墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中藥材墨旱蓮提取物作為治療肺纖維化的藥物用途。墨旱蓮提取物由中藥材墨旱蓮經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取等方法制備而成，墨旱蓮提取物得率10.01-15.05％，其中總皂苷含量在53.24-56.1％，旱蓮苷A含量為6.54-11.3％，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量1.46-3.56％。本發(fā)明所得到的中藥材墨旱蓮提取物可用于治療肺纖維化等醫(yī)藥用途，墨旱蓮提取物可抑制反映肺組織損傷的NO、MDA含量，降低反映膠原沉積的HYP含量和抑制肺組織中致纖維化的細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)從而干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠纖維化程度。
【專利說明】墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥材墨旱蓮提取物作為治療肺纖維化的藥物用途。
【背景技術(shù)】
[0002]肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見的病理變化，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要包括上皮細(xì)胞和基底膜的破壞、成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的聚集和細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積。其特征是肺間質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積而正常肺組織結(jié)構(gòu)被破壞。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，慢性炎癥是成纖維細(xì)胞增殖和肺部結(jié)構(gòu)病理改變的主要因素，但抗炎治療效果不明顯，大量研究顯示成纖維細(xì)胞增殖與纖維化形成可以獨立于炎癥而發(fā)生，提示纖維化的病變不僅僅是炎癥的繼發(fā)結(jié)果。目前為止，抗炎及免疫調(diào)節(jié)藥物治療肺纖維化效果不好，傳統(tǒng)的治療藥物仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑/細(xì)胞毒藥物為主，如皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺無顯著效果，副作用大，肺移植是肺纖維化終末階段的唯一有效治療方法，但在臨床廣泛應(yīng)用受到經(jīng)濟(jì)、供體缺乏等限制 ，因此尋找新的治療方法迫在眉睫。
[0003]有關(guān)肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究早期主要集中在肺泡巨噬細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子，但目前已確定肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖及通過釋放大量介質(zhì)而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用，共同特征是體內(nèi)膠原代謝的失衡，在肺纖維化早期主要以III型膠原增加為主，晚期是以I型膠原增加為主。在肺纖維化過程中，肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖和分化作用受多種因子調(diào)控，除成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM外，受損的肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞也產(chǎn)生ECM，肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病過程中肺組織損傷修復(fù)和再生的關(guān)鍵參與者，因此，研究藥物抑制成纖維細(xì)胞的增殖對于防止肺纖維化有重要的意義，
[0004]多數(shù)肺纖維化病人的組織中可以觀察到炎癥與纖維化并存，提示炎癥反應(yīng)參與了肺纖維化的形成，肺泡炎癥和纖維化是兩個相對獨立的過程，炎癥反應(yīng)是有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)，在某些情況下，炎癥損傷持續(xù)并引起纖維化，在肺纖維化發(fā)生過程中，TGF-β、TOGF、FGF、VEGF等幾個細(xì)胞因子起到關(guān)鍵性作用，可以作為研究和治療的關(guān)鍵性靶點[1]。細(xì)胞因子之間及其與炎癥細(xì)胞、肺臟組織細(xì)胞之間可以相互作用發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)加重肺組織炎癥或免疫損傷，刺激纖維母細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，肺纖維化的發(fā)生是以細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡導(dǎo)致大量趨化因子釋放從而引起炎性細(xì)胞聚集、活化為基礎(chǔ)。細(xì)胞因子在肺纖維化中的作用是目前研究的熱點，采用抑制促纖維化的細(xì)胞因子為纖維化的治療提供了一條新的有效途徑。
