Irf3基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種IRF3基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用，屬于基因的功能與應用領(lǐng)域。本發(fā)明以ApoE-/-小鼠和IRF3-/-ApoE-/-小鼠為實驗對象，通過高脂誘導獲得動脈粥樣硬化模型，進行了AS模型小鼠斑塊面積測定和內(nèi)含物分析，結(jié)果表明與ApoE-/-小鼠對比，IRF3-/-ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積顯著減少。這提示一種IRF3基因在動脈粥樣硬化疾病中的功能，主要體現(xiàn)在其具有促使主動脈斑塊形成的作用，特別是IRF3基因能夠惡化動脈粥樣硬化。針對IRF3的上述功能，IRF3可作為藥物靶標篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物；IRF3的抑制劑可用于制備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
【專利說明】IRF3基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應用領(lǐng)域，涉及一種IRF3 (interferon regulatoryfactor 3)基因在動脈粥樣硬化中的功能及其抑制劑的應用。
【背景技術(shù)】
[0003]心腦血管疾病在許多發(fā)達國家中是主要致死性病因，在我國的發(fā)病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎是動脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動脈粥樣硬化可使動脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導致很多心腦血管事件發(fā)生。而動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動脈急性狹窄和閉塞是導致急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]動脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險因素及免疫機制共同參與的一種慢性炎癥性疾病，局部和全身的炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，固有免疫和適應性免疫共同參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化病變，病理上表現(xiàn)為大、中動脈多處斑塊形成，好發(fā)于血液分流、動脈彎曲及動脈分支等區(qū)域，其病變特征是血中脂質(zhì)在動脈內(nèi)膜沉積，弓丨起內(nèi)膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細胞外脂質(zhì)池形成的粥樣物質(zhì)。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細胞，其中以巨噬細胞和T細胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)和肥大細胞(mast cell)等,偶有B 淋巴細胞。
[0005]動脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質(zhì)條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細胞源性泡沫細胞構(gòu)成。血液循環(huán)中的單核細胞在動脈易損部位黏附到活性內(nèi)皮細胞，啟動了脂質(zhì)條紋的形成，黏附的單核細胞隨后受局部產(chǎn)生的化學趨附分子的吸引遷移到內(nèi)膜下，并進一步分化為巨噬細胞；大量膽固醇脂在巨噬細胞內(nèi)積聚，形成泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程。動脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果。目前已發(fā)現(xiàn)的動脈粥樣硬化危險性因素很多，但相關(guān)針對治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。越來越多的證據(jù)顯示免疫反應參與動脈粥樣硬化發(fā)展的各個環(huán)節(jié)，因此探索調(diào)控免疫細胞功能的基因?qū)刂苿用}粥樣硬化具有重要意義。
[0006]IRF3 是干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)家族中的一個成員。有研究表明IRF3與病毒感染時干擾素基因的表達密切相關(guān)，IRF3可表達在多種細胞中，主要存在于細胞漿中，在天然免疫中發(fā)揮重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種IRF3及其抑制劑在制備動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與IRF3/ApoE雙基因敲除(IRF3+AP0E+)小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)模型，進行了 AS模型小鼠斑塊面積測定和內(nèi)含物分析，結(jié)果表明與ApoE+小鼠對比，IRF3+AP0E+小鼠動脈粥樣硬化主動脈斑塊面積明顯低于同種飼料飼養(yǎng)的ApoE+小鼠。這提示IRF3基因敲除會抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生，說明IRF3基因能夠惡化動脈粥樣硬化的發(fā)生，為研究防治動脈粥樣硬化的新靶點和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎。
[0009]一種IRF3基因在動脈粥樣硬化中的功能，主要體現(xiàn)在IRF3基因具有惡化主動脈斑塊形成的作用，特別是IRF3具有惡化動脈粥樣硬化的作用。
