一種包含茚達(dá)特羅和噻托溴銨的藥物組合產(chǎn)品的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及吸入/口服茚達(dá)特羅或其藥學(xué)上可接受的鹽聯(lián)合吸入噻托溴銨或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合，該藥物組合產(chǎn)品用于同時(shí)、順序或分別給藥，用于呼吸道疾病或其癥狀的治療或預(yù)防治療，尤其是那些伴隨阻塞或炎癥的疾病如慢性阻塞性肺?。–OPD）或哮喘的治療。【專利說明】一種包含茚達(dá)特羅和噻托溴銨的藥物組合產(chǎn)品發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及吸入/口服茚達(dá)特羅聯(lián)合吸入噻托溴銨的組合，該藥物組合產(chǎn)品用于同時(shí)、順序或分別給藥，用于呼吸道疾病或其癥狀的治療或預(yù)防治療，尤其是那些伴隨阻塞或炎癥的疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘的治療。[0002]發(fā)明背景[0003]支氣管哮喘，在工業(yè)化國家中影響多達(dá)10%的個體，其特征在于支氣管收縮，慢性支氣管炎，氣道反應(yīng)過度，和粘膜水腫。氣道改造和改變的非膽堿能、非腎上腺素能神經(jīng)傳遞可以引起不可逆的氣道阻塞和肺功能減退。在過去20年中支氣管炎哮喘作為全世界的主要公眾健康問題出現(xiàn)。盡管數(shù)據(jù)表明目前的哮喘治療導(dǎo)致死亡率有限的降低，但其持續(xù)作為重要的健康護(hù)理問題，其仍然是全世界可預(yù)防的住院治療的主導(dǎo)原因之一。隨著哮喘發(fā)明率的提高，與該疾病相關(guān)的成本也顯著提高。[0004]慢性阻塞性肺病(COPD)也是非常常見的。該疾病的特征在于伴隨炎癥反應(yīng)的漸進(jìn)性氣流受限。從全世界的數(shù)據(jù)調(diào)查來看，煙草并不是導(dǎo)致COPD的唯一原因。全世界上升中的年齡也是特定的風(fēng)險(xiǎn)因素。COPD的發(fā)病率存在變化，在3%至10%之間，具有穩(wěn)定上升的趨勢。盡管COPD是呼吸道疾病死亡的主導(dǎo)原因，并使人們漸漸認(rèn)識到其是公眾健康問題的核心所在，CCffD上升的死亡率和大部分心血管疾病死亡率的下降成為公眾最為關(guān)心的問題(Hurd，Chest2000;117(增補(bǔ)2):1S_4S)。此外，CCffD給公眾和社會增添了顯著的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。[0005]目前，患者存在氣道炎癥是誘發(fā)哮喘的主要原因之一。哮喘的病理生理學(xué)涉及分子和細(xì)胞相互作用的復(fù)雜機(jī)理，盡管每個單位因素的影響在患者與患者之間很可能是不同的，其取決于環(huán)境和刺激效果。哮喘表型發(fā)展中的主要參與者包括引發(fā)刺激物如過敏原本身，細(xì)胞如T細(xì)胞，上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞，這些細(xì)胞產(chǎn)生包括IL-5，GM-CSF,IL_3，IL-4和IL-13的多種細(xì)胞因子和趨化因子如嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，粘附分子等。哮喘炎癥和免疫機(jī)理方面的研究進(jìn)展已表明許多潛在的治療手段可以防止或逆轉(zhuǎn)哮喘中基礎(chǔ)性的異常反應(yīng)。[0006]總而言之，關(guān)于COPD的發(fā)病機(jī)理相較哮喘要少一些。最近研究表明已極大擴(kuò)展對COPD潛在發(fā)病機(jī)理的了解，認(rèn)可COPD也是一種炎性疾病。從目前發(fā)病機(jī)理觀點(diǎn)來看，嗜中性粒細(xì)胞，CD8+淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其介質(zhì)可能在COPD的發(fā)病機(jī)理中起著決定性作用。[0007]目前的治療和預(yù)防方法均聚焦于COF1D患者肺功能的改善。藥物治療仍是治療哮喘的主要手段?；颊呖衫枚绦Ш烷L效吸入β2-腎上腺素能受體激動劑。目前短效β2-腎上腺素能受體激動劑基于按需使用來用于癥狀的快速緩解。近些年來，長效的吸入β2_腎上腺素能受體激動劑在哮喘控制中具有日益提高的作用，尤其是針對中重度的哮喘患者。[0008]其次，便是停止吸煙，減少或停止吸煙可以使一些呼吸參數(shù)得到改善。支氣管擴(kuò)張藥(β2-腎上腺素能受體激動劑和抗膽堿能藥)目前是其癥狀治療的主要手段。但尚未解決COPD的抗炎治療。在過去20年中已經(jīng)可觀地增加了對COPD的全身和吸入糖皮質(zhì)激素的使用。