旋毛蟲副肌球蛋白的補(bǔ)體功能相關(guān)抗原表位及抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫生物學(xué)領(lǐng)域，涉及旋毛蟲副肌球蛋白的補(bǔ)體功能相關(guān)抗原表位及抗體。具體地，本發(fā)明涉及一種抗原表位，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1－2中任一項(xiàng)所示。本發(fā)明的抗原表位具有有效的旋毛蟲減蟲率，從而具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物（例如疫苗）的潛力。
【專利說(shuō)明】旋毛蟲副肌球蛋白的補(bǔ)體功能相關(guān)抗原表位及抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫生物學(xué)領(lǐng)域，涉及旋毛蟲副肌球蛋白的補(bǔ)體功能相關(guān)抗原表位及抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]旋毛蟲病(Trichinellosis)是一種常見的食源性人獸共患寄生蟲病，嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。旋毛蟲病呈世界性分布，目前在俄羅斯及東歐國(guó)家、拉美國(guó)家及泰國(guó)等地流行嚴(yán)重。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果，1986~2009年間，有41個(gè)國(guó)家報(bào)道了旋毛蟲病的流行，病例達(dá)65, 818人(Murrell, K.D.and E.Pozio, Worldwideoccurrence and impact of human trichinellosis, 1986-2009.Emerg InfectDis, 2011.17(12):p.2194-202)。我國(guó)是世界上旋毛蟲病危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一，故該病不僅被列為我國(guó)三大食源性人獸共患寄生蟲病之一，同時(shí)也是政府提出的讓人民吃上“放心肉”的首檢和必檢的人獸共患病病種。伴隨我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高，人們的飲食習(xí)慣和飲食譜也隨之發(fā)生改變。近年來(lái)由于生食、涮、烤等食肉方式的多樣化，加之人們?cè)絹?lái)越多地食用狗肉及野生動(dòng)物肉類，使得我國(guó)旋毛蟲病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。2004~2009年間，僅西南三省就暴發(fā)旋毛蟲病15起，總病例1，387人，死亡4人(&1^.，2.0.1&1^ andB.L.Xu, The epidemiology of human trichinellosis in China during 2004-2009.ActaTrop, 2011.118(1):p.1_5)。衛(wèi)生部“第二次全國(guó)人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查”結(jié)果顯示，旋毛蟲病血清陽(yáng)性率平均高達(dá)3.38% (抽樣調(diào)查9.3萬(wàn)人血清)(許隆祺等，全國(guó)人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查報(bào)告.中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2005.23第5期增刊)，某些流行區(qū)(云南)人群感染陽(yáng)性率高達(dá)8.26%，提示當(dāng)前我國(guó)旋毛蟲病流行形勢(shì)比較嚴(yán)峻。
[0003]副肌球蛋白(paramyosin)是多種無(wú)脊椎動(dòng)物主要的結(jié)構(gòu)蛋白，脊椎動(dòng)物則無(wú)此蛋[=| (Gobert, G.N.and D.P.McManus, Update on paramyosin in parasitic worms.Parasitol Int, 2005.54 (2): p.101-7 )。早期的研究認(rèn)為副肌球蛋白的功能只是參與肌原纖維的聚集和粗肌絲的組裝，在肌肉收縮機(jī)制中起作用(Elfvin, Μ.，R.J.Levineand Μ.M.Dewey, Paramyosin in invertebrate muscles.1.1dentification andlocalization.J Cell Biol, 1976.71(1):p.261-72) ? 旋毛蟲的副肌球蛋白基因(Ts-PmyGenBank accession N0.:EF429310)全長(zhǎng)為 2996bp，其開放讀碼框架(0RF)2655bp，編碼885個(gè)氨基酸，理論分子量為102kDa。