[0010]針對IRF3的上述功能，本發(fā)明提供一種IRF3的應用，主要體現(xiàn)在IRF3作為藥物靶標在篩選抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
[0011]針對IRF3的上述功能，提供一種IRF3的應用，主要體現(xiàn)在IRF3作為藥物靶標在篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
[0012]針對IRF3的上述功能，本發(fā)明提供一種IRF3的抑制劑的應用，主要體現(xiàn)在IRF3的抑制劑在制備抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
[0013]一種抑制主動脈斑塊形成的藥物，包含IRF3的抑制劑。
[0014]針對IRF3的上述功能，本發(fā)明提供一種IRF3的抑制劑的應用，主要體現(xiàn)在IRF3的抑制劑在制備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
[0015]一種治療動脈粥樣硬化疾病的藥物，包含IRF3的抑制劑。
[0016]所述的IRF3的抑制劑優(yōu)選為IRF3基因的siRNA、IRF3基因的RNA干擾載體、IRF3的抗體及其他能夠抑制IRF3表達的抑制劑中的一種。
[0017]本發(fā)明的研究成果表明，IRF3+APOE+小鼠在高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化中，與ApoE+小鼠相比，主動脈斑塊面積明顯減少而膠原含量增多，說明IRF3基因在動脈粥樣硬化疾病模型中有著重要的惡化作用。
[0018]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
(I)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF3基因的新功能，即IRF3基因具有能夠惡化動脈粥樣硬化疾病的作用。
[0019](2)基于IRF3在惡化動脈粥樣硬化疾病中的作用，IRF3可為研制動脈粥樣硬化疾病的藥物提供靶標，IRF3的抑制劑可用于制備治療動脈粥樣硬化的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的主動脈樹結(jié)果圖；A為小鼠主動脈樹油紅O染色圖，B為主動脈樹斑塊面積統(tǒng)計柱狀圖。
[0021]圖2是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠主動脈竇結(jié)果圖；A為主動脈竇HE染色結(jié)果圖，B為主動脈竇斑塊面積統(tǒng)計柱狀圖，C為ApoE+和IRF3+APOE+小鼠體重統(tǒng)計柱狀圖(NS代表組間無差異)。
[0022]圖3是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的斑塊內(nèi)含物的分析結(jié)果圖；A是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的巨噬細胞(⑶68 )和平滑肌 細胞(SMA)標志物免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖(圖中m代表主動脈中膜，L代表主動脈管腔)，B是ApoE+和IRF3+APOE+小鼠的天狼星紅染色及結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖?！揪唧w實施方式】
[0023]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0024]實驗用動物及飼養(yǎng):
實驗動物種屬，性別，周齡及來源=ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與IRF3/ApoE雙基因敲除(IRF3+APOE+)小鼠，雄性，8周齡，體重19_25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE+小鼠，C57BL/6J 背景，購自 Jackson Laboratory，貨號 002052)。IRF3+ApoE+小鼠由 IRF3 基因敲除小鼠(IRF3基因敲除小鼠，C57BL/6J背景，購自RIKEN BRC公司，BRC編號:RBRC00858)和ApoE基因敲除小鼠雜交得到。
[0025]實驗動物飼料配方:高脂飼料(HFD，購自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質(zhì)15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%)。
[0026]動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件:所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學心血管病研究所SPF級動物房(許可證號=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進食。
[0027]實施例1小鼠動脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實驗動物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE+小鼠和IRF3+AP0E+小鼠，分別給予高脂飼料(Western Diets，HFD)飼養(yǎng)，ApoE+ HFD組，IRF3+ApoE+ HFD組共2個組別。
[0028]2.動脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導操作流程:
采用ApoE+小鼠和IRF3+AP0E+小鼠，建立AS模型，進行表型相關(guān)分析，明確IRF3基因?qū)用}粥樣硬化發(fā)病發(fā)揮重要作用。小鼠從8周齡開始喂養(yǎng)高脂飼料直至28周處死并收集樣本。
[0029]實施例2 AS模型小鼠斑塊面積測定 1.小鼠終末組織取材
