一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物、制備方法及應(yīng)用，所述磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物將熱敏脂質(zhì)體包裹Fe3O4磁性納米粒子和化療藥物后，再負(fù)載金納米粒制備而成；其中，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子和化療藥物的質(zhì)量比為1.7-2.3:1，所述化療藥物為鹽酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、柔紅霉素中的一種。本發(fā)明的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物可以作為用于治療腫瘤的良好的熱敏劑和磁共振成像造影劑，還可以作為抗腫瘤藥物的具有磁靶向性的轉(zhuǎn)運載體，是癌癥治療上的一大創(chuàng)新。
【專利說明】—種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物、制備方法及應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]隨著納米技術(shù)、生物工程技術(shù)的不斷進步，非病毒載體的研究也發(fā)展到了一個新的階段。目前，藥物/核酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)己經(jīng)發(fā)展到靶向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。該系統(tǒng)將能攜帶效應(yīng)分子，主動或被動地轉(zhuǎn)運到機體的靶部位發(fā)揮治療作用，而對其它部位的毒副作用很低。國內(nèi)外的研究顯示，在磁性納米粒子表面包附一層生物大分子(如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)體，多糖等)，能夠得到良好的生物相容性和生物安全性。而且這種磁性脂質(zhì)體具有磁響應(yīng)性，在外加梯度磁場作用下能夠趨向運動，可以作為攜帶藥物或核酸分子的載體骨架進行腫瘤的磁控靶向治療。而且其良好的親水性使其可以制備成親水凝膠狀的納米顆粒。這種天然的親水表面能減弱機體內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，延長其在血液中的循環(huán)時間，因此很適合用于生物大分子類藥物的傳遞。
[0003]磁性納米粒子(magnetic nanoparticles,MNP)是一類智能型的納米磁性材料，既具有納米材料所特有的性質(zhì)，又具有磁響應(yīng)性和超順磁性，可以在恒定磁場下聚集和定位到靶部位，或在交變磁場下吸收電磁波產(chǎn)熱。常用的磁性物質(zhì)有:鐵氧化物，如Fe304、Fe2O3等；單體，如Fe、Co、Ni等；合金,如鐵鎳合金、鐵鍋合金等；混合磁性材料等。目前是鐵及其氧化物(Fe，F(xiàn)e3O4, Y-Fe2O3)被研究的最多，其中粒徑在I~IOOnm內(nèi)的Fe3O4粒子以其生物安全性高、磁響應(yīng)性高而被應(yīng)用的最為廣泛，當(dāng)磁性微粒的粒徑足夠小時，具有超順磁性，即在外加磁場中有較強的磁性，撤離磁場時磁性很快消失，剩磁為零，不會被永久磁化。因此，四氧化三鐵磁性微粒成為目前生物磁性材料領(lǐng)域的一個研究熱點。
[0004]磁共振成像(MRI)是一種頗具潛力的診斷方法。它是以人體在核磁共振過程中所散發(fā)的電磁波以及與這些電磁波有關(guān)的參數(shù)，如質(zhì)子密度、弛豫時間等作為成像參數(shù)進行成像。磁共振成像造影 劑一定是磁性物質(zhì)，其能同氫核發(fā)生磁性的相互作用，主要通過影響自旋晶格弛豫時間Tl、自旋-自旋弛豫時間T2等來改變信號強度，進而提高MRI診斷的敏感性和特異性，增強信號對比度和提高軟組織圖像的分辨率，在早期腫瘤的診斷中具有很大的價值。磁性熱敏脂質(zhì)體可作為磁共振成像造影劑，利用其磁性和水溶性，進入體內(nèi)后能選擇性分布，在靶器官富集并停留一段時間，使被觀測的組織或器官的弛豫速率比其他部位(背景部位)有更大的改變，提高MRI診斷的敏感性和特異性，增強MRI的效果。
[0005]熱療是一種治療癌癥的有效的方法，傳統(tǒng)的加熱方法包括導(dǎo)管引入、全身加熱等。研究者發(fā)現(xiàn)適當(dāng)調(diào)整納米金的大小和形貌可使其吸收峰調(diào)整在近紅外區(qū)，經(jīng)近紅外(NIR)激光照射后，納米金能將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，使局域范圍內(nèi)的溫度升高，殺死腫瘤細(xì)胞又不損傷正常細(xì)胞以達到治療目的。腫瘤的納米金紅外熱療比化療和放療副反應(yīng)少得多，不損傷正常組織，是近年來公認(rèn)的“綠色療法”，是一種新的腫瘤熱療技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。另一方面，納米金也可用于紅外斷層成像，可應(yīng)用在疾病的診斷和監(jiān)測中。這種成像技術(shù)可利用散射的光形成圖像。[0006]脂質(zhì)體作為藥物載體具有獨特的優(yōu)勢。脂質(zhì)體的粒子大小處于納米級的范圍，具有無毒、無免疫原性、可降解、緩釋等特點。磁性熱敏脂質(zhì)體是磁導(dǎo)向藥物傳遞系統(tǒng)中一種新型的藥物導(dǎo)向載體，可通過外磁場對腫瘤實施引導(dǎo)定位治療，在靶區(qū)產(chǎn)生持續(xù)高濃度藥物，增強對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，而在非腫瘤部位分布很少，可降低毒副作用。國內(nèi)外學(xué)者就生物磁學(xué)用于惡性腫瘤的治療進行了初步研究，認(rèn)為恒定磁場具有抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的作用，磁性微粒在足夠強的外磁場作用下，可以引導(dǎo)負(fù)載藥物在體內(nèi)定向移動、定位濃集，從而達到提高藥物治療指數(shù)，降低藥物毒副作用的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物、制備方法及應(yīng)用，該復(fù)合物能夠作為良好的抗腫瘤藥物載體、熱敏劑和核磁共振成像造影劑。
[0008]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物，所述復(fù)合物是將熱敏脂質(zhì)體包裹Fe3O4磁性納米粒子和化療藥物后，再負(fù)載金納米粒制備而成；其中，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子和化療藥物的質(zhì)量比為1.7-2.3:1，所述化療藥物為鹽酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、順鉬、卡鉬、柔紅霉素中的一種。
[0009]本發(fā)明解決的技術(shù)方案還在于，一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0010](1)將 2.30-2.40g FeCl3.6H20 和 0.80-0.90g FeCl2.4H20 溶于超純水中，調(diào)節(jié)pH值至9-10，然后加熱至70-85°C并通入氮氣保護，反應(yīng)25_35min后，加入0.4-0.6g/mL改性溶液1.5-3mL，升溫至88-95°C并繼續(xù)反應(yīng)80-100min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥3-5h，得到Fe3O4磁性納米粒子；調(diào)節(jié)pH值的試劑為氨水、氫氧化鈉中的一種或兩種；改性溶液為檸檬酸溶液、檸檬酸鈉溶液、聚乙二醇2000溶液中的一種，或兩種、三種的混合溶液；
