的任何糖基。在另一種實(shí)施方案中，表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是用于本發(fā)明中與肽或蛋白制備鹽的沒(méi)食子酸酯分子。EGCG是分離自綠茶的抗氧化的多酚類黃酮。EGCG酯連接于非糖的環(huán)結(jié)構(gòu)，這點(diǎn)與PGG不同。此外，據(jù)理解，沒(méi)食子酸酯可以具有不同的立體化學(xué)形式。例如，PGG可以是α或β形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處的教導(dǎo)，能夠鑒定用于本發(fā)明的組合物和方法的合適沒(méi)食子酸酯分子。
[0028]此處用到的術(shù)語(yǔ)“持續(xù)釋放復(fù)合物”是指在合適組合了此處描述的蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯后形成的物理和化學(xué)穩(wěn)定的復(fù)合物。該復(fù)合物通常采取沉淀物的形式，該沉淀物是在組合了蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的水性或非水制劑后產(chǎn)生的。
[0029]此處用到的術(shù)語(yǔ)“持續(xù)送遞”是指在施用后一段時(shí)間藥劑的體內(nèi)連續(xù)送遞。例如，試劑的持續(xù)送遞可以由試劑隨時(shí)間的持續(xù)療效證明?；蛘撸噭┑某掷m(xù)送遞可以通過(guò)檢測(cè)試劑隨時(shí)間在體內(nèi)的存在而證明。在一種實(shí)施方案中，持續(xù)送遞少于一周，并且可以少于4天。但是，認(rèn)為持續(xù)送遞可以是用本發(fā)明的組合物達(dá)到的超過(guò)I周的時(shí)間段，包括兩周以上。
[0030]不同pH下與肽或蛋白的PGG或EGCG復(fù)合物的形成會(huì)影響藥物送遞的時(shí)間。如下文實(shí)施例4和5所示，pH7.0時(shí)與肽形成PGG復(fù)合物，導(dǎo)致復(fù)合物在血清中的持續(xù)時(shí)間(即，大約I周)比在PH7.6和pH8.6時(shí)形成的復(fù)合物在血清中的持續(xù)時(shí)間(即，小于I周)長(zhǎng)。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，通過(guò)形成復(fù)合物時(shí)的PH部分地控制藥物送遞的持續(xù)時(shí)間。代表性的pH范圍是6.0-9.0, pH6.5-8.6、ρΗ7.0-8.6的范圍也是合適的。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，其它PH可能是合適的，并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定適合與本發(fā)明的丹寧酸酯復(fù)合的特定藥物的所需藥物送遞譜的最適pH。
[0031]本發(fā)明的一方面涉及包含藥物活性劑如蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的 藥物組合物允許在給受試者施用組合物后蛋白或肽在受試者體內(nèi)的持續(xù)送遞，其中根據(jù)肽和沒(méi)食子酸酯復(fù)合物的溶解度，持續(xù)送遞的持續(xù)時(shí)間可以改變。例如，在一種實(shí)施方案中，持續(xù)釋放的復(fù)合物在本發(fā)明的藥物組合物施用于受試者之后在小于I周的時(shí)間內(nèi)提供藥物活性劑的持續(xù)送遞。在另一種實(shí)施方案中，持續(xù)釋放復(fù)合物在小于4天的時(shí)間內(nèi)給受試者提供蛋白或肽的持續(xù)送遞。提供更長(zhǎng)或更短時(shí)間的持續(xù)送遞的制劑也包括在本發(fā)明的范圍中，如提供I天、2天、3天、4天、5天、6天或一周等的連續(xù)送遞。同樣，認(rèn)為可以對(duì)這些組合物進(jìn)行制劑化，使得它們提供超過(guò)一周，最多兩周或更長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)藥物送遞。
[0032]任何大小的氨基酸鏈都可以適用于復(fù)合物，只要蛋白或肽具有在與沒(méi)食子酸酯組合時(shí)形成持續(xù)釋放的非共價(jià)復(fù)合物的能力。
[0033]除了持續(xù)釋放復(fù)合物，本發(fā)明的藥物制劑可以包含額外的藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。此處用到的“藥學(xué)可接受的載體”包括任何和所有生理相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腸胃外施用(例如，通過(guò)注射)。賦形劑包括藥學(xué)可接受的穩(wěn)定劑和崩解劑。
[0034]除了與沒(méi)食子酸酯復(fù)合的肽的藥物制劑，本發(fā)明進(jìn)一步包括含有所述復(fù)合物和含有所述復(fù)合物的注射器的包裝的制劑。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有腔的注射器，其中腔內(nèi)包含了蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物。
[0035]通過(guò)在形成蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物的條件下組合蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯，制備本發(fā)明的復(fù)合物。因此，本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物制劑的方法。在一種實(shí)施方案中，該方法包括提供蛋白或肽和沒(méi)食子酸，在形成蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的復(fù)合物的條件下組合蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯，并且制備包含復(fù)合物的藥物制劑。
