鴨出血性卵巢炎、禽流感（h9 亞型）二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鴨出血性卵巢炎、禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。該疫苗是針對(duì)國(guó)內(nèi)鴨養(yǎng)殖業(yè)中高發(fā)疫病中，鴨出血性卵巢炎和H9亞型禽流感混合感染的流行形勢(shì)，提出了一個(gè)有效應(yīng)對(duì)策略，并做到一次免疫同時(shí)防控兩種疾病。該疫苗利用鴨坦布蘇病毒和H9亞型禽流感病毒作為疫苗制備用毒株，經(jīng)過(guò)抗原液制備、滅活、濃縮、按照一定比例混合制備而成。本發(fā)明涉及到的鴨坦布蘇病毒和H9亞型禽流感病毒均為國(guó)內(nèi)流行菌毒株，能夠有效預(yù)防目前流行疾病。
【專利說(shuō)明】鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]鴨出血性卵巢炎是2010年我國(guó)新發(fā)生的一種以蛋鴨和種鴨突發(fā)性產(chǎn)蛋下降為主要特點(diǎn)的新型流行性疾病，主要導(dǎo)致卵泡變形、變性，卵泡膜充血、出血，輸卵管炎性病變。種鴨發(fā)病后種蛋的受精率和孵化率降低。商品肉鴨亦可感染，出現(xiàn)死淘率增加。該病自發(fā)生以來(lái)給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]在病原學(xué)鑒定中，疫病流行之初，曹貞貞、張存等最先報(bào)道新分離病毒與黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群(Ntaya virus group)的巴格扎病毒(Bagaza virus)具有相近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，但遺傳距離介于病毒種的水平(曹貞貞、張存等.鴨出血性卵巢炎的初步研究.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010,46(12):3 — 6.)。隨著病原學(xué)研究的深入，李澤君、蘇敬良等人的研究表明，新發(fā)病毒的E基因和NS5基因與坦布蘇病毒相應(yīng)基因的核苷酸同源性在88%以上，氨基酸同源性高達(dá)97%(李澤君.鴨坦布蘇病毒病病原的分離鑒定及生物學(xué)特性研究.中國(guó)家禽，2011,33(17):34-35.蘇敬良.引起鴨產(chǎn)蛋下降綜合征的BYD病毒感染研究.中國(guó)家禽，2011，33 (17):32-34.)。我們?cè)谀炒笮网唸?chǎng)的發(fā)病種鴨上分離到一株病毒一WFG36株。病毒全基因編碼序列的同源性分析表明，WFG36株病毒與坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的同源性高達(dá)90%,屬于同一個(gè)種的病毒。
[0004]禽流感(H9亞型)(Avain Influenza H9subtype)是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征，傳染性強(qiáng)，死亡率高，廣泛發(fā)生于世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重危害。
[0005]對(duì)于鴨出血性卵巢炎和禽流感(H9亞型)的防控，目前尚無(wú)特效藥物和療法，主要通過(guò)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和疫苗免疫等措施進(jìn)行預(yù)防和控制。國(guó)內(nèi)外已有上市的禽流感(H9亞型)單一傳統(tǒng)疫苗，未有鴨出血性卵巢炎疫苗和相關(guān)聯(lián)苗。由于兩種疾病是鴨業(yè)養(yǎng)殖中的高發(fā)疾病，均需要通過(guò)免疫疫苗進(jìn)行預(yù)防，為減少多次抓鴨的注射應(yīng)激，降低生產(chǎn)成本，我們?cè)趩我粶缁钜呙绲幕A(chǔ)上開(kāi)發(fā)出更好預(yù)防鴨出血性卵巢炎和禽流感(H9亞型)的二聯(lián)滅活苗
女口
廣叩ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于利用本發(fā)明人自行分離的一株鴨坦布蘇病毒和一株H9亞型禽流感病毒作為疫苗生產(chǎn)用毒株，制備一種鴨出血性卵巢炎、H9亞型禽流感二聯(lián)油乳劑疫苗，一次免疫即可有效預(yù)防鴨出血性卵巢炎和H9亞型禽流感兩種疾病，同時(shí)可以降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，減少勞動(dòng)強(qiáng)度，保證公眾健康。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:[0008]1.本發(fā)明涉及的一種鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗(或鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗)，其特征在于該二聯(lián)滅活疫苗同時(shí)含有滅活的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株和滅活的H9亞型禽流感病毒LGl株，其中鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusuvirus, DTMUV)WFG36 株(原命名為:黃病毒(DuckFlavivirus) WFG36 株)已于 2011 年 4 月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為:CGMCCN0.4718 ；H9亞型禽流感病毒LGl株為商品化疫苗，雞新城疫、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)毒種，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2010)150252152。