[0011](2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿65-75mg、膽固醇8_12mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.8-1.2mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為1.5-2.5:1的有機溶劑中，得到有機溶液；
[0012](3)將8.5-11.5mg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入化療藥物5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體；
[0013](4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為80_120mM的氯金酸20-28 μ L，渦旋均勻，然后加入還原溶液30-40 μ L，渦旋4_6min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析22-26h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物；還原溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%的甲醛溶液、濃度400-600mM的抗壞血酸溶液或鹽酸羥胺溶液。
[0014]本發(fā)明解決的技術(shù)方案還在于，一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在作為抗腫瘤藥物載體方面的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明解決的技術(shù)方案還在于，一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在作為抗腫瘤光動力治療的熱敏劑方面的應(yīng)用，具體為:[0016]將磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物溶溶液靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，給藥后3h后用光源光照，光照時間為l_5min。光源為:780_1100nm波長的寬波長光源或者激光中的一種，優(yōu)選808nm激光。
[0017]本發(fā)明解決的技術(shù)方案還在于，一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在作為抗腫瘤治療中的磁共振成像造影劑方面的應(yīng)用，具體為:
[0018]將磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物溶液靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，注射后24h后對荷瘤小鼠進行T2WI磁共振成像。核磁共振成像掃描參數(shù)為:橫斷位SE-T2W1、TR1000-5000ms、TElOO-llOms、F0V10-8000mm、層厚 0.8_3mm、層間距 0.2_lmm、矩陣256X256。
[0019]本發(fā)明針對的腫瘤為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顏內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤。
[0020]本發(fā)明的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在應(yīng)用時可以制成任意的藥物制劑劑型，比如:注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下突出的有益技術(shù)效果:
[0022](I)本發(fā)明提供的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物可以作為一種良好的藥物載體，具有良好的磁靶向性，可以靶向定位于作用對象，本身有著極小的毒性，較強的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高等優(yōu)點。測試結(jié)果表明，本發(fā)明提供的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物作為藥物的載體時，粒徑均勻，能夠起到一定的緩釋作用，而且還能夠更多的到達腫瘤組織中起到靶向的作用，結(jié)合光照和外加磁場還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。
[0023](2)本發(fā)明提供的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物可以作為抗腫瘤熱敏治療的一種良好的熱敏劑，測試表明無論是體外還是體內(nèi)在光照的情況下都可以很好的抑制腫瘤細(xì)胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，在體內(nèi)合并外加磁場時更加顯著地抑制腫瘤細(xì)胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，而在不光照的情況下本發(fā)明提供的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物對正常細(xì)胞以及組織毒副作用很小。
[0024](3)本發(fā)明提供的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物可以作為一種良好的磁共振成像造影劑，進入體內(nèi)后能選擇性分布，在靶器官富集并停留一段時間，使被觀測的組織或器官的弛豫速率比其他部位(背景部位)有更大的改變，提高MRI診斷的敏感性和特異性，增強MRI的效果。測試結(jié)果表明，該復(fù)合物具有良好的負(fù)性增強效果，對腫瘤顯影的效果良好，并且還可以結(jié)合體內(nèi)熱療，利用MRI對腫瘤治療效果進行監(jiān)測。
【具體實施方式】
[0025]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。[0026]實施例1
[0027]本實施例的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0028](I)將2.35g FeCl3.6H20和0.86g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至9，然后加熱至80°C并通入氮氣保護，反應(yīng)30min后，加入0.5g/mL檸檬酸溶液2mL，升溫至90°C并繼續(xù)反應(yīng)90min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥4h,得到Fe3O4磁性納米粒子；
[0029](2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿70mg、膽固醇IOmg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2:1的有機溶劑中，得到有機溶液；
[0030](3)將IOmg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入鹽酸阿霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體；
[0031](4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為IOOmM的氯金酸24 μ L，渦旋均勻，然后加入濃度為500mM的抗壞血酸36 μ L，渦旋5min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析24h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