[0036]例如，組合蛋白或肽的溶液和沒(méi)食子酸酯的溶液，直到蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的持續(xù)釋放復(fù)合物沉淀出溶液。在某些實(shí)施方案中，蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的溶液是水溶液。獲得持續(xù)釋放復(fù)合物所必須的蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的量可以隨使用的特定蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯、使用的特定溶劑和/或用于獲得該復(fù)合物的程序而改變。如實(shí)施例中所證明，通常，蛋白或肽在重量/重量基礎(chǔ)上是過(guò)量的。
[0037]一旦蛋白或肽/沒(méi)食子酸酯復(fù)合物沉淀出溶液，可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，如過(guò)濾、離心等從溶液除去沉淀物。然后可以干燥回收的材料，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法碾碎或研磨成粉末?；蛘?，可以將糊冷凍，并且凍干?？梢詫⒎勰┬问降膹?fù)合物分散在載體溶液中，形成適于注射的液體懸浮液或半固體分散體。因此，在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑是凍干的固體、液體懸浮液或半固體分散體。
[0038]在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑是無(wú)菌制劑。例如，在形成持續(xù)釋放復(fù)合物后，通過(guò)Y射線照射或電子束滅菌，可以對(duì)復(fù)合物進(jìn)行滅菌。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的藥物制劑，包括粉末、液體懸浮液、半固體分散體、凍干的固體及其無(wú)菌形式(如通過(guò)Y射線照射或滅菌過(guò)濾)也包括在本發(fā)明中。
[0039]此處用到的術(shù)語(yǔ)“受試者”包括溫血?jiǎng)游铮瑑?yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。
[0040]此處用到的術(shù)語(yǔ)“施用于受試者”是指通過(guò)給受試者中有需要的部位送遞組合物的任何合適的途徑，給受試者分配、送遞或施加組合物(如藥物制劑)，包括通過(guò)腸胃外或口服途徑、肌內(nèi)注射、皮下/真皮內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、頰施用、經(jīng)皮送遞而進(jìn)行送遞，和通過(guò)直腸、結(jié)腸、陰道、鼻內(nèi)或呼吸道途徑施用。
[0041]以下實(shí)施例僅僅是代表性實(shí)施方案，不意欲限制本發(fā)明的完整范圍。
[0042]實(shí)施例1
[0043]實(shí)施例1提供了制備肽B-PGG鹽(1:1摩爾比的肽B (DOrn Lys Arg Pro HypGly Cpg Ser Dtic Cpg)與 PGG)的說(shuō)明。將 94mg PGG 溶于 2ml NaOH 溶液(NaOH 的濃度是
0.10-0.20N)制備PGG的儲(chǔ)液，然后通過(guò)0.2um濾器進(jìn)行過(guò)濾。在PGG的儲(chǔ)液(1.56mL)中依次加入溶于0.8mL水中的109.4mg肽B乙酸鹽的溶液，攪拌，并且形成沉淀物。通過(guò)離心回收沉淀物。
[0044]倒出上清液，用0.5mL水清洗沉淀物3次。在大約30_35°C真空干燥沉淀物大約20小時(shí)，產(chǎn)生125mg(76% )。肽B-PGG鹽是米色粉末。
[0045]實(shí)施例2
[0046]以與實(shí)施例1中肽B-PGG相似的方式制備肽A-PGG和丹寧酸酯的鹽。肽A是乙酰Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg0
[0047]實(shí)施例3
[0048]下文表1 和 2 列出了肽 A (乙酰 Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)和肽B (DOrn Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)與丹寧酸酯和PGG形成的鹽在水和PBS中的肽含量和溶解度。數(shù)據(jù)表明，PGG肽鹽比丹寧酸酯的鹽具有更高的肽含量。PGG沉淀物比單寧酸酯的鹽具有更高的PBS溶解度。
[0049]實(shí)施例4
[0050]研究了成鹽pH(即NAOH的濃度水平)對(duì)產(chǎn)率、肽含量和肽B-PGG鹽的溶解度的影響。在pH7.0，7.2，7.6和8.6制備和分離了四種肽B-PGG鹽。然后確定了它們?cè)谒蚉BS中的溶解度，以及它們的肽含量。這些結(jié)果證明(表3)，水溶解度、成鹽產(chǎn)率和肽含量隨成鹽過(guò)程中pH的增加而增加。
[0051]實(shí)施例5
[0052]該實(shí)施例描述了大鼠中肽Β/PGG和肽B/丹寧酸酯鹽的持續(xù)釋放。通過(guò)單次皮下注射(10mg/kg劑量)懸浮于TRIS緩沖液中的肽Β/PGG鹽和肽B/丹寧酸酯鹽進(jìn)行大鼠藥代動(dòng)力學(xué)(PK)研究；肽B乙酸鹽的PBS溶液作為對(duì)照組。PK研究表明，在pH7.0制備的肽B/單寧酸酯鹽和肽B-PGG鹽持續(xù)釋放I周。但是，在pH7.6和8.6制備的肽B-PGG鹽顯示出與ρΗ7.0時(shí)制備的鹽(最多至2周)相比較短的釋放持續(xù)時(shí)間(大約2-3天)。
[0053]實(shí)施例6
[0054]通過(guò)與實(shí)施例1的描述相似的方法制備肽B (DOrn Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg SerDtic Cpg)的PGG鹽的純端基異構(gòu)體(β-PGG)和端基異構(gòu)體的混合物(α+β-PGG)。這些鹽的水溶解度沒(méi)有顯著差異。根據(jù)水溶解度，預(yù)期這些鹽的體內(nèi)持續(xù)釋放時(shí)間將是相似的。
[0055]實(shí)施例7