[0005]各種因素作用于肺臟，直接或間接產(chǎn)生氧自由基，損傷肺組織，使MDA產(chǎn)生增多，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子，促進(jìn)損傷后的修復(fù)，使膠原產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。MDA為機(jī)體內(nèi)氧自由基，攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成的脂質(zhì)過氧化物，其含量的變化反映了機(jī)體組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。羥脯氨酸(HYP)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，對膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，膠原是唯一含羥脯氨酸較多的蛋白質(zhì)。在肺纖維化病人肺組織中TGF-β I表達(dá)上調(diào)，而氧化應(yīng)激可以直接導(dǎo)致肺纖維化時巨噬細(xì)胞分泌TGF-β I增多，TGF-β I是一個具有多重功能的細(xì)胞因子，通過細(xì)胞增殖、分化、凋亡及肺纖維上皮細(xì)胞分化等作用來調(diào)控組織形成和分化，是一種強(qiáng)力的致纖維化因子[2]，可以刺激細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分，還可改變基質(zhì)降解酶成分的活性，直接加劇ECM的沉積[3]，肺纖維化機(jī)制中TGF-β I/Smad為經(jīng)典信號通路，TGF-β I先與受體結(jié)合發(fā)生磷酸化，結(jié)合激活Smad2/3、與胞漿內(nèi)Smad4結(jié)合，入核與核內(nèi)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、及致纖維化作用[4]。因此，通過測定肺組織羥脯氨酸能確定組織中膠原的含量，TGF-β I表達(dá)降低可顯示藥物干預(yù)肺纖維化的可能作用機(jī)制，即藥物不是通過抗炎而改善肺纖維程度，是通過降低組織中TGF-β I的表達(dá)，激活TGF-β 1/Smad通路而發(fā)揮其干預(yù)作用。在眾多細(xì)胞因子中TGF-β I被認(rèn)為是肺纖維化形成與發(fā)展的“誘導(dǎo)劑”和“啟動子”，TGF-β I可促進(jìn)成纖維細(xì)胞(FB)的增殖、分化及分泌的過程，繼而促進(jìn)膠原蛋白等ECM成分在肺間質(zhì)和肺泡中過度積聚，從而最終引起肺間質(zhì)纖維化。博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化是經(jīng)典的篩選抗肺纖維化藥物的體內(nèi)藥效模型，博萊霉素可引起體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，氧自由基產(chǎn)生增多，從而啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低其TGF-β I含量可減緩小鼠肺纖維化進(jìn)程。 [0006]中藥材墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrata L.的地上部分，自上個世紀(jì)80年代國內(nèi)外學(xué)者該植物化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離鑒定噻吩、皂苷、香豆素草醚、黃酮等類型成分?！吨袊幍洹?2010版)中收載蟛蜞菊內(nèi)酯、旱蓮苷A作為該藥材的定性、定量指標(biāo)性成分。墨旱蓮提取物有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止血、升白、保肝、增加冠流等作用；注射旱蓮草提取液能使常壓缺氧情況下小鼠的生命明顯延長，亦能提高在減壓和缺氧環(huán)境下的小鼠存活率；旱蓮草擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈流量和增加耐缺氧能力的作用出現(xiàn)快，維持時間長，毒性小；能提高減壓缺氧情況下小鼠的存活率。近幾年墨旱蓮的藥效研究主要集中于保肝、肝細(xì)胞的再生[5’6]、抗癌[7’8]、非特異性免疫增強(qiáng)[9]、改善骨質(zhì)疏松[1°]、腦神經(jīng)保護(hù)[11]等作用。分子水平實驗證實化合物膨蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone)是ATP酶抑制劑[12’13’13]及異構(gòu)酶II抑制劑[15]，對NF-KB、IKK、capaSSe-ll等轉(zhuǎn)錄因子均具有抑制作用[16~19]，具有保肝、抗癌、抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移[2°]、體外抑制人肝星狀細(xì)胞LX-2的纖維化[21]、減毒[22]等作用。
[0007]目如，有關(guān)墨旱蓮提取物等相關(guān)專利有近20余篇:主要集中在提取的制備方法(201010214799.6,201110184589.1,200610201098.2,201010603861.0,201110187513.4)、總皂苷的制備方法(200810031092.4，201310002410.5)、在保肝、降血脂(201110310181.4)以及在洗發(fā)膏、煙草香料等方面的應(yīng)用。尚未見報道墨旱蓮藥材的改善肺纖維化作用及其在治療此疾病藥物中用途。
[0008]【參考文獻(xiàn)】
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[0032]本項發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)墨旱蓮提取物可用于治療肺纖維化病癥的醫(yī)藥新用途。
[0033]技術(shù)方案
[0034]墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0035]所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于按質(zhì)量百分比計，所述的墨旱蓮提取物中總皂苷含量為53.24-56.1%，提取物中旱蓮苷A含量為6.54-11.30%，蟛蜞菊內(nèi)酯含量為1.46-3.56%。
[0036]所述的墨旱蓮提取物經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取方法制備而成，所述的墨旱蓮提取物得率 10.01-15.05%o