小鼠喂養(yǎng)高脂飼料直至28周時，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定于取材板，用紗布濕潤小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩沖液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續(xù)推注10-15mL。灌流結(jié)束后，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置于顯微鏡下，分離主動脈弓周圍筋膜、脂肪組織，剪下頭臂干，放入裝有4%多聚甲醛的5mL EP管中，在升主動脈起始部剪下心臟，在胸主動脈中部剪斷，并在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動脈弓放入上述EP管中。
[0030]2.主動脈樹斑塊面積測定
主動脈樹置于4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理IOmin —油紅O染液染色60min — 60%異丙醇漂洗Imin X 3次至背景干凈一解剖鏡下去除殘余外壁脂肪一將染色好的動脈平鋪于黑色解剖蠟板上，染色后用數(shù)碼相機拍照，并使用IPP圖像分析軟件進行斑塊面積定 量測定。(油紅O原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅O染液(工作液)=V (油紅O原液)/V (H2O) =3/2)
主動脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動脈樹總面積*100%。
[0031]3.病理組織處理3.1石蠟標本
心臟標本在4%多聚甲醛中隔夜固定后拿出，將頭臂干、主動脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水沖洗30min后放入脫水機，30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75% 乙醇 15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100%乙醇15min — 二甲苯15min — 二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。頭臂干及主動脈弓脫水完成后，從脫水機拿出。頭臂干呈Y直立于石蠟中，主動脈弓平躺于石蠟中。
[0032]3.2主動脈組織切片
蠟塊固定于切片機頭上的夾座內(nèi)，調(diào)整到稍離開切片能夠切到的位置上，蠟塊組織切面與切片刀口要垂直平行，調(diào)整切片厚度(5微米)。切下的片子，右手用彎鑷子輕輕鉗牢石蠟切片，左手用干燥毛筆將切片從切片取下，放入盛溫水(約30°C )的玻璃皿內(nèi)，將切片攤于溫水面上，光亮的切面向下，待切片在恒溫水內(nèi)充分攤開展平后(大約不超過10秒鐘)，將載玻片垂直插入水中輕靠切片，并用鑷子將切片一邊撥于玻片上，并調(diào)整好切片的位置，隨即將玻片直立提起。用鉛筆在玻片一端的磨砂玻璃上寫上標本編號，將切片晾干過夜。
[0033]4、主動脈竇斑塊面積測定
蘇木素伊紅染色(HE染色):石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X3次一100%乙醇I分鐘一95%乙醇I分鐘一70%乙醇I分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標準)—甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水IOOmUl分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)—甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未干時封片(每拿出一張封一張，以切片無氣泡為原則)一顯微鏡拍照。直接用IPP圖像分析軟件圈主動脈竇斑塊面積(mm2)。
[0034]通過主動脈樹油紅O染色可大體評估動脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積大小。圖1是小鼠AS模型后油紅O染色結(jié)果圖，頭皮干和主動脈根部是動脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位。圖2是小鼠AS模型后HE染色結(jié)果圖，結(jié)果表明，與ApoE+小鼠相比，IRF3+APOE+小鼠主動脈樹內(nèi)斑塊面積明顯減少，IRF3+APOE+小鼠主動脈竇斑塊面積明顯減少，28周AS模型后ApoE+小鼠和IRF3+APOE+小鼠的體重則無明顯變化(圖2C)，表明IRF3基因的缺失可顯著降低動脈粥樣硬化斑塊的大小。
[0035]實施例3 AS模型小鼠斑塊內(nèi)含物的分析
1.巨噬細胞及平滑肌細胞表達測定 免疫熒光染色檢測巨噬細胞(⑶68)、平滑肌肌動蛋白(Smooth Muscle Actin，SMA)的表達。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec) , SMA (ab5694;1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG (Al 1077;Invitrogen, Carlsbad, CA) , Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG(Al1008; Invitrogen, Carlsbad, CA)。
[0036]主要步驟為:
I)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0037]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。[0038]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0039]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液于修復盒中，修復工作液的量必須能足夠浸沒整張切片，將修復盒放入已加入適量自來水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計時5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復盒；室溫放置20min自然冷卻后取出切片。