他們已經(jīng)得到測試，前提是對CCffD中炎癥的干預(yù)應(yīng)當(dāng)改變疾病的進(jìn)程。盡管吸入的皮質(zhì)類固醇在哮喘控制中確具益處，但是直至最近，他們在非哮喘性的與吸煙相關(guān)的COPD中的效用是沒有證據(jù)基礎(chǔ)的(Bonay等，DrugSaf2002:25:57-71)。吸入的糖皮質(zhì)激素對表征COPD的炎癥過程具有相對小的影響(Adcock和Chung,CurrOpinInvestingDrugs2002；3:58-60)。因此，他們適用于存在顯著的支氣管擴(kuò)張藥反應(yīng)或患者具有伴隨頻繁加重的更嚴(yán)重疾病(Alsaeedi等，AmJMed2002;113:59_65)。[0009]氣流阻塞和氣道炎癥是哮喘以及COPD的特征。盡管哮喘和COPD中的氣道炎癥各自涉及不同的細(xì)胞類型，但都是與細(xì)胞侵潤和激活相關(guān)的慢性炎癥性質(zhì)的疾病。盡管支氣管哮喘的主要特征在于嗜酸性粒細(xì)胞和CD4淋巴細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞、CD8淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在COPD的發(fā)病機(jī)理中起主要作用。因此，涉及平滑肌松弛并且也在嗜酸性粒細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞和其他炎性和免疫活性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的PDE可能構(gòu)成兩種疾病進(jìn)展中的基礎(chǔ)元素。這些疾病發(fā)病機(jī)理中涉及的許多事件和機(jī)理受到環(huán)核苷酸信號途徑激活的抑制。因此，胞內(nèi)cAMP的增加干擾了淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞激活，并且阻斷了細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞復(fù)制和細(xì)胞趨向炎癥部位。此外，氣道平滑肌細(xì)胞中cAMP信號途徑的激活促進(jìn)了松弛并阻斷了平滑肌細(xì)胞的復(fù)制(Tomlinson等，BiochemPharmacoll995;49:1809-19),由此防止了疾病慢性階段中觀察到的氣道改造。[0010]已經(jīng)認(rèn)可抗膽堿藥物治療可以作為CCffD和慢性哮喘中的重要治療方式。本發(fā)明中所使用的抗膽堿能支氣管擴(kuò)張藥一毒蕈堿受體拮抗劑，是長效化合物?？苟巨A藥物在緩解哮喘發(fā)作中的有效性比β2-腎上腺素能受體激動劑低(Rodrigo和Rodrigo,Chest2002;121:1977-87)。然而，隨著新抗膽堿能藥噻托溴銨的引入，在呼吸道疾病中極大地增加使用抗膽堿能藥。而老的抗膽堿藥，如格隆溴銨易產(chǎn)生副作用，而噻托溴銨具有更強(qiáng)的抗粘液分泌能力，從而可有效地治療和減輕患者哮喘和COPD的病癥，具有更好的療效。[0011]噻托溴銨，即6β—環(huán)氧一3α-[α—羥基一2，2—二(α—噻吩)乙酰氧基]—8，8一二甲基一12Η，5αH一莨菪烷溴化物，為特異選擇性的抗膽堿藥物，具有毒蕈堿受體亞型MI~Μ5類似的親和力，它通過抑制平滑肌M3受體，產(chǎn)生支氣管擴(kuò)張作用。在臨床前的活體外和活體內(nèi)的研究中顯示，噻托溴銨吸入后產(chǎn)生支氣管擴(kuò)張作用多半是位點(diǎn)專一效應(yīng)。臨床研究表明，噻托溴銨能顯著改善早、晚峰值呼氣流速(PEFR)。并且在I年的給藥期內(nèi)一直保持其支氣管擴(kuò)張作用，而無耐受現(xiàn)象發(fā)生。此外，還能顯著改善呼吸困難。噻托溴銨，一種對M3-毒蕈堿受體具有特定偏好的長效抗膽堿能藥，目前已經(jīng)引入全世界。美國專利US5610163記載了噻托溴銨在治療慢性阻塞性肺病中的用途。[0012]茚達(dá)特羅為支氣管舒張劑，屬于長效吸入β2-腎上腺素能受體激動劑(LABA)類，適用于成人慢性阻塞性肺病(COPD)患者的維持治療。具有5分鐘起效、持續(xù)24小時(shí)的特點(diǎn)。茚達(dá)特羅由瑞士諾華制藥公司生產(chǎn)，2009年以來已在全球70多個國家和地區(qū)上市；2012年6月經(jīng)國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)在華上市，是我國首個獲批用于治療COPD的LABA類單一制劑。臨床試驗(yàn)表明，茚達(dá)特羅每天服用一次可以使支氣管舒張達(dá)24h以上，其舒張支氣管時(shí)間比沙美特羅和福莫特羅長；起效比沙美特羅更快。