[0009]2.本發(fā)明所述鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗的制備方法為:
[0010](I)將鴨坦布蘇病毒CGMCCN0.4718株種毒接種易感雞胚，經(jīng)37°C孵育收獲胚體、胚液和絨毛尿囊膜，研磨混合制備成病毒液，加入甲醛溶液至總量(體積比)的0.1%，37°C滅活24小時(shí)；
[0011](2)取H9亞型禽流感病毒LGl株種毒接種9~11日齡健康易感雞胚孵育后無(wú)菌收獲雞胚尿囊液，凝集價(jià)低于1: 256 (微量法)者應(yīng)棄去；加入甲醛溶液至總量的0.1%，37 °C滅活48小時(shí)；
[0012](3)將滅活后的鴨坦布蘇病毒液和滅活后的H9亞型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鴨坦布蘇病毒含量不低于IO5 tlELD5tl, H9亞型禽流感病毒含量不低于IO7 0EID50 ;按常規(guī)法制備成油佐劑滅活疫苗。
[0013]3.給鴨接種有效劑量的鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗，能使接種鴨獲得特異免疫力，有效預(yù)防鴨出血性卵巢炎和H9亞型禽流感病毒感染。
【具體實(shí)施方式】
[0014]1.疫苗制備用毒株
[0015](I)病毒來(lái)源
[0016]疫苗制造及檢驗(yàn)用毒種鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株，由本發(fā)明人從山東地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)的種鴨體內(nèi)分離得到，并進(jìn)行鑒定、保管和供應(yīng)。該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為=CGMCC N0.4718。
[0017]疫苗制造及檢驗(yàn)用毒種H9亞型禽流感病毒LGl株，由本發(fā)明人自行分離、保存，并已經(jīng)商品化，產(chǎn)品名稱:雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2010) 150252152。
[0018](2)毒株特性
[0019]1) WFG36株的病毒含量
[0020]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-73個(gè)稀釋度分別經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚5枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，24小時(shí)之內(nèi)死亡胚棄去不計(jì)，24小時(shí)之后死亡雞胚隨時(shí)取出，置于4°C保存，觀察至168小時(shí)，根據(jù)雞胚死亡數(shù)計(jì)算ELD5tl，每0.1ml病毒含量應(yīng)≥106 0ELD50。
[0021]2) LGl株的病毒含量
[0022]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-83個(gè)稀釋度分別經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，48小時(shí)之內(nèi)死亡胚棄去不計(jì)，48~120小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120小時(shí)，取出所有活胚，逐個(gè)收獲雞胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1:128者判為感染，計(jì)算EID5tl，每0.1ml病毒含量應(yīng)> IO7 5EID500
[0023]3) WFG36株對(duì)雞胚的毒力
[0024]將毒種用滅菌生理鹽水作100倍稀釋，卵黃囊接種7日齡易感雞胚10枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，雞胚應(yīng)于接種后24~168小時(shí)死亡8枚以上，死亡胎兒出現(xiàn)全身性出血。
[0025]4) LGl株對(duì)雞胚的毒力
[0026]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚20枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，在接種后48~96小時(shí)內(nèi)，應(yīng)至少有15枚雞胚死亡。
[0027]2.生產(chǎn)用種毒的制備
[0028](I)鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株生產(chǎn)用種毒制備:將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如1:100或1:50)，卵黃囊接種6~7日齡易感雞胚，每胚0.1ml。置37°C繼續(xù)孵化至120小時(shí)，定時(shí)照胚，48小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚棄去，及時(shí)無(wú)菌收獲死亡雞胚尿囊液。將檢驗(yàn)無(wú)菌的病毒尿囊液，作為生產(chǎn)用毒種。定量分裝，注明收獲日期、毒種代次等。_70°C以下保存。
