一種干擾tlr4受體的小rna及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。慢性疼痛是神經(jīng)元可塑性變化的表現(xiàn)形式之一，其生理學(xué)特點(diǎn)是痛覺的反應(yīng)性增高，治療困難且機(jī)制不明，治療上多用阿片類受體阻滯劑，存在較多副作用。本發(fā)明提供了一種干擾TLR4受體的小RNA，其序列如SEQ?ID?NO:5所示。本發(fā)明還提供了該小RNA在治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的小RNA可采用直接注射的方式，或采用載體表達(dá)的方式，可在體內(nèi)外抑制TLR4的表達(dá)，達(dá)到治療慢性疼痛的效果，且給藥途徑方便，并且不存在成癮、耐受等反應(yīng)，可長期使用。
【專利說明】—種干擾TLR4受體的小RNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抑制TLR4受體的小RNA及其在制備治療慢性疼痛藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]慢性疼痛是神經(jīng)元可塑性變化的表現(xiàn)形式之一，其生理學(xué)特點(diǎn)是痛覺的反應(yīng)性增高，主要表現(xiàn)為痛覺過敏(hyperalgesia)和超敏反應(yīng)(allodynia)。此類疼痛治療困難,主要是由于其機(jī)制不明。目前在治療上，主要是以嗎啡為代表的阿片類受體阻滯劑，但存在眾多的副作用以及成癮、耐受等反應(yīng)，從而限制了其長期使用。因此，亟需一種治療效果良好、作用時(shí)間長、副作用輕的新方法，達(dá)到長期、有效控制慢性疼痛的目的。
[0003]Toll樣受體4(Toll like rec印tor4，TLR4)是Toll家族之一，是細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，是LPS祀細(xì)胞膜上的跨膜受體和自然免疫系統(tǒng)主要的病原模式識(shí)別受體。TLR4具有細(xì)胞外亮氨酸重復(fù)區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)域，胞外信號(hào)通過⑶14激活TLR4，而活化的TLR4胞內(nèi)與接頭蛋白MyD88的TLR4受體域結(jié)合，通過MyD88死域(death domain)再與IL-1受體相關(guān)激酶(IL-lreceptorassociated kinase, IRAK)結(jié)合，導(dǎo)致IRAK的自身磷酸化，從而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 _6 (TNF-a receptor associated factor6, TRAF-6),而后通過激活 IKK 使
Iκ B家族α、β激酶活化,導(dǎo)致I K B家族的廣泛磷酸化而降解，使NF- κ B轉(zhuǎn)位到胞核，其活性二聚體啟動(dòng)細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等)和輔助刺激分子⑶80和⑶86基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終導(dǎo)致炎癥因子釋放(參見文獻(xiàn):Takeuchi O and S akira.Toll-like receptors:their physiological role and signal transduction system.1ntImmunopharmacoI,2001，I(`4):625_635)。
[0004]TLR4受體在疼痛的發(fā)生、發(fā)展和維持中發(fā)揮重要作用。在L5神經(jīng)損傷模型雄性大鼠模型中發(fā)現(xiàn)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞TLR4的高表達(dá)與神經(jīng)損傷后痛覺超敏密切相關(guān)。L5神經(jīng)切斷后TLR4-knoCkout及TLR4基因突變小鼠熱痛閾、機(jī)械痛閾明顯高于野生小鼠；對(duì)雄性L5神經(jīng)切斷大鼠鞘內(nèi)注射TLR4抑制性寡核苷酸(ODN)可降低脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)標(biāo)志及促炎因子的表達(dá)，明顯減輕大鼠對(duì)痛覺的敏感性，在小鼠及大鼠模型證實(shí)TLR4在膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用，為臨床神經(jīng)病理性疼痛的診治提供了新靶點(diǎn)(參見文獻(xiàn)=Tanga FY, NutileMcMenemy N,DeLeo JA.The CNS role of Toll-like receptor4in innate neuroimmunityand painful neuropathy.Proc Natl Acad Sci USA,2005，102(16):5856-5861)。