[0013]現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過茚達(dá)特羅或其藥學(xué)上可接受的鹽和噻托溴銨或其藥學(xué)上可接受的鹽進(jìn)行聯(lián)合治療，即二者的組合產(chǎn)品，可以在治療炎性或阻塞性氣道疾病時(shí)獲得出人意料的治療益處，特別是協(xié)同的治療益處。例如，與單獨(dú)使用茚達(dá)特羅或噻托溴銨進(jìn)行治療相t匕，使用該聯(lián)合療法，即二者的組合產(chǎn)品可以明顯降低達(dá)到給定治療效果所需的劑量，從而大大減少了可能的不利副作用?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]一方面，本發(fā)明涉及的聯(lián)合治療包括給藥β2-腎上腺素能受體激動劑茚達(dá)特羅或其藥學(xué)上可接受的鹽和長效抗膽堿支氣管擴(kuò)張藥噻托溴銨或其藥學(xué)上可接受的鹽來防止肺疾病事件的發(fā)作或來治療現(xiàn)存的疾病和來減輕氣道炎癥?？梢砸詥蝹€劑型一起給藥，或以不同的劑型來給藥?？梢酝瑫r(shí)給藥，或者以接近或遠(yuǎn)離的時(shí)間給藥，如其中一種藥物在早上給藥，第二種藥物在晚上給藥?？梢灶A(yù)防性地或在癥狀發(fā)作后使用該組合產(chǎn)品。一些情況中，該組合可用于防止肺病的進(jìn)展或來停滯功能如肺功能的衰退。[0015]本發(fā)明所述茚達(dá)特羅藥學(xué)上可接受的鹽為馬來酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、苯磺酸鹽、蘋果酸鹽、枸櫞酸鹽、或琥珀酸鹽。[0016]本發(fā)明所述組合產(chǎn)品，噻托溴銨和茚達(dá)特羅，通常作為氣溶膠給藥，使用或不使用推進(jìn)劑，或作為吸入的粉末給藥，例如使用Novolizer?。本發(fā)明涉及以一種傳送形式如吸入器來共同給藥兩種藥物，將兩種藥物放入相同的吸入器中。制劑是本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的(例如，含有賦形劑如乳糖單水合物)。[0017]在一些實(shí)施方案，活性組分可以一天給予1-5次，足以呈現(xiàn)所需的活性。在另一些實(shí)施方案，活性組分一天給予約1-3次；在另一些實(shí)施方案，活性組分一天給予I次。[0018]在一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述局部應(yīng)用的藥物組合產(chǎn)品中，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為300~8000μg/天，噻托溴銨的日劑量為30~3000μg/天。[0019]在另外一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述局部應(yīng)用的藥物組合產(chǎn)品中，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為300~5000μg/天，噻托溴銨的日劑量為50~2000μg/天。[0020]在另一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述局部應(yīng)用的藥物組合產(chǎn)品中，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為500~3000μg/天，噻托溴銨的日劑量為50~1000μg/天。[0021]在另一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述局部應(yīng)用的藥物組合產(chǎn)品中，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為1000μg/天，噻托溴銨的日劑量為50μg/天。[0022]另一方面，本發(fā)明涉及一種治療呼吸道疾病的藥物，包含局部應(yīng)用的噻唑溴銨或其藥學(xué)上可接受的鹽和茚達(dá)特羅或其藥學(xué)上可接受的鹽。[0023]在一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述藥物為含或不含推進(jìn)劑的可吸入氣溶膠。[0024]在另一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述的藥物為可吸入的干粉。[0025]在另一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述的藥物，其中，活性物質(zhì)存在于固定或自由組合中，用于與賦形劑一起再適于吸入應(yīng)用的藥物形式中同時(shí)、順次或分開給藥。[0026]考慮同時(shí)或時(shí)間上非常接近地給藥兩種活性劑?；蛘撸环N藥物可在早上服用，一種在這天中的晚些時(shí)候服用?