[0037]其中所述的墨旱蓮提取物由如下方法制得:墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏；將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物及水部位，同時將乙酸乙酯部位通過HP-20吸附樹脂柱色譜進(jìn)行分離，分別獲得水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位；其中60%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位經(jīng)減壓干燥，以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物。
[0038]具體來說:
[0039]本項發(fā)明是經(jīng)過研究證明墨旱蓮提取物可改善博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型，并采用分光光度法對墨旱蓮提取物中總皂苷含量，采用HPLC法對提取物中2種單體物質(zhì)蟛蜞菊內(nèi)酯和旱蓮苷A的含量進(jìn)行了測定。通過觀察HE、Masson染色后肺組織病理切片、測定各組肺臟系數(shù)、在不同時期檢測各組小鼠肺組織中NO、MDA、HYP、TGF-β I含量。實驗結(jié)果表明:本發(fā)明中的墨旱蓮提取物可改善模型小鼠肺組織纖維化程度，降低模型肺組織膠原沉積，顯示對小鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用，可用于治療肺纖維化疾病的新醫(yī)藥用途。
[0040]有益效果
[0041]1、肺纖維化是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見的病理變化，多數(shù)研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素治療肺纖維化有效率小于30%，患者生存率無明顯改變，目前尚無明確治療藥物。本發(fā)明墨旱蓮是常用中藥材。中醫(yī)認(rèn)為墨旱蓮為保肝補(bǔ)腎中藥，目前，沒有任何研究報道墨旱蓮提取物或其中某類單體成分可用于肺纖維化的治療，本發(fā)明人通過體內(nèi)實驗證明該墨旱蓮提取物顯著改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。本發(fā)明的墨旱蓮提取物具有較好的穩(wěn)定性，可以用于制備治療相應(yīng)疾病的藥物。
`[0042]2、依據(jù)《中國藥典》(2010版)記載，本發(fā)明提取物測定總皂苷含量(53.24-56.1% )之外，同時測定墨旱蓮的指標(biāo)成分蟛蜞菊內(nèi)酯(1.46-3.56% )和旱蓮苷A(6.54-11.30% )。本發(fā)明中的墨旱蓮提取物是個復(fù)雜體系，體內(nèi)、外實驗結(jié)果證明提取物整體入藥有效，尚不能確定活性成分及輔助成分類型。具體來說本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，在實施例1和2(即權(quán)利要求兩個端點值)中所制備的提取物給藥組中，HE、MaSSon染色病理切片顯示給藥組肺纖維化程度明顯改善，墨旱蓮提取物給藥組NO含量明顯低于模型組，給藥第14、28天，肺組織中反映肺損傷的MDA含量明顯低于模型組(P < 0.05或P < 0.01)，給藥第14、28天肺組織中反映膠原沉積的HYP的含量均明顯低于模型組，說明墨旱蓮提取物對肺纖維化進(jìn)程不同時期都有一定的保護(hù)作用，提示墨旱蓮提取物具有減輕氧自由基損傷，抑制膠原形成、保護(hù)肺組織的作用。實施例3 (不在發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi))提取物給藥組，雖然模型小鼠肺系數(shù)有較顯著變化(P < 0.05)，但其小鼠肺組織改善程度不明顯，NO、MDA、HYP,TGF-β I等指標(biāo)無明顯改變。抑制肺纖維化細(xì)胞過度增生和促進(jìn)其凋亡也成為防治肺纖維化的一種有效手段，體外細(xì)胞增殖抑制實驗結(jié)果表明:在1.6-100 μ g/mL范圍內(nèi)，實施例1-3制備的墨旱蓮提取物呈劑量依賴性抑制HFL-1增殖，體外實驗結(jié)果也證實了墨旱蓮提取物的抗肺纖維藥物用途。因此說明本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)其可以墨旱蓮提取物對肺纖維化進(jìn)程不同時期都有一定的保護(hù)作用，不在本發(fā)明保護(hù)范圍效果不佳。
[0043]3、本發(fā)明涉及實驗材料來自原植物，原植物分別范圍廣，成本低，提取物活性明確，具有廣泛的實用價值。【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]1.圖1實施例1-3的墨旱蓮提取物對造模第14、28天的小鼠肺系數(shù)及肺組織中HYP含量的影響。A:對肺系數(shù)的影響；B:對肺組織中HYP含量的影響；#p < 0.05，versuscontrol ；*p < 0.05, **p < 0.01versus model ;陽性對照藥物:prednisone。
[0045]2.圖2實施例1-3的墨旱蓮提取物對各組肺組織炎癥程度的影響(HE染色X200)。A空白；B~D實施例1-3的墨旱蓮提取物；E模型；F陽性藥
[0046]3.圖3實施例1-3的墨旱蓮提取物對各組肺組織纖維化程度的影響(Masson染色X200)。A空白；B~D實施例1-3的墨旱蓮提取物；E模型；F陽性藥
[0047]4.圖4實施例1-3制備的墨旱蓮提取物對造模第14、28天時各組肺組織中NO(A)與 MDA(B)含量的影響。(##p < 0.01，#p < 0.05，versus control ；*p < 0.05，**p< 0.01versus model)，陽性對照藥物:prednisone
[0048]5.圖5實施例1-3制備的墨旱蓮提取物對各組肺組織中TGF-β I含量的影響。(##ρ < 0.01, #ρ < 0.05, versus control ；*p < 0.05, **p < 0.01versus model),陽性對照藥物:prednisone
【具體實施方式】
[0049]實施例1
[0050]一、墨旱蓮提取物的制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)考察
[0051]墨旱蓮(Herba Ecliptae)為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L.的干燥地上部分，購于安徽亳州。乙醇、石油醚等試劑均為分析純。
