促進蝸牛黏液分泌的方法及其萃取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種促進蝸牛黏液分泌的方法及其黏液的萃取方法，包含提供活體蝸牛，并在一預設時間內(nèi)以具有預設電壓的金屬裝置接觸該活體蝸牛的腹足。
【專利說明】促進蝸牛黏液分泌的方法及其萃取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種促進腹足綱的陸生生物體黏液分泌的方法及其萃取方法，且特別涉及一種促進蝸牛黏液分泌的方法及其萃取方法。
【背景技術】
[0002]皮膚老化的過程是自然生物的演化。然而，環(huán)境的影響及基因的改變可能加速此過程。舉例來說，暴露于UV光增加氧化傷害被稱為光老化。經(jīng)由臨床證明，暴露在陽光下，光老化影響皺紋，干燥，毛細孔擴張，粗糙，并且失去皮膚的延展性及皮膚的色素改變。不僅如此，還會影響生成皮膚的良性或是惡性的腫瘤。皮膚老化也會伴隨一些病理的機制，如ROS的促進生成，皮膚再生的能力，細胞遷移的減少，貼附及存活率。
[0003]最近幾年有關天然物質(zhì)的研究增加可改進及刺激皮膚的再生。在這方面，有些蝸牛的分泌物對于燙傷皮膚及開放性的傷口具有再生的能力，特別是軟件動物被證明具有抗氧化活性并使急性放射性皮炎引起的損傷修復。
[0004]然而，天然的蝸牛黏液分泌量非常稀少，造成市場上添加蝸牛黏液相關的產(chǎn)品價格居高不下。因此，如何增加蝸牛黏液的分泌量長久以來是亟需解決的一重要課題。蝸牛天生較為脆弱，無法以較為劇烈的方式促進其黏液的分泌，因而增加蝸牛黏液萃取的難度。US Pat.N0.5538740揭露了以離心的方式針對活體蝸牛進行離心條件為2Xg相對離心場(relative centrif ugal field ;RCF), 10分鐘的離心步驟，以增加其黏液的分泌量。雖然2Xg的RCF對于蝸牛而言是相對輕微的物理性刺激，然而由于萃取時間需達10分鐘，難以排除此條件對于蝸牛是否會有副作用，更甚致死亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明提供一種輕微物理性刺激，且刺激時間短的促進蝸牛黏液分泌的方法；其以預設電壓刺激、促進活體蝸牛黏液的分泌，且電刺激后的蝸牛仍為活體蝸牛。換句話說，利用本發(fā)明所提供的方法萃取蝸牛黏液不會造成蝸牛死亡。
[0006]本發(fā)明方法的一方面提供一種促進蝸牛黏液分泌的方法，包含提供活體蝸牛，并在一預設時間內(nèi)以具有預設電壓的金屬裝置接觸該蝸牛的腹足。
[0007]根據(jù)本發(fā)明方法的一實施方式，所述促進蝸牛黏液分泌的方法，其中預設時間可為5秒至150秒。
[0008]根據(jù)本發(fā)明方法的另一實施方式，所述促進蝸牛黏液分泌的方法，其中預設電壓可為0.5伏特至50伏特。
[0009]本發(fā)明方法的另一方面提供一種蝸牛黏液萃取方法，包含提供活體蝸牛，且蝸牛具有黏液。在一預設時間內(nèi)以具有預設電壓的金屬裝置接觸該蝸牛的腹足以增加該黏液的分泌量。隨后，提取蝸牛的黏液。
[0010]根據(jù)本發(fā)明方法的一實施方式，所述蝸牛黏液萃取方法，其中預設時間可為30秒至120秒。[0011]根據(jù)本發(fā)明方法的另一實施方式，所述蝸牛黏液萃取方法，其中預設電壓可為2伏特至30伏特。