；蛘邽榱硪环N情況，一種藥物每日服用兩次，另一種每日一次，與每日兩次給藥中的一次或同時(shí)或分開。或者，同時(shí)一起服用兩種藥物。[0027]本發(fā)明所述的賦形劑包括，但并不限于，離子交換劑，鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，如人血清蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠體硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸脂，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯-阻斷聚合體，羊毛月旨，糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素和它的衍生物如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和乙酸纖維素；樹膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；輔料如可可豆脂和栓劑蠟狀物；油如花生油，棉子油，紅花油，麻油，橄欖油，玉米油和豆油；二醇類化合物，如丙二醇和聚乙二醇；酯類如乙基油酸酯和乙基月桂酸酯；瓊脂；緩沖劑如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原的水；等滲鹽；林格(氏)溶液；乙醇，磷酸緩沖溶液，和其他無毒的合適的潤滑劑如月桂硫酸鈉和硬脂酸鎂，著色劑，釋放劑，包衣衣料，甜味劑，調(diào)味劑和香料，防腐劑和抗氧化劑。[0028]本發(fā)明所使用的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明的化合物的有機(jī)鹽和無機(jī)鹽。藥學(xué)上可接受的鹽在所屬領(lǐng)域是為我們所熟知的，如文獻(xiàn):S.MBergeetal.，describepharmaceuticallyacceptablesaltsindetailinJ.PharmaceuticalSciences,1977,66:1-19.所記載的。藥學(xué)上可接受的無毒的酸形成的鹽包括，但并不限于，與氨基基團(tuán)反應(yīng)形成的無機(jī)酸鹽有鹽酸鹽，氫溴酸鹽，磷酸鹽，硫酸鹽，高氯酸鹽，和有機(jī)酸鹽如乙酸鹽，草酸鹽，馬來酸鹽，酒石酸鹽，檸檬酸鹽，琥珀酸鹽，丙二酸鹽，或通過書籍文獻(xiàn)上所記載的其他方法如離子交換法來得到這些鹽。其他藥學(xué)上可接受的鹽包括己二酸鹽，藻酸鹽，抗壞血酸鹽，天冬氨酸鹽，苯磺酸鹽，苯甲酸鹽，重硫酸鹽，硼酸鹽，丁酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊基丙酸鹽，二葡萄糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，甲酸鹽，反丁烯二酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘油磷酸鹽，葡萄糖酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基-乙磺酸鹽，乳糖醛酸鹽，乳酸鹽，月桂酸鹽，月桂基硫酸鹽，蘋果酸鹽，丙二酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，硝酸鹽，油酸鹽，棕櫚酸鹽,撲酸鹽,果膠酸鹽,過硫酸鹽,3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，特戊酸鹽，丙酸鹽，硬脂酸鹽，硫氰酸鹽，對甲苯磺酸鹽，十一酸鹽，戊酸鹽，等等。通過適當(dāng)?shù)膲A得到的鹽包括堿金屬，堿土金屬，銨和N+((V4烷基)4的鹽。本發(fā)明也擬構(gòu)思了任何所包含N的基團(tuán)的化合物所形成的季銨鹽。水溶性或油溶性或分散產(chǎn)物可以通過季銨化作用得到。堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉，鋰，鉀，鈣，鎂，等等。藥學(xué)上可接受的鹽進(jìn)一步包括適當(dāng)?shù)?、無毒的銨，季銨鹽和抗平衡離子形成的胺陽離子，如鹵化物，氫氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1^8磺酸化物和芳香磺酸化物。[0029]本發(fā)明所涉及的“藥物組合產(chǎn)品”、“組合產(chǎn)品”、“藥物組合”“聯(lián)合治療”、“聯(lián)合應(yīng)用”或“聯(lián)合”的含義應(yīng)被理解為各組分可以以本身已知和常用的方式同時(shí)給藥(以組合藥物的形式)、或多或少地同時(shí)給藥(由獨(dú)立的包裝單位來進(jìn)行)或相繼給藥(直接相繼給藥或者以相對較大的時(shí)間間隔相繼給藥)。