[0056]以下實(shí)施例描述了用EGCG與肽制備鹽，在動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)(PK)研究中測(cè)定該鹽的持續(xù)釋放。將184mg EGCG溶于2ml0.2N的NaOH溶液，制備EGCG(Sigma-Aldrich)的儲(chǔ)液，然后通過(guò)0.2um濾器進(jìn)行過(guò)濾。攪拌下在EGCG的儲(chǔ)液(1.4mL)中緩慢加入溶于1.2mL水的 138mg 肽 B(D0rn Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg)的乙酸鹽的溶液。室溫下將得到的懸浮液攪拌大約10-15分鐘。離心后，倒去上清液，用ImL水清洗沉淀物(離心和倒去上清液3次)。大約30-35°C下真空干燥沉淀物大約20小時(shí)，以產(chǎn)生米色粉末狀的218mg (88% )肽 B-EGCG 鹽。
[0057]肽Β/EGCG鹽的肽含量是47-50 %。1: 3摩爾比的肽與EGCG的鹽的水溶解度在水中是<0.5mg/ml，在PBS中是<0.05mg/ml，對(duì)于1: 2摩爾比的肽與EGCG，溶解度在水中是大約lmg/ml,在PBS中是大約0.3mg/ml。用單次皮下注射(10mg/kg劑量)懸浮于ρΗ7.0的TRIS緩沖液中的‘593/EGCG鹽進(jìn)行大鼠PK研究。PK結(jié)果表明肽B在很多天持續(xù)釋放，24小時(shí)的血液水平> 26ng/ml,96小時(shí)減少至大約5ng/ml。
[0058]表1.肽A沉淀物
【權(quán)利要求】
1.一種持續(xù)釋放組合物，包含蛋白或肽和純化的沒(méi)食子酸酯的純化的復(fù)合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述復(fù)合物是肽和沒(méi)食子酸酯的鹽。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述沒(méi)食子酸酯選自五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述純化的沒(méi)食子酸酯是五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG)。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述肽和PGG的鹽在動(dòng)物中具有I周的釋放持續(xù)時(shí)間。
6.利要求4的組合物，其中所述肽和PGG的鹽在動(dòng)物中具有3周的釋放持續(xù)時(shí)間。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述純化的沒(méi)食子酸酯是表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。
8.權(quán)利要求2、3或4的任意一項(xiàng)的組合物，其中所述肽是BI肽拮抗劑。
9.權(quán)利要求8的組合物,其中所述肽選自i)DOrnLys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser DticCpg ;和 ii)乙酰 Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg,其中 Dorn 是鳥(niǎo)氨酸的 D 異構(gòu)體，Hyp是反式-4-羥基-脯氨酸， Dtic是1，2，3，4-四氫異喹琳_3_羧酸的D異構(gòu)體，Cpg是環(huán)戊基甘氨酸。
10.權(quán)利要求9的組合物,其中所述肽選自i)D0rnLys Arg Pro Hyp Gly Cpg SerDtic CpgjP ii)乙酸 Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg。
11.制備持續(xù)釋放復(fù)合物的方法，包括將蛋白或肽與沒(méi)食子酸酯混合和分離沉淀物的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其中在pH6.5-8.6之間的pH形成復(fù)合物。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述沒(méi)食子酸酯是PGG。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述沒(méi)食子酸酯是EGCG。
15.施用持續(xù)釋放復(fù)合物的方法，其中所述復(fù)合物包含蛋白或肽和沒(méi)食子酸酯的復(fù)合物的藥學(xué)可接受的制劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述沒(méi)食子酸酯是PGG。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述沒(méi)食子酸酯是EGCG。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述肽是BI肽拮抗劑。
19.權(quán)利要求16的方法,其中所述肽選自選自i)D0rnLys Arg Pro Hyp Gly Cpg SerDtic CpgjP ii)乙酸 Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg,其中 Dorn 是鳥(niǎo)氨酸的D異構(gòu)體，Hyp是反式-4-羥基-脯氨酸，Dtic是1，2，3，4-四氫異喹琳_3_羧酸的D異構(gòu)體，Cpg是環(huán)戊基甘氨酸。
20.權(quán)利要求19的方法,其中所述肽選自i)D0rnLys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser DticCpg ;和 ii)乙酸 Lys Lys Arg Pro Hyp Gly Cpg Ser Dtic Cpg。
【文檔編號(hào)】A61K47/22GK103920162SQ201410023256
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2005年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2004年4月23日
【發(fā)明者】M.S.戈登伯格, J.H.古 申請(qǐng)人:安姆根有限公司