[0012]根據(jù)本發(fā)明方法的再一實施方式，所述蝸牛黏液萃取方法還可包含均質(zhì)所述黏液，以平均黏液的黏度，并離心黏液，以沉降黏液中的雜質(zhì)，以及過濾黏液，以濾除黏液的雜質(zhì)。
[0013]由此，本發(fā)明以不致造成蝸牛死亡，且不傷害蝸牛的方式促進其黏液的分泌，并通過萃取蝸牛的黏液，并可將其廣泛應用于促進傷口的愈合以及皮膚的改質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]為了使本發(fā)明的上述和其它目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，提供附圖，在附圖中:
[0015]圖1是蝸牛黏液對于人類纖維母細胞的遷移(創(chuàng)傷修復)分析實驗照片。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明提供一種促進蝸牛黏液分泌的方法，包含提供活體蝸牛，并在一預設時間內(nèi)以具有預設電壓的金屬裝置接觸活體蝸牛的腹足。所述促進蝸牛黏液分泌的方法，其中預設時間可為5秒至150秒，而預設電壓可為0.5伏特至50伏特。
[0017]此外，本發(fā)明還提供一種蝸牛黏液萃取方法，包含提供具有黏液的活體蝸牛。在一預設時間內(nèi)以具有預設電壓的金屬裝置接觸該活體蝸牛的腹足以增加該黏液的分泌量。隨后，提取活體蝸牛的黏液。再者，更可以均質(zhì)所述黏液，以平均黏液的黏度，并離心黏液，以沉降黏液中的雜質(zhì)，以及過濾黏液，以濾除黏液的雜質(zhì)。所述蝸牛黏液萃取方法，其中預設時間可為30秒至120秒，而預設電壓可為2伏特至30伏特。
[0018]現(xiàn)以下述試驗例詳細說明本發(fā)明，然而本發(fā)明不局限于下列試驗例所揭示的內(nèi)容。
[0019]試驗例I
[0020]1.電壓萃取黏液流程
[0021]將蝸牛從培養(yǎng)箱取出后，初步噴濕以排除不健康的蝸牛，并將篩選出的健康蝸牛以水淋洗，將其置入適當?shù)娜萜魅コ嘤嗟乃?，等待水分蒸?約3個小時)，再依需求的黏液量秤取適量的蝸牛；蝸牛與其所分泌的黏液比例約10%。開始萃取時需注意對器材及手部進行消毒，并確認所欲施以電刺激的電壓值，并需留意碰觸到電極(金屬裝置)的危險。利用具有電極的金屬裝置接觸蝸牛腹足，使蝸牛接受電壓的刺激使其分泌蝸牛黏液，平均一只蝸牛萃取的時間約6min，另外所有盛裝黏液的容器外圍也必須放置冰塊，以維持低溫環(huán)境，并于黏液收集完畢之后迅速將其放入-20°C冰箱保存。
[0022]2.萃取的黏液處理流程
[0023]處理蝸牛液的步驟分別為:初步處理:均質(zhì)、離心(兩階段)、過濾、純化，冰凍保存；其中純化步驟主要是利用膠體過濾法。
[0024]均質(zhì)步驟
[0025]此步驟的目的是將較黏稠的黏液攪拌均勻，使其濃度達到一個平均值。首先將欲處理的黏液自保存的-20°C冰箱取出并退冰，并放置冰浴。由于實驗過程中都處于室溫的環(huán)境中，因此必須隨時留意溫度的變化與冰塊的融化速率。此步驟所花費的較佳時間約為每500mL的黏液均質(zhì)約20min,而使用更多的黏液去均質(zhì)的處理時間不一定等比例放大,可能要更長的時間才會有效果。
[0026]離心步驟