[0029](2)禽流感病毒LGl株毒種制備:將毒種用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1ml0選接種后24~96小時(shí)死亡雞胚，分別收獲雞胚液，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無(wú)菌且紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于1: 256的雞胚液混合，定量分裝，冷凍保存，注明收獲日期、毒種代次等。
[0030]3.制苗用病毒液的制備
[0031](1)鴨坦布蘇病毒液的制備:
[0032]種毒接種易感雞胚取生產(chǎn)用種毒，按每胚> IOi ciELD5tl的劑量接種易感雞胚，卵黃囊或尿囊腔途徑接種，每胚0.1ml。接種后用蠟燭封好針孔，置37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋；
[0033]孵育和觀察易感雞胚接種后每日照胚I次，棄去24小時(shí)內(nèi)的死亡胚，以后每隔6小時(shí)照胚一次，隨時(shí)取出死亡胚，置于2~8 °C保存。168小時(shí)孵育完成后，取出全部雞胚，置于2~8°C冷卻；
[0034]收獲病毒液將冷卻的雞胚取出，無(wú)菌收獲胚體、胚液和絨毛尿囊膜，研磨混合。研磨液過(guò)濾后取樣作無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。收獲的濾液滅活前置_15°C以下保存，應(yīng)不超過(guò)I個(gè)月。
[0035]滅活將檢驗(yàn)合格的鴨坦布蘇病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入甲醛溶液至總量的1%。，隨即充分混合升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。37°C滅活24小時(shí)后取出，放2~8°C保存，應(yīng)不超過(guò)1個(gè)月。
[0036](2) H9亞型禽流感病毒液的制備
[0037]接種取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9~11日齡健康易感雞胚，每胚0.1ml，接種后密封針孔，置36~37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。
[0038]孵育和觀察雞胚接種后，每日照胚I次，將24小時(shí)前死亡的雞胚棄去。以后每4~8小時(shí)照胚I次，死亡雞胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2~8°C冷卻。[0039]收獲將冷卻4~24小時(shí)的雞胚取出，無(wú)菌收獲雞胚尿囊液，死胚和活胚分別收獲(先收活胚后收死胚)，每若干個(gè)雞胚的胚液混合為一組。吸取胚液放于同一滅菌容器內(nèi)，每組抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。凝集價(jià)低于1: 256 (微量法)者應(yīng)棄去。胚液取樣作無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前置_15°C以下保存，應(yīng)不超過(guò)3個(gè)月。
[0040]滅活將檢驗(yàn)合格的H9亞型禽流感病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入甲醛溶液至總量的1%。，隨即充分混合升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。37°C滅活48小時(shí)后取出，放2~8°C保存，應(yīng)不超過(guò)I個(gè)月。
[0041]4.滅活疫苗的制備
[0042]油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加司本-806份，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30分鐘，冷卻后備用。
[0043]水相制備將檢驗(yàn)合格的鴨坦布蘇病毒液、H9亞型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鴨坦布蘇病毒含量不低于IO5 tlELD5tl, H9亞型禽流感病毒含量不低于IO7 0EID50 0取滅菌后的吐溫-80 4份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。
[0044]乳化取油相2份置乳化罐中，開(kāi)動(dòng)電機(jī)，慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份后，再以3000r/min攪拌60分鐘，在終止乳化前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。
[0045]5.成品檢驗(yàn)
[0046]I)性狀
[0047]外觀乳白色乳劑。
[0048]劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。
[0049]穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)≤0.5ml。
[0050]粘度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗Iml,令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時(shí)間,應(yīng)在8秒以內(nèi)。