[0040]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0041]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino[0042]7)棄封閉液,滴加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復溫30min,棄去一抗，PBS 洗 IOminX 3 次。
[0043]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0044]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0045]10)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0046]熒光統(tǒng)計方法:SMA (%)=斑塊內(nèi)SMA陽性吸光度值/斑塊總面積*100% KD68 (%)=斑塊內(nèi)CD68陽性吸光度值/斑塊總面積*100%。
[0047]2.天狼星紅(PSR)染色
主要步驟為:55 V烘烤30min — 二甲苯2min，3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —流水沖洗IOmin —雙蒸水Imin —質(zhì)量分數(shù)0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上,濕盒中染色90min —去除殘液一0.01N鹽酸4s — 70%酒精I次一90%酒精I次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片,顯微鏡拍照。
[0048]統(tǒng)計方法:膠原(％)=斑塊內(nèi)膠原陽性總面積/斑塊總面積*100%。
[0049]平滑肌細胞可分泌多種細胞基質(zhì)，是動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)分泌膠原的細胞源，主要作用是修復被破壞的細胞基質(zhì)成分從而起到保護作用；巨噬細胞是斑塊內(nèi)最重要的細胞成分，它主要有血液循環(huán)單核細胞進入內(nèi)皮下后分化而來，單核/巨噬細胞可分泌多種粘附、趨化因子如細胞黏附分子(ICAM-1)、單核細胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進斑塊內(nèi)細胞的進入，此外巨噬細胞還可分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內(nèi)膠原面積，從而破壞斑塊的穩(wěn)定性；膠原成分是斑塊內(nèi)最重要的細胞外基質(zhì)，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流沖擊防止斑塊破裂的作用，也是維護斑塊穩(wěn)定性的重要評估指標。
[0050]圖3是ApoE+和IRF3+AP0E+小鼠的斑塊內(nèi)含物的分析結(jié)果圖。為檢測斑塊內(nèi)巨噬細胞和平滑肌細胞的表達情況，將主動脈竇切片分別進行CD68 (巨噬細胞標志)和SMA (平滑肌細胞標志)等免疫熒光染色分析巨噬細胞與平滑肌細胞成分。免疫熒光發(fā)觀察SMA, CD68在ApoE+小鼠和IRF3+ApoE+小鼠斑塊內(nèi)均有表達，SMA在IRF3+ApoE+小鼠斑塊內(nèi)表達量明顯高于ApoE+小鼠<D68在IRF3+AP0E+小鼠斑塊內(nèi)表達量則顯著低于ApoE+小鼠(A) ；PSR染色結(jié)果表明高脂飲食后的模型，IRF3+AP0E+組小鼠的膠原比例明顯高于ApoE+小鼠，說明IRF3+AP0E+組小鼠的斑塊更穩(wěn)定(B)。結(jié)果表明IRF3基因敲除在AS模型中可降低斑塊內(nèi)面積，促進斑塊的穩(wěn)定性。[0051]上述實施例結(jié)果顯示，ApoE+小鼠及IRF3+APOE+小鼠在高脂飲食的誘導下發(fā)生動脈粥樣硬化，IRF3/ApoE雙基因敲除后，小鼠主動脈斑塊面積較ApoE+小顯著減少。這些結(jié)果提示，IRF3基因可促進主動脈斑塊的形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明證明了IRF3基因在動脈粥樣硬化模型中有著重要的惡化作用，其可作為藥物靶標篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0052]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的 置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.1RF3作為藥物靶標在篩選抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
2.1RF3作為藥物靶標在篩選治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
3.1RF3的抑制劑在制備抑制主動脈斑塊形成的藥物中的應用。
4.一種抑制主動脈斑塊形成的藥物，其特征在于:包含IRF3的抑制劑。
5.1RF3的抑制劑在制備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物中的應用。
6.一種治療動脈粥樣硬化疾病的藥物，其特征在于:包含IRF3的抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的應用或權(quán)利要求4和6所述的藥物，其特征在于所述的IRF3的抑制劑為IRF3基因的siRNA、IRF3基因的RNA干擾載體或IRF3的抗體中的一種。
【文檔編號】A61K48/00GK103784971SQ201410031535
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】李紅良, 蔣曦, 蔣丁勝, 胡俊飛, 鄧克窮, 王丕曉 申請人:武漢大學