Sirt1抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及SIRT1抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，利用本發(fā)明的方法能夠抑制肝癌干細(xì)胞的增殖、分化和克隆形成，提高肝癌干細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性和降低肝癌干細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的耐藥性，同時(shí)還能增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌干細(xì)胞的損傷，從源頭上殺死腫瘤干細(xì)胞，為徹底根除腫瘤帶來新希望。
【專利說明】SIRT1抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌是排名世界第五位的惡性腫瘤，主要分布亞洲和東南亞國(guó)家，發(fā)病率和死亡率居高不下，手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)療法難以徹底根除，對(duì)肝癌的治療缺乏有效的藥物，究其原因是藥物容易產(chǎn)生內(nèi)在的耐藥性。
[0003]肝癌的發(fā)病機(jī)制具有復(fù)雜性的，其癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展以及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路以及生長(zhǎng)因子等是密切相關(guān)的，其中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中由于存在著多個(gè)關(guān)鍵性基因或是信號(hào)分子，如Ras/Raf/MAPK，PI3K/AKT/mT0R，WNT/β -catenin, Hedgehog 等信號(hào)通路[58’59]。其中，Ras/Raf/MAPK, PI3K/AKT/mT0R 信號(hào)通路在肝癌的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)著重要角色。Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路既能在肝癌中激活上游的生長(zhǎng)因子也能活化腫瘤抑制基因，而PI3K/AKT/mT0R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝癌中也起著重要作用，能夠增殖和激活30-50%的肝癌細(xì)胞te°]。小分子靶向藥物多美吉，又稱索拉菲尼(sorafenib)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，是一種口服的多靶點(diǎn)多激酶抑制劑，可以靶向作用于腫瘤細(xì)胞的絲氨酸/蘇氨酸激酶及受體酪氨酸激酶及腫瘤血管上的生長(zhǎng)因子。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，索拉非尼能夠延緩肝癌的進(jìn)展并且能夠延長(zhǎng)晚期患者生存期。目前，索拉非尼除了在肝癌患者的治療外，還在乳腺癌、胃癌病人中使用。但是癌癥患者在使用索拉非尼時(shí)容易產(chǎn)生賴藥性，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中含有微量的腫瘤干細(xì)胞，這類細(xì)胞對(duì)常規(guī)放療、化療具有耐受、不敏感等特點(diǎn)，是腫瘤賴藥性、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。因此，急需研究開發(fā)出能夠?qū)δ[瘤干細(xì)胞的靶向藥物，從源頭殺死腫瘤干細(xì)胞，將為徹底根除腫瘤帶來新希望。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，通過抑制腫瘤干細(xì)胞增殖、分化，并從源頭上殺死腫瘤干細(xì)胞，最終獲得達(dá)到治療肝癌的目的。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
[0007]優(yōu)選的，SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備抑制肝癌干細(xì)胞自我更新的藥物中的應(yīng)用。
[0008]更優(yōu)選的，所述肝癌干細(xì)胞自我更新為肝癌干細(xì)胞的增殖、分化和克隆形成。
[0009]優(yōu)選的，所述SIRTl抑制劑為Tenovin-6或干擾SIRTl表達(dá)的慢病毒，也可以為其他的SIRTl抑制劑。
[0010]優(yōu)選的，所述干擾SIRTl表達(dá)的慢病毒含有Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒。[0011]更優(yōu)選的，所述干擾SIRTl表達(dá)的慢病毒由Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒由Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后經(jīng)包裝、純化而得。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了 SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，利用SIRTl抑制劑干擾或抑制SIRTl表達(dá)抑制肝癌干細(xì)胞的增殖、分化和克隆形成，同時(shí)提高肝癌干細(xì)胞對(duì)索拉菲尼敏感性和增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌干細(xì)胞的損傷，利用本發(fā)明的方法還能降低肝癌干細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的耐藥性，殺死肝癌干細(xì)胞，從源頭上殺死腫瘤干細(xì)胞，為徹底根除腫瘤帶來新希望。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0014]圖1為臨床肝組織樣本中檢測(cè)SIRTl的表達(dá)(A:免疫組化檢測(cè)SIRTl在肝癌腫瘤組織及癌旁組織的表達(dá)定位=SIRTl在肝癌腫瘤組織及癌旁組織表達(dá)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C:Kaplan-Meier方法分析SIRTl的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系)。
[0015]圖2為肝癌干細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的耐藥性(A:肝癌干細(xì)胞中干擾SIRTl的表達(dá)后，檢測(cè)索拉菲尼處理對(duì)細(xì)胞克隆形成力的影響肝癌干細(xì)胞中抑制SIRTl的表達(dá)后，檢測(cè)索拉菲尼處理對(duì)細(xì)胞克隆形成力的影響；C:免疫熒光檢測(cè)干擾SIRTl表達(dá)后，檢測(cè)索拉菲尼處理對(duì)細(xì)胞損傷的影響)。
[0016]圖3為肝癌干細(xì)胞中抑制SIRTl的表達(dá)聯(lián)合索拉菲尼處理對(duì)細(xì)胞其耐藥性的影響。
[0017]圖4為肝癌干細(xì)胞中干擾SIRTl的表達(dá)聯(lián)合索拉菲尼處理移植瘤對(duì)移植瘤重量或體積的影響。
[0018]圖5為肝癌干細(xì)胞中干擾SIRTl的表達(dá)聯(lián)合索拉菲尼處理對(duì)移植瘤形態(tài)和移植瘤損傷的影響。