[0051]2)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0052]3)安全檢驗(yàn)用7~14日齡健康易感鴨10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0053]4)效力檢驗(yàn)
[0054](I)鴨出血性卵巢炎部分效力檢驗(yàn)
[0055]取7~14日齡健康易感鴨20只，其中10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另外10只作為非免疫對(duì)照。21日后，每只鴨各肌肉注射WFG36株病毒液lml。攻毒后5日，剖檢，取脾臟進(jìn)行病毒分離。對(duì)照鴨應(yīng)至少8只為病毒分離陽(yáng)性，免疫鴨應(yīng)至少7只為病毒分離陰性。
[0056](2) H9亞型禽流感部分效力檢驗(yàn)
[0057]血清學(xué)方法用7~10日齡SPF雞15只，其中10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作對(duì)照。21日后，每只雞分別采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。免疫雞HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不低于1: 90.5 (微量法)，未免疫對(duì)照雞應(yīng)為陰性。[0058]免疫攻毒法用7~10日齡SPF雞20只，其中10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不免疫作為對(duì)照。21日后，用10倍稀釋的LGl株毒種進(jìn)行靜脈注射，每只雞0.2ml，攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，進(jìn)行病毒分離。免疫雞應(yīng)至少9只為病毒分離陰性；對(duì)照雞應(yīng)至少9只為病毒分離陽(yáng)性。
[0059]本發(fā)明涉及的微生物菌種
[0060]本發(fā)明涉及到的鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)WFG36株(原命名為:黃病毒(Duck Flavivirus) WFG36株)，由本發(fā)明人從山東地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)的種鴨體內(nèi)分離得到，并進(jìn)行鑒定、保管和供應(yīng)。該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,編號(hào)為:CGMCC N0.4718。
[0061]本發(fā)明涉及到的H9亞型禽流感病毒LGl株，由本發(fā)明人自行分離、保存，并已經(jīng)商品化，產(chǎn)品名稱:雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2010)150252152。
[0062]本發(fā)明的積極意義
[0063]本發(fā)明涉及一種鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。該疫苗是針對(duì)國(guó)內(nèi)鴨養(yǎng)殖業(yè)中高發(fā)疫病中，鴨出血性卵巢炎和H9亞型禽流感混合感染的流行形勢(shì)，提出了一個(gè)有效應(yīng)對(duì)策略，并做到一次免疫同時(shí)防控兩種疾病。該疫苗利用鴨坦布蘇病毒和H9亞型禽流感病毒作為疫苗制備用毒株，經(jīng)過(guò)抗原液制備、滅活、濃縮、按照一定比例混合制備而成。本發(fā)明涉及到的鴨坦布蘇病毒和H9亞型禽流感病毒均為國(guó)內(nèi)流行菌毒株，能夠有效預(yù)防目前流行疾病。
[0064]實(shí)施例
[0065]以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明要求的保護(hù)范圍構(gòu)成限制。
[0066]實(shí)施例1
[0067]——疫苗制備(以1208002批疫苗為例)
[0068]1.疫苗制備用毒株
[0069](I)病毒來(lái)源
[0070]疫苗制造及檢驗(yàn)用毒種鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株，由本發(fā)明人從山東地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)的種鴨體內(nèi)分離得到，并進(jìn)行鑒定、保管和供應(yīng)。該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為=CGMCC N0.4718。
[0071]疫苗制造及檢驗(yàn)用毒種H9亞型禽流感病毒LGl株，由本發(fā)明人自行分離、保存，并已經(jīng)商品化，產(chǎn)品名稱:雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2010) 150252152。
[0072](2)毒株特性
[0073]I) WFG36株的病毒含量
[0074]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_5、10_6、10_73個(gè)稀釋度分別經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚5枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，24小時(shí)之內(nèi)死亡胚棄去不計(jì)，24小時(shí)之后死亡雞胚隨時(shí)取出，置于4°C保存，觀察至168小時(shí)，根據(jù)雞胚死亡數(shù)計(jì)算ELD5tl，每0.1ml病毒含量≥106 0ELD50。[0075]2) LGl株的病毒含量