[0032]實施例2 [0033]本實施例的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0034](I)將2.30g FeCl3.6H20和0.80g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至10，然后加熱至70°C并通入氮氣保護，反應(yīng)25min后，加入0.6g/mL檸檬酸鈉溶液1.5mL，升溫至95°C并繼續(xù)反應(yīng)IOOmin，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥3h，得到Fe3O4磁性納米粒子；
[0035](2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿65mg、膽固醇8mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.8mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2.5:1的有機溶劑中，得到有機溶液；
[0036](3)將8.5mg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入米托蒽醌5mg溶解,形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體；
[0037](4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為120mM的氯金酸20 μ L，渦旋均勻，然后加入濃度為400mM的抗壞血酸36 μ L，渦旋4min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析26h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
[0038]實施例3
[0039]本實施例的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0040](I)將2.40g FeCl3.6H20和0.90g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至9，然后加熱至85°C并通入氮氣保護，反應(yīng)35min后，加入0.4g/mL聚乙二醇2000溶液3mL，升溫至88°C并繼續(xù)反應(yīng)80min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥5h,得到Fe3O4磁性納米粒子；
[0041](2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿75mg、膽固醇12mg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20001.2mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為1.5:1的有機溶劑中，得到有機溶液；
[0042](3)將11.5mg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入柔紅霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體；
[0043](4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為80mM的氯金酸28 μ L，渦旋均勻，然后加入濃度為600mM的抗壞血酸40 μ L，渦旋6min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析22h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
[0044]實施例4
[0045]本實施例的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0046](1)將2.35g FeCl3.6H20和0.86g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至9，然后加熱至80°C并通入氮氣保護，反應(yīng)30min后，加入0.2g/mL檸檬酸和0.3g/mL聚乙二醇2000的混合溶液2mL，升溫至90°C并繼續(xù)反應(yīng)90min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥4h，得到Fe3O4磁性納米粒子；
[0047](2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿70mg、膽固醇IOmg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2:1的有機溶劑中，得到有機溶液；
[0048](3)將IOmg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入順鉬5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體；
[0049](4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為IOOmM的氯金酸24 μ L，渦旋均勻，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%的甲醛溶液30 μ L，渦旋5min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析24h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
[0050]實施例5
[0051]本實施例的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0052](1)將2.35g FeCl3.6H20和0.86g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9，然后加熱至80°C并通入氮氣保護，反應(yīng)30min后，加入0.5g/mL檸檬酸溶液2mL，升溫至90°C并繼續(xù)反應(yīng)90min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥4h，得到Fe3O4磁性納米粒子；
[0053](2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿70mg、膽固醇IOmg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2:1的有機溶劑中，得到有機溶液；
[0054](3)將IOmg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入卡鉬5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體；
[0055](4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為IOOmM的氯金酸24 μ L，渦旋均勻，然后加入濃度為500mM的鹽酸羥胺30 μ L，渦旋5min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析24h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