[0052]墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物(EtOAc)及水部位(H20)，同時將乙酸乙酯部位通過HP-20吸附樹脂柱色譜進(jìn)行分離，分別獲得水(6.56% ) ,30% (4.66% ) ,60%(5.51% ),90% (4.49%)乙醇洗脫部位，60%乙醇洗脫部位減壓干燥，以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物，配制成藥液用于活性研究。
[0053]1、墨旱蓮提取中總皂苷的含量測定方法如下:
[0054]①標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液的制備:稱取干燥至恒重所得旱蓮苷A對照品1.46mg,甲醇溶解，定容于IOml量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取墨旱蓮提取物7.0lmg,甲醇溶解，定容至25ml,混勻，作為樣品液。
[0055]②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取旱蓮苷A對照品溶液各0，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0ml，置于IOml具塞試管中水浴揮干，加0.2ml的5%香草醛/冰醋酸和0.8ml高氯酸溶液，于60°C水浴加熱15min，冷卻后加5ml冰醋酸，以溶液濃度C為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為 C = 0.4757A+0.0002，R2 = 0.9998，在 0.029 ~0.146mg/ml 呈良好的線性關(guān)系。依同法制備空白對照。于波長550nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0056]③樣品中總皂苷含量測定:吸取樣品液lmL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟操作，測定吸收度。計算墨旱蓮總皂苷含量為56.1%。
[0057]2、墨旱蓮提取物中旱蓮苷A和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量測定:[0058]①色譜條件:C18柱(ZORBAX SB-C18,14.6 X 250mm5-Micron，Agilent);進(jìn)樣量:20 μ L0流速lml/min。檢測波長:210nm。流動相:乙腈(A)和0.1 %磷酸緩沖液⑶梯度洗脫，O ~lOmin，15-23% (A) ；10-40min, 23% (A) ；40-42min, 23-40% (A) ；42-60min, 40%⑷；60-65min ；40-90% ⑷。
[0059]②對照品、供試品溶液制備:精密稱取蟛蜞菊內(nèi)酯對照品6.72mg,旱蓮苷A7.03mg于25ml容量瓶，甲醇溶解并定容。即蟛蜞菊內(nèi)酯和旱蓮苷A的濃度分別為0.2688mg/ml,0.2812mg/ml。精密稱取墨旱蓮提取物16.77mg于IOml容量瓶，甲醇溶解定容，搖勻，即得。
[0060]③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取混合對照品溶液各1.00，1.25，1.5，1.75，2.0Oml于IOml量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述條件測定。以對照品溶液濃度X(Xl(T5mg/ml)為橫軸，峰面積Y為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蟛蜞菊內(nèi)酯的回歸方程為:Y=L 0459X-784.56 (R2 = 0.9905)，旱蓮苷 A 的回歸方程為:Y = 0.0793Χ-29.940 (R2 =0.9982)，分別在 0.02688 ~0.05376mg/ml 和 0.02812 ~0.05624mg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。 [0061]將供試品溶液按上述所述條件進(jìn)樣檢測，計算得總皂苷旱蓮苷A的含量為
11.30%和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為3.56%。
[0062]實施例2
[0063]墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取去除葉綠素等脂溶性成分，水溶液減壓濃縮成每毫升相當(dāng)于2.0g生藥的溶液，通過HP-20樹月旨，用乙醇-水梯度洗脫，依次采用30%，70%及90%乙醇洗脫，其中70%乙醇洗脫部位減壓干燥后，備用，用于抗肺纖維化活性研究。
[0064]按實施例1所述條件進(jìn)樣檢測，計算得總皂苷含量為53.24%，旱蓮苷A的含量為6.54%和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為1.46%。
[0065]實施例3
[0066]墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取去除葉綠素等脂溶性成分，水溶液減壓濃縮成每毫升相當(dāng)于2.0g生藥的溶液，得墨旱蓮極性提取物，_20°C冷藏保存?zhèn)溆?。實驗用?以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物，配制成藥液。
[0067]按實施例1中所述條件檢測，計算得總皂苷為45.2%，旱蓮苷A的含量為0.71%，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為0.26%。
[0068]實施例4
[0069]二、墨旱蓮提取物改善博萊霉素所致小鼠肺纖維模型
[0070]選取實施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。氣管內(nèi)注入博來霉素復(fù)制小鼠肺纖維化模型，是國際上普遍采用的一種方法，而且與人類肺間質(zhì)纖維化相近。