[0004]旋毛蟲副肌球蛋白Ts-Pmy是一個(gè)具有前景的抗旋毛蟲病疫苗候選抗原分子，將其免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生Thl/Th2混合型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的免疫保護(hù)力導(dǎo)致36.2%的肌幼蟲減蟲率(Yang，J.，et al., Identification and characterization of afull-length cDNA encoding paramyosin of Trichinella spiralis.Biochem BiophysRes Commun, 2008.365 (3): p.528-33)。隨后的研究發(fā)現(xiàn):旋毛蟲副肌球蛋白Ts-Pmy可分布在新生幼蟲和成蟲的肌層及體表；蟲體體表的Ts-Pmy可與補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物(membrane attackcomplex, MAC)中的重要組分C9結(jié)合,抑制C9聚合反應(yīng)，進(jìn)而阻礙宿主MAC的組裝，使旋毛蟲得以部分逃避宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的殺傷；反之，用抗Ts-Pmy抗體封閉蟲體體表的Ts-Pmy，則增強(qiáng)了宿主補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)蟲體的殺傷效應(yīng)，揭示了除可作為抗旋毛蟲病疫苗候選抗原分子外，旋毛蟲Ts-Pmy還具有免疫調(diào)節(jié)功能，參與蟲體的免疫逃避作用(Zhang, Z., et al., Trichinella spiralis paramyosin binds to C8and C9and protectsthe tissue-dwelling nematode from being attacked by host complement.PLoS NeglTrop Dis，2011.5 (7):p.el225)0
[0005]綜上所述,需要篩選獲得補(bǔ)體C9功能相關(guān)的抗原表位及抗體,從而為抗旋毛蟲病疫苗的研制提供關(guān)鍵準(zhǔn)確的分子靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的工作，將Ts-Pmy分九段表達(dá)表達(dá)部分重疊的蛋白片段(PmyN、PmyM、PmyC、PmyCN、PmyCM、PmyCC、PmyCCN、PmyCCM、PmyCCC )，與人補(bǔ)體 C9蛋白進(jìn)行相互作用，發(fā)現(xiàn)其中羧基端片段可結(jié)合補(bǔ)體C9 (PmyC、PmyCC、PmyCCC)。之后本發(fā)明人根據(jù)PmyCCC的氨基酸序列設(shè)計(jì)合成了 12段多肽，并發(fā)現(xiàn)其中多肽P8與PlO可結(jié)合補(bǔ)體C9，獲得了補(bǔ)體C9功能相關(guān)的抗原表位(Ts-Pmy866Val-879Met)t5本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，獲得的表位多肽對(duì)補(bǔ)體C9聚合反應(yīng)及補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞溶解反應(yīng)均具有抑制作用，且特異性識(shí)別該抗原表位的單克隆抗體被動(dòng)免疫動(dòng)物后導(dǎo)致有效的旋毛蟲減蟲率，從而具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。由此提供了下述發(fā)明:
[0007]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種抗原表位，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1 — 2中任一項(xiàng)所示。所述抗原表位在本發(fā)明中亦稱為旋毛蟲副肌球蛋白的補(bǔ)體功能相關(guān)抗原表位。
[0008]抗原表位(PlO)的氨基酸序列:14aa
[0009]VSMGKSLSSKVYVM (SEQ ID NO:1)
[0010]抗原表位(P8)的氨基酸序列:15aa
[0011]VSMGKSLSSKVYVME (SEQ ID NO:2)
[0012]所述抗原表位可以通過人工化學(xué)合成的方式得到，也可以通過將其編碼的核苷酸通過蛋白表達(dá)純化得到。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來(lái)制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以從細(xì)胞裂解物中回收。
[0013]本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明任一項(xiàng)所述抗原表位的核苷酸序列；具體地，所述核苷酸序列分別如SEQ ID NO:3 — 4中任一項(xiàng)所示。
[0014]抗原表位(PlO)的核苷酸序列:42bp
[0015]GTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATG (SEQ ID NO:3)
[0016]抗原表位(P8)的核苷酸序列:45bp
[0017]GTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAA (SEQ ID NO:4)
[0018]本發(fā)明的再一方面涉及一種多肽，其具有本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位；具體地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5 - 7中任一項(xiàng)所示。[0019]PmyC:571Asn-885Tyr,其氨基酸序列如下:315aa
[0020]NRANLEAQKTIKKQADQLRALQSSFEDCQRQLQQTLDQYAIAQRKLSALSAELEDCKSALDTAIRVRKQAEADLEEAQGKIADLVSLNNNLTAIKGKLETDLSTCQADLDETTKELRAADDRANRAQQDAVRAMEQLHEEQEHSMKIDAMRKALEEHVKQLQVQIQEAEAAALLGGKRVIAKLETRIRDLEMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTAERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGKSLSSKVYVMEEGHEY (SEQ ID NO:5)
