一種外源性ngf的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種外源性NGF的新用途，首先建立SD大鼠隱睪模型，通過外源性注射NGF，設立對照組，利用實時定量PCR、原位雜交、免疫熒光、免疫組化及透射電子顯微鏡等技術，觀察隱睪組織形態(tài)學變化，以及睪丸組織中NGF、HoxA10mRNA及蛋白質的表達變化，證實NGF是可促進睪丸精子的形成。因此，NGF在制備用于促生精、促進隱睪模型睪丸組織發(fā)育、降低隱睪組織的損傷以及治療隱睪癥藥物中具有廣泛的應用。
【專利說明】一種外源性NGF的新用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術領域】，具體的涉及一種外源性NGF的新用途。
【背景技術】
[0002]隱睪癥即睪丸未降，是由于一側或兩側睪丸未能成功進入陰囊造成的泌尿生殖系統(tǒng)畸形，新生男嬰的發(fā)病率為2% _4%，早產兒的發(fā)病率更高。正常情況下，在胎兒出生前睪丸首先在腹腔發(fā)育，然后在引帶的牽拉作用下，逐步下降至陰囊。睪丸之所以未能成功下降至陰囊，主要是由于未將睪丸發(fā)生組織學改變。此外，隱睪癥是男性不育及睪丸腫瘤發(fā)生的危險因素之一。有研究表明，未經及時有效治療的隱睪患兒，對其以后的生育能力有著不可逆的影響，且患睪丸惡性腫瘤的機率更高。目前睪丸下降固定術和激素療法是治療隱睪的主要手段。1930年HCG (人絨毛膜促性腺激素)激素療法首次應用于臨床，并獲得廣泛應用，尤其是歐洲國家更為盛行。然而，近幾年，因激素療法對生殖細胞的副作用較大，而再次被國內外學者廣泛重視，其臨床應用較前減少。[0003]隱睪癥是一種涉及多種基因的多因素疾病。前期研究證實，在未降睪丸中β-NGF和HoxAlOmRNA及蛋白質表達顯著降低。NGF (Nerve growth factor,神經生長因子)被認為是神經生長、擴增、分化及存活的主要調控因子之一，而且，在睪丸中也有NGF的表達，且由男性生殖細胞產生。HoxAIO則與隱睪癥密切相關，是腹腔內睪丸下降、引帶發(fā)育的重要原因之一。迄今為止，外源性NGF已被應用于多種神經系統(tǒng)模型，且應用于臨床，研究NGF的傳遞方式及在成熟或發(fā)育的神經系統(tǒng)中的作用機制。因此，將β-NGF和HoxAIO作為睪丸發(fā)育情況的檢測指標。然而，外源性NGF是否影響大鼠隱睪模型中內源性NGF和HoxAIO的表達變化尚未有相關報道。

【發(fā)明內容】

[0004]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種外源性NGF的新用途，通過建立SD大鼠單側隱睪模型，利用電生理顯微技術觀察外源性NGF作用于隱睪后NGF和HoxAIO基因及蛋白的表達變化，證實其NGF具有明顯地促生精作用，外源性注射NGF，可促進隱睪模型睪丸組織發(fā)育，降低隱睪組織的損傷，對人類隱睪癥具有潛在的治療效果。
[0005]技術方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0006]外源性NGF在制備用于促生精藥物中的應用。
[0007]所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
[0008]外源性NGF在制備用于降低隱睪組織的損傷藥物中的應用。
[0009]所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
[0010]外源性NGF在制備用于治療隱睪癥藥物中的應用。[0011]所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
[0012]外源性NGF在制備用于促進隱睪模型睪丸組織發(fā)育藥物中的應用。
[0013]所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
[0014]本發(fā)明首先建立SD大鼠隱睪模型，通過外源性注射NGF，設立對照組，利用實時定量PCR、原位雜交、免疫熒光、免疫組化及透射電子顯微鏡等技術，觀察隱睪組織形態(tài)學變化，以及睪丸組織中NGF、HoxAlOmRNA及蛋白質的表達變化，證實NGF是可促進睪丸精子的形成。
[0015]有益效果:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的外源性NGF的新用途，通過一步法實時定量PCR、免疫雜交、免疫熒光、免疫組化技術檢測隱睪組織中NGF、HoxA10基因和蛋白表達變化，高劑量組(NGF高濃度)比低劑量組和對照組(HCG組)NGF和HoxAlO蛋白和基因表達較高，證實了 NGF具有明顯地促生精作用，外源性注射NGF，可促進隱睪模型睪丸組織發(fā)育，降低隱睪組織的損傷，對人類隱睪癥具有潛在的治療效果?？梢?，NGF在藥物開發(fā)中具有廣泛的應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是一步法實時定量PCR檢測結果圖；A圖是睪丸中β -NGF mRNA的表達水平，B圖是HoxAlOmRNA的表達水平；
[0017]圖2是原位雜交結果圖；A圖為陰性對照組，B圖為HCG組，C圖為高劑量組，D圖為低劑量組，E圖為空白對照組；
[0018]圖3是免疫熒光結果圖；A圖為陰性對照組，B圖為HCG組，C圖為高劑量組，D圖為低劑量組，E圖為空白對照組；
[0019]圖4是免疫組化結果圖；A圖為陰性對照組，B圖為HCG組，C圖為高劑量組，D圖為低劑量組，E圖為空白對照組；