[0076]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_6、10_7、10_83個(gè)稀釋度分別經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，48小時(shí)之內(nèi)死亡胚棄去不計(jì)，48~120小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120小時(shí)，取出所有活胚，逐個(gè)收獲雞胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1:128者判為感染，計(jì)算EID5tl，每0.1ml病毒含量≥IO7 5EID500
[0077]3) WFG36株對(duì)雞胚的毒力
[0078]將毒種用滅菌生理鹽水作100倍稀釋，卵黃囊接種7日齡易感雞胚10枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，雞胚應(yīng)于接種后24~168小時(shí)死亡8枚以上，死亡胎兒出現(xiàn)全身性出
血。
[0079]4) LGl株對(duì)雞胚的毒力
[0080]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚20枚，0.1ml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，在接種后48~96小時(shí)內(nèi)，應(yīng)至少有15枚雞胚死亡。
[0081]2.生產(chǎn)用種毒的制備
[0082](I)鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株生產(chǎn)用種毒制備:將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如1:100或1:50)，卵黃囊接種6~7日齡易感雞胚，每胚0.1ml。置37°C繼續(xù)孵化至120小時(shí)，定時(shí)照胚，48小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚棄去，及時(shí)無(wú)菌收獲死亡雞胚尿囊液。將檢驗(yàn)無(wú)菌的病毒尿囊液，作為生產(chǎn)用毒種。定量分裝，注明收獲日期、毒種代次等。_70°C以下保存。
[0083](2)禽流感病毒LGl株毒種制備:將毒種用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1ml0選接種后24~96小時(shí)死亡雞胚，分別收獲雞胚液，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無(wú)菌且紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于1: 256的雞胚液混合，定量分裝，冷凍保存，注明收獲日期、毒種代次等。
[0084]3.制苗用病毒液的制備
[0085]( I)鴨坦布蘇病毒液的制備:
[0086]種毒接種易感雞胚取生產(chǎn)用種毒，按每胚> IOi ciELD5tl的劑量接種易感雞胚，卵黃囊或尿囊腔途徑接種，每胚0.lml。接種后用蠟燭封好針孔，置37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋；
[0087]孵育和觀察易感雞胚接種后每日照胚I次，棄去24小時(shí)內(nèi)的死亡胚，以后每隔6小時(shí)照胚一次，隨時(shí)取出死亡胚，置于2~8 °C保存。168小時(shí)孵育完成后，取出全部雞胚，置于2~8°C冷卻；
[0088]收獲病毒液將冷卻的雞胚取出，無(wú)菌收獲胚體、胚液和絨毛尿囊膜，研磨混合。研磨液過(guò)濾后取樣作無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。收獲的濾液滅活前置_15°C以下保存，應(yīng)不超過(guò)I個(gè)月。
[0089]滅活將檢驗(yàn)合格的鴨坦布蘇病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入甲醛溶液至總量的1%。，隨即充分混合升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。37°C滅活24小時(shí)后取出，放2~8°C保存，備用。
[0090](2) H9亞型禽流感病毒液的制備
[0091]接種取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9~11日齡健康易感雞胚，每胚0.1ml，接種后密封針孔，置36~37°C繼續(xù)孵育，不翻胚。
[0092]孵育和觀察雞胚接種后，每日照胚I次，將24小時(shí)前死亡的雞胚棄去。以后每4~8小時(shí)照胚I次，死亡雞胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2~8°C冷卻。
[0093]收獲將冷卻4~24小時(shí)的雞胚取出，無(wú)菌收獲雞胚尿囊液，死胚和活胚分別收獲(先收活胚后收死胚)，每若干個(gè)雞胚的胚液混合為一組。吸取胚液放于同一滅菌容器內(nèi)，每組抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。凝集價(jià)低于1: 256 (微量法)者應(yīng)棄去。胚液取樣作無(wú)菌檢驗(yàn)，為無(wú)菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前置_15°C以下保存?zhèn)溆谩?br> [0094]滅活將檢驗(yàn)合格的H9亞型禽流感病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入甲醛溶液至總量的1%。，隨即充分混合升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。37°C滅活48小時(shí)后取出，放2~8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0095]4.滅活疫苗的制備