[0021]PmyCC =761Glu-885Tyr，其氨基酸序列如下:125aa
[0022]EMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTAERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGKSLSSKVYVMEEGHEY (SEQ ID NO:6)
[0023]PmyCCC:831Leu_885Tyr,其氨基酸序列如下:55aa
[0024]LQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGKSLSSKVYVMEEGHEY (SEQ ID NO:7)
[0025]本發(fā)明的再一方面涉及編碼本發(fā)明任一項(xiàng)所述多肽的核苷酸序列；具體地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQID NO:10所示。[0026]PmyC的核苷酸序列如下:945bp
[0027]AACCGGGCCAATTTGGAAGCACAAAAGACGATCAAAAAACAAGCAGACCAACTGAGGGCTTTGCAAAGCAGCTTCGAAGATTGCCAACGTCAACTGCAACAAACGCTCGACCAGTATGCAATTGCCCAGCGCAAGTTGTCCGCTTTGTCGGCCGAATTGGAAGACTGCAAGAGTGCCTTGGACACGGCGATCCGGGTGCGCAAACAAGCCGAAGCGGATCTGGAAGAAGCCCAGGGGAAAATTGCCGATTTGGTCAGCTTGAACAACAATTTGACCGCGATCAAGGGCAAATTGGAGACCGACTTGTCGACATGCCAAGCCGATTTGGACGAGACGACCAAAGAACTGCGAGCCGCCGACGACCGTGCCAACCGAGCTCAGCAGGATGCGGTCCGGGCTATGGAACAACTCCACGAAGAGCAGGAACATTCGATGAAAATCGACGCCATGCGCAAAGCGTTGGAAGAGCACGTCAAACAGTTGCAAGTGCAAATCCAAGAAGCCGAAGCGGCAGCTCTGCTCGGTGGCAAGCGCGTCATTGCCAAACTCGAGACCAGGATTCGAGATTTGGAAATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGGACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCCCAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGCGGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT (SEQ ID NO:8)
[0028]PmyCC的核苷酸序列如下:375bp
[0029]GAAATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGGACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCCCAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGCGGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT(SEQ ID NO:9)
[0030]PmyCCC的核苷酸序列如下:165bp
[0031]TTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT (SEQ ID NO:10)
[0032]本發(fā)明的再一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為重組表達(dá)載體。
[0033]可以將本發(fā)明的任一項(xiàng)的核苷酸和調(diào)控序列連接在一起來(lái)制備重組表達(dá)載體，該載體可以包括I或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，以便在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核酸序列。或者，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體而表達(dá)本發(fā)明所述核酸序列。制備表達(dá)載體時(shí)，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作連接。
[0034]其中，術(shù)語(yǔ)“控制序列”定義為包括表達(dá)本發(fā)明的抗原表位所必需或有利的所有組分。每個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外來(lái)的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。為了導(dǎo)入特定的限制位點(diǎn)以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于相對(duì)DNA序列之編碼序列的適當(dāng)位置，以使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
[0035]重組表達(dá)載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作并表達(dá)核酸序列的載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