[0071]I材料與儀器ICR小鼠，雌性，體重18_22g，由南京市青龍山動物繁殖場提供。娃哈哈純凈水。羥脯氨酸試劑盒，南京建成生物工程研究所。醋酸潑尼松，批號120101，江蘇平光制藥有限責(zé)任公司。水合氯醛，批號20100813，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0072]2實驗方法 ICR雌性小鼠，分空白組，模型組，陽性藥組，墨旱蓮提取物按照劑量lOg/kg灌胃給藥，每組各20只。小鼠腹腔注射10ml/kg，4%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部。用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，用鑷子縱向鈍性撕開筋膜與肌肉，暴露氣管。注射器刺入氣管，空白組注入生理鹽水，其余各組均注入博來霉素(5mg/kg)。然后迅速將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)鼠板，觀察小鼠呼吸情況，旋轉(zhuǎn)后用75%酒精棉消毒頸部傷口，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l_2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。
[0073]造模后即日開始，空白組，模型組每天灌胃生理鹽水，陽性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松。取實施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物，分別灌胃10g/kg墨旱蓮提取物，連續(xù)灌胃28天。于28日，小鼠稱體重，摘眼球取血，血液流入1.5ml離心管中，靜置后，40C 3000rpm離心20min, -80°C保存?zhèn)溆?。取出肺組織,稱重,計算肺系數(shù),肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g)，見圖1A所示。另取各組實驗小鼠左上肺葉按照試劑盒說明書測定羥脯氨酸含量，結(jié)果見圖1B。取各組小鼠左下肺放入4%甲醛中固定，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，HE染色，Masson染色，觀察肺組織損傷及纖維化變化，造模28天后肺組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖2和3。
[0074]所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)土SD(x土s)表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計采用單因素方差分析(one-way AN0VA), P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0075]病理組織切片經(jīng)HE、Masson染色，結(jié)果表明對照組的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出物，肺泡腔未見炎性細(xì)胞浸潤，無成纖維細(xì)胞增生，對照組小鼠的肺組織內(nèi)可見 少量染成藍(lán)色的膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤急成纖維細(xì)胞增生，大量膠原沉積，肺纖維化形成，Masson染色后可見多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點，則說明實驗小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)實施例1-3所制備的墨旱蓮提取物治療后，可見小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔略增厚，炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。經(jīng)陽性藥物醋酸潑尼松治療后，陽性對照組小鼠肺泡間隔較寬，肺泡腔變窄，較多炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生，病變程度較模型組減輕。給藥各組及陽性藥與模型組相比，纖維化程度均減輕。(圖2和3)
[0076]3.總提取物對模型小鼠肺系數(shù)和肺組織HYP含量所產(chǎn)生的影響。
[0077]羥脯氨酸(HYP)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，約占膠原重量的14%，對膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，由于膠原是唯一含HYP較多的蛋白質(zhì)，因此，測定HYP含量能反映組織膠原的總量變化。造模之后的第14、28天測定肺系數(shù)，消化法檢測肺組織中HYP的含量。與正常對照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義$<0.01或0.05);與模型組小鼠肺系數(shù)相比較。給藥14、28天后，墨旱蓮提取物組和陽性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(P <0.01)，但實施例1-3所制備的墨旱蓮提取物組間不具有明顯差異(圖1A)。與對照組相比，28天時模型組肺組織HYP含量顯著增加(P < 0.01)，與模型組相比，實施例1和實施例2所制備的提取物可明顯降低肺組織中HYP含量(P < 0.05)，實施例3所制備的提取物的作用不明顯(圖1B)。提示實施例1-3所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，墨旱蓮提取物劑可降低模型肺組織膠原纖維含量，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度。[0078]4.墨旱蓮提取物對模型小鼠肺組織中NO，MDA、TGF- β I含量所產(chǎn)生的影響。
[0079]肺組織損傷則MDA產(chǎn)生增多，引起肺泡炎癥，炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)N0、TNF-a等及各種細(xì)胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過各種生長因子促進(jìn)膠原產(chǎn)生過度增多。本實驗按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測14、28天時各組肺組織N0、MDA含量。