[0005]RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象，是生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA將被RNase III家族中的一個(gè)能夠特異性識(shí)別雙鏈RNA的酶Dicer，以ATP依賴的方式逐步切割為19~23nt的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNA)。siRNA雙鏈在RISC作用下雙鏈解開，同源的靶目標(biāo)RNA結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶目標(biāo)mRNA切斷，從而阻斷了基因表達(dá)。RNA干擾是目前最有效的基因“沉默”技術(shù)，從理論上講，在疼痛通路中興奮性增高的基因都可能成為RNA干擾靶位，從而降低其興奮性，達(dá)到治療目的。但是，干擾效率高，特異性強(qiáng)的小RNA的獲得較難，不同序列的差異即可導(dǎo)致有效性的喪失，從而影響其藥理學(xué)的價(jià)值，我們采用大鼠模型發(fā)現(xiàn)干擾大鼠TLR4受體的小RNA具有治療疼痛的作用。(參見文獻(xiàn):吳飛翔，繆雪蓉，徐學(xué)武，孫玉明，俞衛(wèi)鋒.鞘內(nèi)注射針對(duì)Toll樣受體4基因的siRNA緩解坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠的神經(jīng)病理性疼痛.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2011,32 (4):377-381)。但是，用于人體的治療仍需要有效的干擾人源性TLR4受體的小RNA。
[0006]目前尚無有關(guān)干擾人源性TLR4受體的小RNA及其用于治療慢性疼痛的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種干擾TLR4受體的小RNA，本發(fā)明的另一目的在于提供該小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明人前期鞘內(nèi)注射TLR4_siRNA可明顯降低神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛敏，說明TLR4是一個(gè)有效的治療慢性疼痛的靶目標(biāo)，同時(shí)也說明RNA干擾技術(shù)用于治療慢性疼痛的可行性。(用的siRNA序列為大鼠的序列:5’-GUCUCAGAUAUCUAGAUCU-3，參見文獻(xiàn):吳飛翔，繆雪蓉，徐學(xué)武，孫玉明，俞衛(wèi)鋒.鞘內(nèi)注射針對(duì)Toll樣受體4基因的siRNA緩解坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠的神經(jīng)病理性疼痛.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2011,32 (4):377-381;及 Wu FX, Bian JJ1Miao XR, Huang SD, Xu Xff, Gong DJ, Sun YM, Lu ZJ, YuWF.1ntrathecal siRNA against Toll-like receptor4reduces nociception in a ratmodel of neuropathic pain.1nt J Med Sci，2010，7 (5):251-259.)。
[0009]因此，本發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)干擾人的TLR4的小RNA進(jìn)行篩選，獲得一種高效干擾TLR4的小RNA，可對(duì)干擾TLR4mRNA進(jìn)行降解，從而抑制干擾TLR4蛋白的表達(dá)，該小RNA可成為治療慢性疼痛的一種新的藥物。
[0010]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
[0011]TLR4序列(G1:2459627)由Gene bank獲得，將其序列中的開放讀框部分輸入http://1.cs.hku.hk/ ~sirna/software/sirna.php 網(wǎng)站所提供的 RNAi 設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行在線篩選，而后選擇GC比在40% - 60%之間的，逐個(gè)做Blast分析和SNP分析，選中位于開放讀框內(nèi)的3個(gè)不同的序列，如下:
[0012]I.GCATGGAGCTGAATTTCTA (SEQ ID NO:1)
[0013]I1.GGATTTATCCAGGTGTGAA (SEQ ID NO:2)
[0014]III.CCTGAACCCTATGAACTTT (SEQ ID NO:3)
[0015]其對(duì)應(yīng)的RNA序列為:
[0016]1.GCAUGGAGCUGAAUUUCUA (SEQ ID NO:4)
[0017]II.GGAUUUAUCCAGGUGUGAA (SEQ ID NO:5)
[0018]II1.CCUGAACCCUAUGAACUUU (SEQ ID NO:6)
[0019]本發(fā)明將構(gòu)建含人TLR4基因的pEGFPCl報(bào)告質(zhì)粒，用脂質(zhì)體方法將上述序列對(duì)應(yīng)的RNA和pEGFPCl-TLR4共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行RNA干擾效率的檢測(cè)，進(jìn)而篩選出RNA干擾效率最高的序列為:GGAUUUAUCCAGGUGUGAA (SEQ ID NO:5)。
[0020]本發(fā)明的第一方面， 提供了一種干擾TLR4受體的小RNA，其序列如SEQID NO: 5所/Jn ο