[0036]本發(fā)明的再一方面涉及一種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)所述的重組載體。
[0037]可將包含本發(fā)明之核酸序列的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于多肽編碼基因及其來(lái)源。
[0038]宿主 細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
[0039]本發(fā)明的再一方面涉及一種抗原表位偶聯(lián)物，包括抗原表位和偶聯(lián)部分，其中，所述抗原表位為本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯(lián)部分為載體蛋白BSA或KLH。
[0040]本發(fā)明的再一方面涉及一種組合物，其包含一種或多種本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位，和/或一種或多種本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽，和/或一種或多種本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位偶聯(lián)物；具體地，所述組合物為疫苗組合物。
[0041]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位偶聯(lián)物在制備治療和/或預(yù)防旋毛蟲感染的藥物中的用途。
[0042]實(shí)施例2的數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的抗原表位制得的單克隆抗體具有有效的旋毛蟲減蟲率，能夠有效地防治旋毛蟲感染或旋毛蟲感染所致疾病。本發(fā)明的抗原表位具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。
[0043]本發(fā)明的再一方面涉及一種抗體，其能夠特異性地結(jié)合本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多肽或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗原表位偶聯(lián)物。[0044]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”具有免疫學(xué)的一般含義，例如抗原抗體間的結(jié)合。
[0045]本發(fā)明的再一方面涉及一種抗體偶聯(lián)物，包括抗體部分和偶聯(lián)部分，其中，所述抗體部分為本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種。
[0046]本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)物；可選地，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。 [0047]本發(fā)明的再一方面涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)物。
[0048]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)物在制備治療和/或預(yù)防旋毛蟲感染的藥物中的用途。
[0049]本發(fā)明的再一方面涉及一種雜交瘤細(xì)胞株9G3，其分類命名為BALB/c小鼠雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.8767，保藏日期為2014年I月14日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。
[0050]本發(fā)明的再一方面涉及一種單克隆抗體，其由本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌。
[0051]發(fā)明的有益效果
[0052]本發(fā)明的單克隆抗體具有效的旋毛蟲減蟲率。本發(fā)明的抗原表位具有作為防治旋毛蟲感染或其所致疾病的藥物(例如疫苗)的潛力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0053]圖1:9個(gè)截短基因片段的氨基酸序列的示意圖。
[0054]圖2:ffestern blot實(shí)驗(yàn)分析9個(gè)Ts-Pmy重組截短片段與補(bǔ)體C9的結(jié)合。抗HisTag單抗識(shí)別Ts-Pmy重組截短片段。抗C9單抗識(shí)別可結(jié)合C9的重組截短片段。M，蛋白分子量。
[0055]圖2A, Ts-Pmy重組截短片段分別為PmyN、PmyM> PmyC ；
[0056]圖2B，Ts-Pmy 重組截短片段分別為 PmyCN、PmyCM, PmyCC ；
[0057]圖2C，Ts-Pmy 重組截短片段分別為 PmyCCN、PmyCCM, PmyCCC0
[0058]圖3:重疊多肽Pl — P12的示意圖。
[0059]圖4:Dot blot實(shí)驗(yàn)分析重疊多肽與補(bǔ)體C9的結(jié)合。黑點(diǎn)表示陽(yáng)性結(jié)果的實(shí)驗(yàn)組。
[0060]圖5 =SDS-PAGE電泳鑒定腹水純化后的單克隆抗體。其中:
[0061]泳道1:Marker ；
[0062]泳道2:純化前腹水；
[0063]泳道3:純化后腹水單抗。
[0064]圖6:單克隆抗體親和力常數(shù)曲線。
[0065]圖7:腹水單抗與不同發(fā)育階段蟲體抗原及rTs-Pmy蛋白的Western blot鑒定。其中:
[0066]1:成蟲；
[0067]2:肌幼蟲(ML);[0068]3:新生幼(NBL);
[0069]4:rTsPmy ；
[0070]5:BSA ；
[0071]6:非相關(guān)蛋白 Ts_Hsp70。
[0072]圖8:單抗9G3對(duì)Pmy與C9結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制的Western blot鑒定。其中:
[0073]1.pmy+9G3 (O μ g) +C9 ；
[0074]2.pmy+9G3 (2 μ g) +C9 ；
[0075]3.pmy+9G3 (4 μ g) +C9 ；
[0076]4.pmy+BSA+C9 ；
[0077]5.pmy+7E2 (10 μ g)+C9。
[0078]圖9:mAb9G3及自然感染血清抗旋毛蟲感染的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。LPG為每克肌肉的肌幼蟲數(shù)，以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。#表示與PBS空白對(duì)照組比較，p〈0.01。
[0079]關(guān)于生物材料保藏的說(shuō)明
[0080]本發(fā)明涉及以下生物材料:
[0081]BALB/c小鼠雜交瘤細(xì)胞株9G3，其于2014年I月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC.8767，保藏地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
【具體實(shí)施方式】
[0082]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0083]實(shí)施例1 =Ts-Pmy的補(bǔ)體C9抗原表位的制備和鑒定
[0084]1.旋毛蟲副肌球蛋白Ts-Pmy截短基因片段的擴(kuò)增
[0085](I)根據(jù)抗原即旋毛蟲副肌球蛋白基因(Ts-Pmy,GenBank N0.EF429310)開放讀碼框序列，設(shè)計(jì)截短基因片段。
[0086]抗原讀碼框的氨基酸序列如下:885aa
[0087]MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQWKSKFDAEVSLHQEEVDDLRKKMIQKQAEYEEQIEIMLQKISQLEKAKSRLQSEVEVLIVDLEKAQSTIAILERQKEQLERMVAEMKTRLDEVTQELEATQRELRATQAELQKMKHLYEKAVEQKEALARENKKLQDDLHEAKEALADANRKLHELDLENARLAGEIRELQIALKEAEAARRDAESRAQRAVAELQALRVEMERRLQEKEEEMEALRKNMQFEIDRLAAALADAEARMKAEISRLKKKYQAEIAELEMTIDNLNRANLEAQKTIKKQADQLRALQSSFEDCQRQLQQTLDQYAIAQRKLSALSAELEDCKSAL DTAIRVRKQAEADLEEAQGKIADLVSLNNNLTAIKGKLETDLSTCQADLDETTKELRAADDRANRAQQDAVRAMEQLHEEQEHSMKIDAMRKALEEHVKQLQVQIQEAEAAALLGGKRVIAKLETRIRDLEMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTAERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGKSLSSKVYVMEEGHEY (SEQ ID NO:11)
[0088]抗原的核苷酸序列:2655bp
[0089]ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAAGTTGACGATCTGCGTAAAAAAATGATCCAAAAACAAGCAGAATATGAGGAACAAATTGAAATTATGCTGCAAAAGATTTCCCAATTGGAAAAAGCGAAAAGCCGTCTGCAGTCGGAAGTTGAAGTTTTGATAGTTGATTTGGAAAAGGCTCAAAGCACCATTGCCATTTTGGAAAGACAAAAAGAACAGCTCGAAAGAATGGTCGCCGAGATGAAGACACGCCTGGACGAGGTGACACAAGAGCTCGAAGCTACGCAA CGAGAACTCAGAGCGACGCAAGCGGAATTGCAAAAGATGAAGCATCTTTATGAAAAAGCCGTCGAACAGAAAGAAGCTCTGGCTAGGGAGAACAAAAAATTGCAAGACGATTTGCATGAAGCAAAGGAAGCTTTGGCCGACGCGAACAGAAAATTGCACGAGCTGGATTTGGAGAATGCACGTCTGGCCGGTGAAATCAGAGAACTGCAAATCGCGCTCAAGGAAGCCGAAGCGGCTAGACGTGACGCGGAAAGTCGCGCACAGCGTGCAGTAGCTGAATTGCAAGCTCTGCGCGTGGAAATGGAACGTCGTTTACAAGAAAAAGAAGAAGAAATGGAAGCATTGCGCAAAAATATGCAGTTCGAAATTGACCGACTGGCTGCAGCGTTGGCTGACGCTGAGGCTCGCATGAAGGCGGAAATTTCCCGTCTGAAGAAGAAATACCAGGCGGAAATTGCCGAACTGGAAATGACCATCGACAATTTGAACCGGGCCAATTTGGAAGCACAAAAGACGATCAAAAAACAAGCAGACCAACTGAGGGCTTTGCAAAGCAGCTTCGAAGATTGCCAACGTCAACTGCAACAAACGCTCGACCAGTATGCAATTGCCCAGCGCAAGTTGTCCGCTTTGTCGGCCGAATTGGAAGACTGCAAGAGTGCCTTGGACACGGCGATCCGGGTGCGCAAACAAGCCGAAGCGGATCTGGAAGAAGCCCAGGGGAAAATTGCCGATTTGGTCAGCTTGAACAACAATTTGACCGCGATCAAGGGCAAATTGGAGACCGACTTGTCGACATGCCAAGCCGATTTGGACGAGACGACCAAAGAACTGCGAGCCGCCGACGACCGTGCCAACCGAGCTCAGCAGGATGCGGTCCGGGCTATGGAACAACTCCACGAAGAGCAGGAACATTCGATGAAAATCGACGCCATGCGCAAAGCGTTGGAAGAGCACGTCAAACAGTTGCAAGTGCAAATCCAAGAAGCCGAAGCGGCAGCTCTGCTCGGTGGCAAGCGCGTCATTGCCAAACTCGAGACCAGGATTCGAGATTTGGAAATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGGACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCCCAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGCGGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT (SEQ ID NO:12)
[0090]一共設(shè)計(jì)9個(gè)截短基因片段，分別命名為:[0091]PmyN, PmyM, PmyC, PmyCN, PmyCM, PmyC, PmyCCN, PmyCCM, PmyCCC。
[0092]上述9個(gè)截短基因片段的氨基酸序列的示意圖如圖1所示。
[0093]上述9個(gè)截短基因片段的氨基酸序列起止和長(zhǎng)度如下面的表1所示。
[0094]表1:9個(gè)截短基因片段的氨基酸序列起止和長(zhǎng)度
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I — 2中任一項(xiàng)所不。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗原表位的核苷酸序列；具體地,所述核苷酸序列分別如SEQID NO:3 - 4中任一項(xiàng)所示。
3.一種多肽，其具有權(quán)利要求1所述的抗原表位；具體地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5 - 7中任一項(xiàng)所示。
4.編碼權(quán)利要求3所述多肽的核苷酸序列；具體地，所述核苷酸序列如SEQID NO:8或 SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:10 所示。
5.—種重組載體,其含有權(quán)利要求2或4所述的核苷酸序列。
6.一種重組宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求5所述的重組載體。
7.—種抗原表位偶聯(lián)物，包括抗原表位和偶聯(lián)部分，其中，所述抗原表位為權(quán)利要求1所述的抗原表位，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯(lián)部分為載體蛋白BSA或KLH。
8.—種組合物,其包含一種或多種權(quán)利要求1所述的抗原表位，和/或一種或多種權(quán)利要求3所述的多肽，和/或一種或多種權(quán)利要求7所述的抗原表位偶聯(lián)物；具體地，所述組合物為疫苗組合物。
9.權(quán)利要求1所述的抗原表位或者權(quán)利要求3所述的多肽或者權(quán)利要求7所述的抗原表位偶聯(lián)物在制備治療和/或預(yù)防旋毛蟲感染的藥物中的用途。
10.一種抗體，其能夠特異性地結(jié)合權(quán)利要求1所述的抗原表位或者權(quán)利要求3所述的多肽或者權(quán)利要求7所述的抗原表位偶聯(lián)物。
11.一種抗體偶聯(lián)物，包括抗體`部分和偶聯(lián)部分，其中，所述抗體部分為權(quán)利要求10所述的抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、和生物素中的一種或多種。
12.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求10所述的抗體或者權(quán)利要求11所述的抗體偶聯(lián)物；可選地，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
13.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求10所述的抗體或者權(quán)利要求11所述的抗體偶聯(lián)物。
14.權(quán)利要求10所述的抗體或者權(quán)利要求11所述的抗體偶聯(lián)物在制備治療和/或預(yù)防旋毛蟲感染的藥物中的用途。
15.一種雜交瘤細(xì)胞株9G3，其保藏編號(hào)為CGMCC.8767，保藏日期為2014年I月14日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。
16.一種單克隆抗體，其由權(quán)利要求15所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103724402SQ201410023652
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】諸欣平, 楊靜, 趙夕, 郝瑜婉 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)