[0080]實驗結(jié)果表明，與對照組比較，第14、28天模型組的NO、MDA含量均升高(P
<0.01)，陽性給藥組中反映肺損傷的MDA、N0含量明顯低于模型組，同樣，實施例1和實施例2法所制備的墨旱蓮提取物給藥組的NO、MDA含量也顯著下降(P < 0.01或0.05)(圖
4)，提示實施例1-2所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的改善模型小鼠的肺組織損傷程度。
[0081]采用ELISA法，在造模28天結(jié)束時檢測各組小鼠肺組織中TGF-β I的含量(圖
5)。與對照組相比，模型組的TGF-βI的含量顯著升高，而與模型組相比，灌胃給予實施例1和實施例2所制備的墨旱蓮提取物之后，模型小鼠肺組織中TGF-β I的含量均顯著降低(P
<0.05)，而灌胃給藥實施例3法制備的提取物之后，模型肺組織中TGF-β I含量變化不明顯。TGF-β I是組織纖維化中公認(rèn)的致纖維化因子，通過經(jīng)典的TGF-β 1/Smads途徑參與纖維化進(jìn)程，研究結(jié)果提示實施例1-2所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的降低TGF-β I含量，較好地干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化發(fā)展程度。
[0082]三、實施例1-3所制`備的墨旱蓮提取物對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響
[0083]肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化進(jìn)程中的效應(yīng)細(xì)胞，不是被動參與病程，成纖維細(xì)胞的增殖并且分化成肌成纖維細(xì)胞，這兩種細(xì)胞均可分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，肺內(nèi)的ECM主要由膠原、糖胺聚糖、纖連蛋白FN等構(gòu)成，在肺纖維化早期主要以III型膠原增加為主，晚期是以I型膠原增加為主。由于肺成纖維細(xì)胞異常增殖及膠原分泌增加在肺纖維化過程中起重要作用，抑制肺纖維化細(xì)胞過度增生和促進(jìn)其凋亡也成為防治肺纖維化的一種有效手段。
[0084]人胚肺成纖維細(xì)胞(HFLl)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。HFLl細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)基，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換I次培養(yǎng)基，細(xì)胞生長90%密度時用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并傳代。將實施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物分別命名為I號、2號、3號提取物。
[0085]實驗選用對數(shù)生長期細(xì)胞。采用MTT法考察不同濃度藥物對HFL-1的生長抑制作用。取對數(shù)生長細(xì)胞，胰蛋白酶消化，并接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為5 X IO4ceIΙ/ml，每孔細(xì)胞懸液200μ 1，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，棄原培養(yǎng)液，實驗組依次加入不同濃度的墨旱蓮提取物培養(yǎng)液，設(shè)立空白及陰性對照組，每組5個復(fù)孔，重復(fù)3次。分別作用48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20l.! 1，孵育4h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150μ 1DMS0，震蕩混勻后，在酶標(biāo)儀492nm波長處檢測各孔的吸光度。(如表1)。
[0086]表1不同濃度墨旱蓮提取物對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響(n = 5，48h，x土SD)
【權(quán)利要求】
1.墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于按質(zhì)量百分比計，墨旱蓮提取物中總皂苷含量在53.24-56.1%，提取物中旱蓮苷A的含量為6.54-11.30%，蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為1.46-3.56%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在所述的墨旱蓮提取物經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取方法制備而成，墨旱蓮提取物得率為10.01-15.05%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的墨旱蓮提取物由如下方法制得:墨旱蓮干燥地上部分，以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，減壓去除乙醇，得總浸膏；將總浸膏懸于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物及水部位，同時將乙酸乙酯部位通過HP-20吸附樹脂柱色譜進(jìn)行分離，分別獲得水洗脫部位、30 %乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位； 其中60%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位經(jīng)減壓干燥，以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物。
【文檔編號】A61P11/00GK103768117SQ201410044532
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張朝鳳, 許翔鴻, 張勉, 薛倩, 賀湘, 鄒倩 申請人:中國藥科大學(xué)