[0027]此步驟的目的是去除蝸牛黏液中的雜質(zhì)，將蝸牛黏液中不溶物質(zhì)及微小的顆粒沉降，另外有沉降系數(shù)極低的懸浮于液體表面物質(zhì)也有分離的效果。于離心前設定離心的條件，本試驗例的條件為:離心時間35min及離心轉速約9000rpm。此外，由于離心時可能會產(chǎn)生離心熱，使得離心機內(nèi)的環(huán)境溫度上升，造成黏液的破壞，因此離心溫度預設為-4~
5。。。
[0028]離心管的處理是先清洗后，用反滲透過濾(RO)水潤洗，再使用滅菌釜高溫高壓滅菌。離心管的材質(zhì)為聚丙烯(Polypropylene ;PP),其可于121°C、20min的條件下以滅菌爸高溫高壓滅菌。離心管容量的限制為盛裝的液體約20mL，并針對其盛裝液體的總重量進行對稱平衡，使得離心管于離心時不因重量不一導致旋轉時傾斜于一方，而損壞離心機的軸心。
[0029]膠體層析過濾步驟
[0030]此步驟是使用抽氣過濾與膠體過濾法，在真空系統(tǒng)中輔助濾液通過濾紙過濾，其用以濾除在離心過程中無法排除的肉眼無法辨識的顆?；驊腋∠禂?shù)中等的不溶物質(zhì)與粘稠的液體等。先用孔徑較大的棉纖維濾紙(濾紙規(guī)格為:直徑90mm，孔徑理論大小7 μ m)將較粗的顆粒過濾掉，再以孔徑較小的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride ;PVDF)濾膜(濾膜規(guī)格為:直徑47mm， 孔徑大小0.45 μ m與0.22 μ m)進行更進一步的過濾。由此，避免在孔徑更細微的膠體過濾中造成管柱的堵塞。進行膠體過濾環(huán)境為4°C的冷房；其中，分離蛋白質(zhì)所使用的膠球，以多糖類為主體；例如:本實驗采用的葡聚醣凝膠為Sephadex G-200(Sephadex?),其使用洋菜糖為主要的高級材料。離子交換層析管柱使用DEAE_Sepharose6B(Sephadex?),是一種聚苯乙烯-苯二乙烯復合材質(zhì)，以及親合性層析(CNBr_activatedSepharose4B ;S^)hadeXTM)。在此不選擇使用一般常見的樹脂類是因為樹脂類膠球對蛋白質(zhì)的吸附力很大，經(jīng)常會使得蛋白質(zhì)變性失活，而只能用在小分子樣本。緩沖溶液是使用酸堿值為PH7的磷酸緩沖溶液。配置完成的緩沖溶液亦需以濾膜過濾，并利用超音波震蕩去氣(degas)。膠體過濾層析、離子交換樹脂層析及親合性吸附層析管柱裝填方式為先預估膠體體積之后，清洗膠體，并于清洗結束后使膠體靜置達到溫度平衡，再進入填充管柱的步驟。注意膠體裝填時，應一次不中斷地倒完膠體。其次，裝填后步驟分為靜平衡與動平衡。靜平衡:待膠體自然沉淀約30min ;動平衡:膠柱裝填完成后要充分流洗，并以流速30mL/h加壓流洗讓膠體更加緊密。此步驟中需留意勿使膠體干掉，并留意餾分收集器(fractioncollector)是否正常運作。此外，整個管柱系統(tǒng)的溫度不可驟變，尤其不可升溫，否則會產(chǎn)生氣泡。于進行分離(fractionation)時,磷酸緩沖液的流速為lmL/min。經(jīng)由這些步驟可使膠體具有使不同分子量大小的微粒達到分離效果，最后收集干凈的黏液即可放置冷凍保存。
[0031]試驗例II
[0032]1.不同電壓與時間的影響(黏液萃取率)
[0033]設定不同電壓以及不同持續(xù)時間刺激下，觀察蝸牛分泌黏液的情形。蝸牛在黏液萃取過程中，不會因為蝸牛受到刺激而造成其生理劇變而死亡。為排除個體差異的疑慮，本試驗經(jīng)交叉重復批次實驗。