例如，可以早上給一種藥，在當(dāng)天的隨后時(shí)間給一種藥?；蛘咴诹硪环N方案中，一種藥物可以每天給藥兩次而另一種藥物每天給藥一次，其作為一天兩次的劑量之一同時(shí)進(jìn)行或者單獨(dú)進(jìn)行。[0030]本發(fā)明中“聯(lián)合治療”或“聯(lián)合”的含義特別可以理解為兩種組分以協(xié)同方式一同起效。實(shí)施例[0031]實(shí)施例1[0032]每單次劑量50μg噻托溴銨和1000μg茚達(dá)特羅的粉末吸入[0033]將50g量的微粉化噻托溴銨和100gα乳糖單水合物混合，將混合物通過0.5mm網(wǎng)孔的篩子過篩，最后再次混合。將1000g微粉化的茚達(dá)特羅和2000ga乳糖單水合物混合，將混合物通過0.8_網(wǎng)孔的篩子過篩，最后再次混合。將收到的兩種混合物混合并補(bǔ)充α乳糖單水合物至13500g。隨后，將其再次混合并將收到的粉狀混合物裝入每單次劑量釋放24mg粉末的粉末吸入器中。每單位劑量從粉末吸入器中釋放50μg噻托溴銨和1000μg茚達(dá)特羅，并提供給患者的氣道。[0034]實(shí)施例2[0035]每單次劑量50μg噻托溴銨和500μg茚達(dá)特羅的粉末吸入[0036]將50g量的微粉化噻托溴銨和100gα乳糖單水合物混合,將混合物通過0.5mm網(wǎng)孔的篩子過篩，最后再次混合。將500g微粉化的茚達(dá)特羅和1000ga乳糖單水合物混合，將混合物通過0.8_網(wǎng)孔的篩子過篩，最后再次混合。將收到的兩種混合物混合并補(bǔ)充α乳糖單水合物至12000g。隨后，將其再次混合并將收到的粉狀混合物裝入每單次劑量釋放12mg粉末的粉末吸入器中。每單位劑量從粉末吸入器中釋放50μg噻托溴銨和500μg茚達(dá)特羅，并提供給患者的氣道。[0037]生物試驗(yàn)[0038]使用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)研究了噻托溴銨聯(lián)合茚達(dá)特羅對TNF分泌的影響。[0039]通過密度梯度離心從健康捐獻(xiàn)者的肝素化血樣中分離PBMC。將等體積的Hanks緩沖液(LifeTechnologies,Heidelberg,Germany)加入肝素化的全血樣品中。用最大的40ml的血液/Hanks混合物覆蓋15mlHistopaque-1077(Sigma,Deisenhofen,Germany),室溫離心30分鐘(2000rpm)。將含有PBMC的可見條帶轉(zhuǎn)移至新鮮的管中并用Hanks緩沖液洗漆兩次。最后，將細(xì)胞接種于含有GlutamaxI(GibcoBRL,Eggenstein)和10%胎牛血清(BoehringerMannheim,Penzberg,Germany)的RPMI1640培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Heidelberg，Germany)中。分離后，將PBMC在補(bǔ)充10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C5%C02過夜。通過粘附方法從其他細(xì)胞中分離出PBMC，通過更換培養(yǎng)基除去非附著細(xì)胞。[0040]將細(xì)胞以IO6細(xì)胞/ml重懸浮并在24-孔組織培養(yǎng)板(FalconBectonDicknsonLabware)中以500μI體積37V5%C02溫育。用測試物質(zhì)(0.5μ1/500μI培養(yǎng)基)預(yù)溫育30分鐘后，用脂多糖(LPS)(lyg/ml)刺激細(xì)胞。在所示的時(shí)間，通過離心將細(xì)胞沉淀，收集上層清液并在-80°C保持冷凍直至蛋白質(zhì)測定；通過RLT裂解緩沖液(Qiagen,Hilden,Germany)裂解細(xì)胞并在_80°C冷凍直至分析。[0041]通過夾層ELISA使用匹配的抗體對(Pharmingen,Heidelberg,Germany)來進(jìn)行培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子測量，用在PH9.5，0.1M碳酸鹽緩沖液中的抗細(xì)胞因子單克隆抗體(mAb)將ELISA板(Maxisorb,Nunc)包被過夜。洗漆后，用測定稀釋液(Pharmingen,Heidelberg,Germany)將平板封閉I小時(shí)并再次洗漆。將適當(dāng)稀釋的上清液樣品和標(biāo)準(zhǔn)品一式兩份分配，并將平板在室溫溫育2小時(shí)。將平板洗滌，用工作檢測劑(生物素化的抗細(xì)胞因子抗體和抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物)溫育I小時(shí)。洗滌后，加入底物(TMB和過氧化氫)。通過加入IMH3PO4來停止反應(yīng)。將平板在微平板閱讀器(Dynatech)中以450nm讀板。將結(jié)果表示為化合物不存在下經(jīng)刺激細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的對照水平的百分比。[0042]LPS-刺激后，從單核細(xì)胞釋放的基礎(chǔ)TNFα從280pg/ml提高至8000pg/ml。噻托溴銨單獨(dú)沒有影響LPS-誘導(dǎo)的TNFa釋放，直至10μmol/Ι。β2-腎上腺素能受體激動劑茚達(dá)特羅明顯抑制了TNFa釋放。茚達(dá)特羅的IC35值等于50.6±10.3nmol/l。同時(shí)加入10μmol/1噻托溴銨令人驚訝地發(fā)現(xiàn),其顯著地將IC35降低至0.56±1.10nmol/l。[0043]這些結(jié)果表明，噻托溴銨以超加性方式顯著地和令人驚訝地增強(qiáng)了茚達(dá)特羅的抗炎活性。[0044]抗膽堿能藥和吸入/口服β2-腎上腺素能受體激動劑兩者均可有效地用于治療各種哺乳動物的氣道疾病。激活的嗜中性粒細(xì)胞募集至CCffD馬的肺，可以引起炎癥和肺損傷。已經(jīng)證明β2-腎上腺素能受體激動劑可以降低CCffD馬體內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞活化。[0045]最后，需要注意的是，還有其他方式用來實(shí)施本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明的實(shí)施例是將作為例證進(jìn)行說明，但并不限于本發(fā)明所描述的內(nèi)容，還可能是在本發(fā)明范圍內(nèi)所作的修改或在權(quán)利要求中所添加的等同內(nèi)容。本發(fā)明所引用的所有出版物或?qū)＠紝⒆鳛楸景l(fā)明的參考文獻(xiàn)?！緳?quán)利要求】1.局部應(yīng)用的茚達(dá)特羅或其藥學(xué)上可接受的鹽和噻托溴銨或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合產(chǎn)品，用于治療支氣管哮喘或慢性阻塞性肺病。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合產(chǎn)品，其中，茚達(dá)特羅藥學(xué)上可接受的鹽為馬來酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、苯磺酸鹽、蘋果酸鹽、枸櫞酸鹽、或琥珀酸鹽。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合產(chǎn)品，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為300~8000μg/天，噻托溴銨的日劑量為30~3000μg/天。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合產(chǎn)品，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為300~5000μg/天，噻托溴銨的日劑量為50~2000μg/天。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合產(chǎn)品，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為500~3000μg/天，噻托溴銨的日劑量為50~1000μg/天。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合產(chǎn)品，其中，茚達(dá)特羅的日劑量為1000μg/天，噻托溴銨的日劑量為SOyg/天。7.一種治療呼吸道疾病的藥物，包含局部應(yīng)用的噻唑溴銨或其藥學(xué)上可接受的鹽和茚達(dá)特羅或其藥學(xué)上可接受的鹽。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物，其為含或不含推進(jìn)劑的可吸入氣溶膠。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物，其為可吸入的干粉。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的藥物，其中，活性物質(zhì)存在于固定或自由組合中，用于與賦形劑一起再適于吸入應(yīng)用的藥物形式中同時(shí)、順次或分開給藥?！疚臋n編號】A61K9/72GK103784449SQ201410055085【公開日】2014年5月14日申請日期:2014年2月18日優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日【發(fā)明者】代先慧,張緒偉,劉英勛,冷玲申請人:青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院