[0019]圖6為肝癌患者聯(lián)合索拉菲尼治療的組織標(biāo)本檢測(cè)SIRTl的表達(dá)(A: Kaplan-Meier方法分析肝癌患者術(shù)后SIRTl表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系；B: Kap I an-Meier方法分析肝癌患者聯(lián)合索拉非尼治療后SIRTl表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021]本發(fā)明使用的肝癌干細(xì)胞模型肝癌干細(xì)胞T1224由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，該模型含有Nanog啟動(dòng)子調(diào)控GFP報(bào)告基因構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體(Nanog/GFP報(bào)告系統(tǒng))，其構(gòu)建方法參見 Shan et al.2012, hepatology, 56:1014-1014 ；Lv-sh-Scramble 質(zhì)粒和 Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其構(gòu)建過程具體見Shan et al.2012, hepatology, 56:1014-1014 ；HEK293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0022]本發(fā)明使用的Envision?和DAB顯色液購(gòu)自丹麥DAKO公司；EDTA(pH8)抗原修復(fù)液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。索拉菲尼(sorafenib)片劑購(gòu)自德國(guó)Bayer Scheringpharma AG公司；TV_6 (Tenovin6)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；鼠抗人Y-H2AX抗體購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司。
[0023]一、SIRTl的表達(dá)對(duì)肝癌患者臨床病理學(xué)特征以及病人預(yù)后的影響
[0024]已有的研究表明，SIRTl可通過調(diào)節(jié)p53的活性發(fā)揮“癌基因”作用，又可通過抑制一些腫瘤癌基因的表達(dá)發(fā)揮“抑癌基因”的功能，SIRTl到底是“癌基因”亦或是“抑癌基因”，一直是研究的熱點(diǎn)。因此，本發(fā)明通過收集第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院2000年I月至2005年12月手術(shù)切除的肝細(xì)胞肝癌石蠟標(biāo)本癌組織以及相配對(duì)的肝癌癌旁組織各148例，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪5-10年，所有標(biāo)本經(jīng)西南醫(yī)院肝膽外科手術(shù)后，所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4~5 μ m連續(xù)切片，然后利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SIRTl在148例肝癌患者的表達(dá)情況，再分析SIRTl表達(dá)情況與臨床預(yù)后、病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。免疫組織化學(xué)的具體方法為:將148例肝癌患者的癌組織和癌旁組織用組織芯片儀(孔徑0.6 μ m)采取癌組織及癌旁各兩個(gè)點(diǎn)，經(jīng)H&E染色后觀察，結(jié)果如圖1中A所示。
[0025]免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀=SIRTl染色陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核，呈深淺不等的棕、黃色顆粒。采用半定量計(jì)分方式對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，每張切片均在不同時(shí)間觀察3次，記平均值，計(jì)分由細(xì)胞染色百分比和染色強(qiáng)度分兩部分組成:
[0026]細(xì)胞染色百分比得分:〈5%細(xì)胞陽(yáng)性為O分，5%~25%細(xì)胞陽(yáng)性為I分，26%~50%細(xì)胞陽(yáng)性為2分，51%~75%細(xì)胞陽(yáng)性為3分，>75%細(xì)胞陽(yáng)性為4分；
[0027]細(xì)胞染色強(qiáng)度 計(jì)分:淡黃色為I分，棕黃色為2分，棕黑色為3分；
[0028]兩分相乘為總分:0~I分為陰性(-)，2~4分為弱陽(yáng)性(+ )，5~8分為中陽(yáng)性(++)，9~12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。
[0029]所有計(jì)算數(shù)據(jù)均以均值土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，采用SPSS16.0數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(兩組間均值比較)，P〈0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P〈0.01和P〈0.001為
統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著。
[0030]統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，SIRTl在67% (99/148)的癌組織中表達(dá)，而在癌旁中的陽(yáng)性率為31% (48/148)，并且SIRTl在癌組織與癌旁組織的表達(dá)陽(yáng)性率差異非常顯著(圖1中B) (ρ〈0.0001)，采用Kaplan-Meier方法分析SIRTl的表達(dá)與肝癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，如圖1中C所示，癌組織SIRTl表達(dá)陰性的患者生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于SIRTl表達(dá)陽(yáng)性的患者(ρ〈0.031)。通過分析SIRTl表達(dá)與臨床病理學(xué)相關(guān)性，結(jié)果見表1。
[0031]表1在肝癌患者SIRTl的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性
[0032]
【權(quán)利要求】
1.SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于=SIRTl抑制劑聯(lián)合索拉菲尼在制備抑制肝癌干細(xì)胞自我更新的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述肝癌干細(xì)胞自我更新為肝癌干細(xì)胞的增殖、分化和克隆形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于:所述SIRTl抑制劑為Tenovin-6或干擾SIRTl表達(dá)的慢病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述干擾SIRTl表達(dá)的慢病毒含有Lv-sh-SIRTl 質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述干擾SIRTl表達(dá)的慢病毒由Lv-sh-SIRTl質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染293T細(xì)胞后經(jīng)包裝、純化而得。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103751221SQ201410032646
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】錢程, 劉麗梅, 劉春剛, 沈俊杰, 單娟娟 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院