[0021]本發(fā)明通過含TLR4基因的pEGFPCl報(bào)告質(zhì)粒對(duì)進(jìn)行RNA干擾效率進(jìn)行檢測(cè)，得到干擾效率最高小RNA ;又通過小RNA作用于人的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小RNA具有良好的抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TLR4的上調(diào)。本發(fā)明的小RNA的作用機(jī)理:TLR4在慢性疼痛的發(fā)生、發(fā)展和維持中發(fā)揮重要作用，在慢性疼痛中表達(dá)大量增加，可易化誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成痛覺的惡性循環(huán)，引起疼痛過敏。因此下調(diào)TLR4受體表達(dá)具有抑制慢性疼痛的作用。RNA干擾技術(shù)可降解mRNA從而抑制蛋白的表達(dá)，那么，采用該技術(shù)抑制TLR4的表達(dá)就可達(dá)到治療疼痛的目的。
[0022]本發(fā)明的第二方面，提供了上述干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。
[0023]所述的干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，所述的藥物可以為注射劑。
[0024]本發(fā)明所述的慢性疼痛，它是指的沒有生物學(xué)價(jià)值的、超過正常的組織損傷愈合時(shí)間(通常>3月)的疼痛，包括炎癥性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛和癌痛。
[0025]本發(fā)明小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，可采用小RNA直接注射，或?qū)撔NA的重組載體經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔直接注射，如慢病毒、腺病毒或質(zhì)粒等，可達(dá)到治療慢性疼痛的目的，且給藥途徑方便，效果良好。
[0026]同時(shí)，由于本發(fā)明不是傳統(tǒng)的阿片類受體阻滯劑，不存在成癮、耐受等反應(yīng)，可長期使用。本發(fā)明為治療慢性疼痛提供了新的治療手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是流式細(xì)胞術(shù)顯示報(bào)告載體pEGFG-TLR4中綠色熒光的表達(dá)；
[0028]圖2是實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞NMDA受體mRNA的表達(dá)；
[0029]圖3是western blotting檢測(cè)人的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞NMDA受體蛋白的表達(dá)；
[0030]圖中siRNA 組指 siRNA-TLR4 II ;MM 組指錯(cuò)配的 RNA 組(Mismathch RNA) ；NS 組指生理鹽水組；Control組指空白組。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0032]實(shí)施例1:干擾TLR4的小RNA序列的篩選過程
[0033]一、含人TLR4受體基因的pEGFPCl報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
[0034]據(jù)人TLR4受體序列，設(shè)計(jì)引物:
[0035]上游引物:5，-CGGAGCGTTTCAGACTCCGGAGCCTCAGCTGTT-3，(SEQID NO:7);
[0036]下游引物:5，-CGCGTCTTGCCCAGCTGGGTCCAATAAATT-3’(SEQ ID N0:8)。
[0037]引物兩端分別含Sac I和Sal I酶切位點(diǎn)。采用RT — PCR，獲取含有干擾靶序列的人TLR4序列表達(dá)框內(nèi)的部分序列。
[0038]將此片段與pEGFPCl質(zhì)粒(購自美國Invitrogen公司)分別用Sac I和Sal I酶切，而后用T4DNA連接酶16°C過夜連接成pEGFPCl-hNMDA。RKE.col1.DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑克隆抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增出正確的條帶后進(jìn)一步測(cè)序鑒定。[0039]1、PCR鑒定體系:
【權(quán)利要求】
1.一種干擾TLR4受體的小RNA，其序列如SEQ ID NO:5所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為主要活性成份為如SEQ ID NO:5所示的小RNA的注射劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為包含如SEQ ID NO:5所示的小RNA的重組載體制成的注射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的干擾TLR4受體的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組載體為慢病毒載體、腺病毒載體或質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】A61P25/04GK103757024SQ201410043633
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】吳飛翔, 俞衛(wèi)鋒, 張金旻 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)