[0096]油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加司本-806份，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30分鐘，冷卻后備用。
[0097]水相制備將檢驗(yàn)合格的鴨坦布蘇病毒液、H9亞型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鴨坦布蘇病毒含量不低于IO5 tlELD5tl, H9亞型禽流感病毒含量不低于IO7 0EID50 0取滅菌后的吐溫-80 4份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。
[0098]乳化取油相2份置乳化罐中，開(kāi)動(dòng)電機(jī)，慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份后，再以3000r/min攪拌60分鐘，在終止乳化前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，未出現(xiàn)分層。
[0099]實(shí)施例2
[0100]疫苗成品檢驗(yàn)( 以1208002批疫苗為例)
[0101]I)性狀
[0102]外觀乳白色乳劑。
[0103]劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。
[0104]穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相< 0.5ml ο
[0105]粘度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lml,令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時(shí)間,在8秒以內(nèi)。
[0106]2)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0107]3)安全檢驗(yàn)用7~14日齡健康易感鴨10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，未出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0108]4)效力檢驗(yàn)
[0109](I)鴨出血性卵巢炎部分效力檢驗(yàn)
[0110]取7~14日齡健康易感鴨20只，其中10只各肌肉注射疫苗0.3ml，另外10只作為非免疫對(duì)照。21日后，每只鴨各肌肉注射WFG36株病毒液lml。攻毒后5日，剖檢，取脾臟進(jìn)行病毒分離。對(duì)照鴨9/10只病毒分離陽(yáng)性，免疫鴨7/10只病毒分離陰性。
[0111](2) H9亞型禽流感部分效力檢驗(yàn)
[0112]血清學(xué)方法:用7~10日齡SPF雞15只，其中10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作對(duì)照。21日后，每只雞分別采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。免疫雞HI抗體效價(jià)的幾何平均值為1: 126 (微量法)，未免疫對(duì)照雞均為陰性。
[0113]免疫攻毒法:用7~10日齡SPF雞20只，其中10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗
0.2ml，另10只不免疫作為對(duì)照。21日后，用10倍稀釋的LGl株毒種進(jìn)行靜脈注射，每只雞
0.2ml，攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，進(jìn)行病毒分離。免疫雞9/10只病毒分離陰性；對(duì)照雞10/10只病毒分尚陽(yáng)性。
[0114]實(shí)施例3
[0115]——鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗安全試驗(yàn)
[0116]1.材料
[0117]試驗(yàn)用疫苗 3批鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，批號(hào)為1208001、1208002、1208003。500 羽份 / 瓶。
[0118]疫苗保存條件及有效期2~8°C保存，有效期為12個(gè)月。
[0119]2.方法
[0120](I) SPF雛鴨安全性試驗(yàn)
[0121]I) 一次單劑量接種安全試驗(yàn)
[0122]取40只7日齡SPF鴨，`每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.3ml/只(含I羽份)。另10只等量注射生理鹽水做為對(duì)照組。觀察14日，每日記錄雛鴨的精神狀態(tài)、飲食及糞便性狀，接種部位有無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。第14日時(shí)全部剖殺，觀察各臟器有無(wú)病理變化。
[0123]2)單劑量重復(fù)接種安全試驗(yàn)
[0124]取40只7日齡SPF鴨，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.3ml/只(含I羽份)。另10只等量注射生理鹽水做為對(duì)照組。間隔2周后重復(fù)接種I次。觀察14日，每日記錄雛鴨的精神狀態(tài)、飲食及糞便性狀，接種部位有無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。第14日時(shí)全部剖殺，觀察各臟器有無(wú)病理變化。