[0034]蝸牛接受刺激的電壓及反應時間的試驗條件如下:電壓10、20、30、40、50 (V)，且時間分別為30、60、90、120、150秒。由下表1得知，僅僅增加萃取時間，對于黏液的萃取率增加的幫助相當有限。而另一方面，電刺激的電壓大小不會影響萃取時間。此外，當萃取時間高達90秒以上時，只能夠萃取到微量的黏液，且無法計算其分泌量。
[0035]參照表1，其是蝸牛萃取時間和電壓大小對黏液萃取率(％)的影響。蝸牛于不同持續(xù)刺激時間的條件下施予五種不同大小的電刺激，其中電刺激的方式是以帶有電極的金屬探針直接接觸蝸牛的腹足，而電刺激的電壓分別為10、20、30、40、50伏特(V)。
[0036]以所述各種電壓電刺激蝸牛30秒后，其萃取率由電壓小至大依序分別為0.07、
0.09,0.12,0.11,0.06mL/g。其中，以電壓30伏特(V)的條件電刺激蝸牛有稍微較高的黏液產(chǎn)值。
[0037]以所述各種電壓電刺激蝸牛60秒后，蝸牛仍有分泌黏液的能力，其黏液的萃取率由電壓小至大依序分別為0.13,0.11,0.17,0.13,0.10mL/g，因此可得知蝸牛在此條件下仍能夠繼續(xù)維持黏液的分泌。
[0038]以所述各種電壓電刺激蝸牛90秒后，其黏液萃取率較電刺激時間30秒及60秒還來得高，其黏液的萃取率由電壓小至大依序分別為0.21、0.13,0.21,0.17,0.15mL/g，且在實驗結束后，觀察數(shù)天，蝸牛皆具有良好的爬行情形和回復飲食能力。
[0039]表1、蝸牛萃取時間和電壓大小對黏液萃取率(%)的影響
[0040]
【權利要求】
1.一種促進蝸牛黏液分泌的方法，包括: 提供活體蝸牛； 在一預設時間內(nèi)以具有預設電壓的金屬裝置接觸該活體蝸牛的腹足。
2.根據(jù)權利要求1的促進蝸牛黏液分泌的方法，其中該預設時間為5秒至150秒。
3.根據(jù)權利要求1的促進蝸牛黏液分泌的方法，其中該預設時間為30秒至120秒。
4.根據(jù)權利要求1的促進蝸牛黏液分泌的方法，其中該預設時間為90秒。
5.根據(jù)權利要求1的促進蝸牛黏液分泌的方法，其中該預設電壓為0.5伏特至50伏特。
6.根據(jù)權利要求1的促進蝸牛黏液分泌的方法，其中該預設電壓為2伏特至30伏特。
7.根據(jù)權利要求1的促進蝸牛黏液分泌的方法，其中該預設電壓為10伏特。
8.一種蝸牛黏液萃取方法，包括: 提供活體蝸牛，該蝸牛具有黏液； 在一預設時間內(nèi)以具 有預設電壓的金屬裝置接觸該活體蝸牛的腹足以增加該黏液的分泌量；以及 提取該活體蝸牛的該黏液。
9.根據(jù)權利要求8的蝸牛黏液萃取方法，其中該預設時間為30秒至120秒。
10.根據(jù)權利要求8的蝸牛黏液萃取方法，其中該預設時間為90秒。
11.根據(jù)權利要求8的蝸牛黏液萃取方法，其中該預設電壓為2伏特至30伏特。
12.根據(jù)權利要求8的蝸牛黏液萃取方法，其中該預設電壓為10伏特。
13.根據(jù)權利要求8的蝸牛黏液萃取方法，更包括: 均質(zhì)該黏液，以平均該黏液的黏度； 離心該黏液，以沉降該黏液的雜質(zhì)；以及 過濾該黏液，以濾除該黏液中的該雜質(zhì)。
【文檔編號】A61N1/36GK103961797SQ201410037813
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2013年2月5日
【發(fā)明者】吳建一, 李國豪 申請人:臺灣小品蝸牛生技有限公司