[0056]實驗例1、磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的粒子大小和表面帶電量的確定[0057]對磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的粒子大小和表面帶電量的確定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設(shè)置為1.590，吸收系數(shù)設(shè)置為0.010，溫度設(shè)置為25°C，測量模式設(shè)置為自動，以Z平均統(tǒng)計值作為測定結(jié)果。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結(jié)果。介電常數(shù)設(shè)置為79，黏度系數(shù)設(shè)置為0.8872，溫度設(shè)置為25°C，測量模式設(shè)置為自動。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結(jié)果，所得結(jié)果為粒徑為100~200nm，電位為-26mV。因此可以證明，本發(fā)明的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的顆粒穩(wěn)定性高，容易分布至腫瘤部位；電位為負(fù)點，更容易在表面包裹金納米粒。
[0058]實驗例2、磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的細(xì)胞攝取率
[0059]將PC-3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC-3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS)10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5%C02,每2~3天傳代一次。收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按2X IO5個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，置于37°C，5%C02，完全濕度條件下培養(yǎng)24h，棄去孔中原培養(yǎng)基，用PBS洗3次。將伴隨磁場和NIR熱療的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物作為實驗組，將單純的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物為對照組，設(shè)置復(fù)孔為6個，鹽酸阿霉素濃度為8 μ g/mL。實驗組放置在808nm近紅外光2W中2min，光照結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中磁場作用下孵育4h。對照組則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。在培養(yǎng)結(jié)束后棄去孔中舊培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每孔用ImL胰酶消化后棄去胰酶，加入3mL全培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液；1000rpm離心IOmin收集細(xì)胞，用PBS洗滌，最后以ImL PBS重懸細(xì)胞。放入流式細(xì)胞儀檢測各組載體系統(tǒng)的攝取率，結(jié)果見表1。
[0060]表1磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在不同條件下的攝取率
[0061]`
【權(quán)利要求】
1.一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物是將熱敏脂質(zhì)體包裹Fe3O4磁性納米粒子和化療藥物后，再負(fù)載金納米粒制備而成；其中，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子和化療藥物的質(zhì)量比為1.7-2.3:1，所述化療藥物為鹽酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、順鉬、卡鉬、柔紅霉素中的一種。
2.一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)將2.30-2.40g FeCl3.6H20 和 0.80-0.90g FeCl2.4H20 溶于超純水中，調(diào)節(jié) pH 值至9-10，然后加熱至70-85°C并通入氮氣保護，反應(yīng)25-35min后，加入0.4-0.6g/mL改性溶液1.5-3mL，升溫至88-95°C并繼續(xù)反應(yīng)80-100min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥3-5h，得到Fe3O4磁性納米粒子；調(diào)節(jié)pH值的試劑為氨水、氫氧化鈉中的一種或兩種；改性溶液為檸檬酸溶液、檸檬酸鈉溶液、聚乙二醇2000溶液中的一種，或兩種、三種的混合溶液； (2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿65-75mg、膽固醇8_12mg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20000.8-1.2mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為1.5-2.5:1的有機溶劑中，得到有機溶液； (3)將8.5-11.5mg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入化療藥物5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體； (4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為80-120mM的氯金酸20-28 μ L，渦旋均勻，然后加入還原溶液30-40 μ L，渦旋4_6min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析22-26h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物；還原溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%的甲醛溶液、濃度400-600mM的抗壞血酸溶液或鹽酸羥胺溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將2.35g FeCl3WH2O和0.86g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至9,然后加熱至80°C并通入氮氣保護，反應(yīng)30min后,加入0.5g/mL檸檬酸溶液2mL,升溫至900C并繼續(xù)反應(yīng)90min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥4h，得到Fe3O4磁性納米粒子； (2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿70mg、膽固醇IOmg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2:1的有機溶劑中，得到有機溶液； (3)將IOmgFe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入鹽酸阿霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體； (4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為IOOmM的氯金酸24μL，渦旋均勻，然后加入濃度為500mM的抗壞血酸36 μ L，渦旋5min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析24h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)將2.30g FeCl3*6H20和0.80g FeCl2.4Η20溶于超純水中，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至10，然后加熱至700C并通入氮氣保護，反應(yīng)25min后，加入0.6g/mL檸檬酸鈉溶液1.5mL，升溫至95°C并繼續(xù)反應(yīng)IOOmin，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥3h,得到Fe3O4磁性納米粒子； (2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿65mg、膽固醇Smg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20000.8mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2.5:1的有機溶劑中，得到有機溶液； (3)將8.5mg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入米托蒽醌5mg溶解,形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體； (4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為120mM的氯金酸20μ L，渦旋均勻，然后加入濃度為400mM的抗壞血酸36 μ L，渦旋4min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析26h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將2.40gFeCl3.6H20和0.90g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至.9，然后加熱至85°C并通入氮氣保護， 反應(yīng)35min后，加入0.4g/mL聚乙二醇2000溶液3mL，升溫至88°C并繼續(xù)反應(yīng)80min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥5h,得到Fe3O4磁性納米粒子； (2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿75mg、膽固醇12mg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20001.2mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為1.5:1的有機溶劑中，得到有機溶液； (3)將11.5mg Fe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入柔紅霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體； (4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為80mM的氯金酸28μ L，渦旋均勻，然后加入濃度為600mM的抗壞血酸40 μ L，渦旋6min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析22h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將2.35g FeCl3WH2O和0.86g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水調(diào)節(jié)pH值至.9,然后加熱至80°C并通入氮氣保護，反應(yīng)30min后,加入0.2g/mL檸檬酸和0.3g/mL聚乙二醇2000的混合溶液2mL，升溫至90°C并繼續(xù)反應(yīng)90min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥4h，得到Fe3O4磁性納米粒子； (2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿70mg、膽固醇IOmg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2:1的有機溶劑中，得到有機溶液； (3)將IOmgFe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入順鉬5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體； (4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為IOOmM的氯金酸24μ L，渦旋均勻，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%的甲醛溶液30 μ L，渦旋5min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析24h，得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將2.35gFeCl3.6H20和0.86g FeCl2.4H20溶于超純水中，加入氨水和氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至9，然后加熱至80°C并通入氮氣保護，反應(yīng)30min后，加入0.5g/mL檸檬酸溶液2mL，升溫至90°C并繼續(xù)反應(yīng)90min，進行磁鐵分離，再用超純水和丙酮洗滌產(chǎn)物，真空冷凍干燥4h,得到Fe3O4磁性納米粒子； (2)分別稱量二棕櫚酰磷脂酰膽堿70mg、膽固醇IOmg和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的體積比為2:1的有機溶劑中，得到有機溶液； (3)將IOmgFe3O4磁性納米粒子置于PBS溶液中，并加入卡鉬5mg溶解，形成磁性混合液，超聲分散均勻，并加入至有機溶液中，充分振蕩，然后在真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到水性混懸液；將水性混懸液離心棄去沉淀，并將所得混懸液置于磁鐵上除去上清液，得到化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體； (4)取步驟(3)化療藥物的磁性熱敏脂質(zhì)體2mL，加入濃度為IOOmM的氯金酸24μL，渦旋均勻，然后加入濃度為500mM的鹽酸羥胺30 μ L，渦旋5min，在磁性熱敏脂質(zhì)體表面負(fù)載金納米粒，并透析24h， 得到磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物。
8.—種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在作為抗腫瘤藥物載體方面的應(yīng)用。
9.一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在作為抗腫瘤光動力治療的熱敏劑方面的應(yīng)用。
10.一種磁性熱敏脂質(zhì)體納米金復(fù)合物在作為抗腫瘤治療中的磁共振成像造影劑方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K41/00GK103768600SQ201410036393
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月25日
【發(fā)明者】王蕾, 李愛榮, 劉瑞瑗, 史進進, 張潘潘, 郝永偉, 張振中 申請人:鄭州大學(xué)