[0125]3)超劑量接種安全試驗(yàn)
[0126]取40只7日齡SPF鴨，每批疫苗胸部肌肉注射10只，1.5ml/只(含5羽份)。另10只等量注射生理鹽水做為對(duì)照組。觀察14日，每日記錄雛鴨的精神狀態(tài)、飲食及糞便性狀，接種部位有無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。第14日時(shí)全部剖殺，觀察各臟器有無(wú)病理變化。
[0127](2)產(chǎn)蛋鴨安全性試驗(yàn)
[0128]I)單劑量接種安全試驗(yàn)
[0129]取40只產(chǎn)蛋鴨，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.5ml/只(含I羽份)。另10只等量注射生理鹽水做為對(duì)照組。觀察14日，每日記錄產(chǎn)蛋鴨的精神狀態(tài)、飲食、糞便性狀及產(chǎn)蛋數(shù)。第14日時(shí)，觀察接種部位有無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。
[0130]2)單劑量重復(fù)接種安全試驗(yàn)
[0131]取40只產(chǎn)蛋鴨，每批疫苗胸部肌肉注射10只，0.5ml/只(含I羽份)。另10只等量注射生理鹽水做為對(duì)照組。間隔2周后重復(fù)接種I次。觀察14日，每日記錄產(chǎn)蛋鴨的精神狀態(tài)、飲食、糞便性狀及產(chǎn)蛋數(shù)。第14日時(shí)，觀察接種部位有無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。
[0132]3)超劑量接種安全試驗(yàn)
[0133]取40只產(chǎn)蛋鴨，每批疫苗胸部肌肉注射10只，2.0ml/只(含4羽份)。另10只等量注射生理鹽水做為對(duì)照組。觀察14日，每日記錄產(chǎn)蛋鴨的精神狀態(tài)、飲食、糞便性狀及產(chǎn)蛋數(shù)。第14日時(shí)，觀察接種部位有無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。
[0134]3.結(jié)果
[0135](I)SPF雛鴨安全性試驗(yàn)3批鴨出血性卵巢炎、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗對(duì)SPF雛鴨的單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和超劑量接種后安全試驗(yàn)結(jié)果表明，在觀察期間接種鴨精神、飲食、糞便等均正常，接種部位無(wú)腫塊、潰瘍等不良反應(yīng)。剖檢無(wú)特征性病理變化。具體結(jié)果見(jiàn)表1、表2和表3。
[0136]表1疫苗對(duì)雛鴨的單劑量接種試驗(yàn)結(jié)果
[0137]
【權(quán)利要求】
1.一種鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該二聯(lián)滅活疫苗含有并同時(shí)含有滅活的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株和滅活的H9亞型禽流感病毒LGl株，其中鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株已于2011年4月12日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為=CGMCCN0.4718 ；H9亞型禽流感病毒LGl株為商品化疫苗雞新城疫、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)毒種，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2010) 150252152。
2.如權(quán)利要求1所述一種鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于: (1)將鴨坦布蘇病毒CGMCCN0.4718株種毒接種易感雞胚，經(jīng)37°C孵育收獲收獲胚體、胚液和絨毛尿囊膜，研磨混合制備成病毒液，加入甲醛溶液至總量的0.1% (V/V)，37°C滅活24小時(shí)； (2)取H9亞型禽流感病毒LGl株種毒接種9~11日齡健康易感雞胚孵育后無(wú)菌收獲雞胚尿囊液，凝集價(jià)微量法低于1: 256者應(yīng)棄去；加入甲醛溶液至總量的0.1%，37°C滅活48小時(shí)； (3)將滅活后的鴨坦布蘇病毒液和滅活后的H9亞型禽流感病毒液等量混合，使0.1ml水相中鴨坦布蘇病毒含量不低于105_°ELD5(1、H9亞型禽流感病毒含量不低于IO7 tlEID5tl ;按常規(guī)法制備成油佐劑滅活疫苗。
3.如權(quán)利要求1所述鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗的應(yīng)用，其特征在于:給鴨接種有效劑量的鴨出血性卵巢炎、禽流感H9亞型二聯(lián)滅活疫苗，能使接種鴨獲得對(duì)鴨出血性卵巢炎和H9亞型禽流 感病毒國(guó)內(nèi)流行毒株產(chǎn)生有效預(yù)防的免疫力。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103768591SQ201410052625
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】張青嬋, 彭建云, 張中波, 吳昊, 王蕾, 劉紅娟, 徐龍濤, 禚寶山, 鮑海忠 申請(qǐng)人:齊魯動(dòng)物保健品有限公司