[0020]圖5是透射電子顯微鏡下睪丸組織顯微結構圖；A圖為陰性對照組，B圖為HCG組，C圖為高劑量組，D圖為低劑量組，E圖為空白對照組；
[0021]圖6是模型的建立示意圖；
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0023]實施例1
[0024]模型的建立，如圖6所示。
[0025]獲取日齡21天SD雄鼠約30只(此時SD鼠的睪丸尚未下降，SD鼠睪丸的下降通常在日齡20-30d)，戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，下腹正中切開腹腔，切斷睪丸引帶遠端，縫合睪丸白膜，將睪丸固定于相應的腹膜上，關閉腹腔，完成隱睪模型的建立。對側睪丸作為對照組。
[0026]模型建立術后分為4組，每組6只，NGF高、低注射劑量組(HN組、LN組)，注射HCG組(HC組)，陰性對照組(NC組)。自術后第2天起，HN組每次肌肉注射鼠NGF9000IU，LN組每次肌肉注射鼠NGF4500IU，共注射5天。HC組每次肌肉注射HCG400IU，NC組肌肉注射生理鹽水。另取6只正常SD大鼠，作為空白對照組。模型建立術后第7天(幼鼠期)、術后第60天(性成熟期)快速脫頸椎法每次處死12只大鼠，取未降睪丸和對側已降睪丸標本用于后續(xù)實驗。
[0027]實施例2 —步法實時定量PCR
[0028]組織總RNA的提取:取50~IOOmg的睪丸組織應用Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)，按說明書步驟提取總RNA，置_70°C冰箱保存?zhèn)溆?。為了避免可能的基因組DNA污染，所有的RNA樣品均使用無RNA酶的DNA酶(Promega，Madison，WI，USA)。經紫外分光光度計測定各樣本的OD26tZOD28tl(R)值，以鑒定RNA純度及完整性。R值如表1所示，1.8 < R < 2.0證實Trizol法提取的RNA純度較好，可用于后續(xù)實驗。
[0029]根據(jù)標準協(xié)議，使用Rotor_Gene3000實時DNA分析系統(tǒng)(Corbett Research,Sydney, Australia),應用 SensiMixTM One-Step 試劑盒(Quantace, UK)完成一步法突光實時定量 PCR (one-step qPCR),應用 Rotor-Gene 實時分析軟件 6.1 (Build90)計算 β -NGF和 HoxlOmRNA 的表達結果。PCR 擴增體系:Dream Taq PCR Master Mix (2x) IOul ；ForwardPrimer2ul ；Reverse Primer2ul ；Template DNA3ul ;Water, nuclease_free3ul。PCR擴增程序包括:42°C，30min反轉錄后，95°C Taq酶激活2min，隨后95°C 15s，58°C 30s共45個循環(huán)，最后72°C 40s延伸。GAPDH作為標準內參基因對照。β -NGF, Hox I O, GAPDH的PCR引物序列如下:
[0030]β -NGF-forward:5/ -ACCTCTTCGGACACTCTG-3'；
[0031]β -NGF-reverse:5/ -GTGGCTGTGGTCTTATCTC-3'；
[0032]Hox10-forward:5/ -ACAAGCACACCACAATTCTCC-3'；
[0033]HoxlO-reverse:5/ -ATCCAAACAATGTCTCCCTTCTC-3'；
[0034]GAPDH-forward:5/ -TCGTGGAGTCTACTGGCGTCT-3'；
[0035]GAPDH-reverse:5/ -CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3'。
[0036]結果如圖1所示，顯示在高劑量組(LN)中，HoxAlO及β -NGF mRNA的表達水平最高(F = 125.58，P < 0.0Oland F = 49.03，P < 0.001)，與陰性對照組(NC)相比，高劑量組和低劑量組的HoxAlO及β -NGF mRNA的表達水平顯著提高。
[0037]如下面表一所示，
[0038]表1Trizol法提取的RNA純度鑒定結果
[0039]
【權利要求】
1.外源性NGF在制備用于促生精藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
3.外源性NGF在制備用于降低隱睪組織的損傷藥物中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
5.外源性NGF在制備用于治療隱睪癥藥物中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、HoxAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
7.外源性NGF在制備用于促進隱睪模型睪丸組織發(fā)育藥物中的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的藥物通過提高隱睪組織中NGF基因的蛋白表達量、Ho xAIO基因的蛋白表達量來實現(xiàn)。
【文檔編號】A61P15/00GK103933551SQ201410037990
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2014年1月26日
【發(fā)明者】咸華, 黃劍飛, 咸云, 劉莉莉 申請人:南通大學附屬醫(yī)院