密碼子優(yōu)化的mg53蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種密碼子優(yōu)化的MG53蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應(yīng)用；本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域/生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及密碼子優(yōu)化的MG53蛋白的編碼核苷酸序列、含有該序列的重組載體以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過MG53蛋白基因密碼子的優(yōu)化提高蛋白表達(dá)量的方法及其在生物醫(yī)藥上的用途。
【專利說明】密碼子優(yōu)化的MG53蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域/生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及密碼子優(yōu)化的MG53蛋白的編碼核苷酸序列、含有該序列的重組載體以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過MG53蛋白基因密碼子的優(yōu)化提高蛋白表達(dá)量的方法及其在保護(hù)心臟、治療細(xì)胞死亡導(dǎo)致的心臟疾病方面上的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]MG53 是骨骼肌特異性蛋白 mitsugumin53，簡稱 MG53;或 TRM72。mitsugumin53(MG53),是一種肌肉特異性tripartite motif family (TRIM)家族蛋白(該家族蛋白常含三個特定模序結(jié)構(gòu)，分別稱為RING，Β-Β0Χ，和卷曲結(jié)構(gòu)域。它們共同作用結(jié)合在細(xì)胞不再需要的蛋白質(zhì)上，將這些蛋白帶上泛素標(biāo)記以便降解)，也是一種細(xì)胞膜修復(fù)機(jī)制的重要組成部分。
[0003]在醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，MG53治療由細(xì)胞凋亡引起的心臟疾病的功效已被接受并成為業(yè)內(nèi)前沿領(lǐng)域的公知。MG53能夠?qū)π呐K產(chǎn)生保護(hù)作用，也就是說可以通過增加MG53的含量保護(hù)心臟損傷。但目前通過已知的人源野生型MG53蛋白表達(dá)基因，通過體外真核細(xì)胞蛋白表達(dá)體系無法獲得更高的蛋白產(chǎn)量，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，成為該蛋白研究和應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明提供一種人源MG53基因的密碼子優(yōu)化核苷酸序列，SEQ ID N0:2，即人源野生型MG53的同義突變核苷酸序列(MG53mut)，編碼相同人源MG53蛋白。人源野生型MG53SEQID NOl。
[0005]MG53蛋白能夠?qū)π呐K產(chǎn)生保護(hù)作用，也就是說可以通過增加MG53的蛋白含量保護(hù)心臟損傷。
[0006]但通過大量實驗研究表明，通過體外人工表達(dá)人源野生型MG53的蛋白，產(chǎn)量一直無法提高，無法降低生產(chǎn)成本，阻礙這種體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
[0007]MG53 是 TRIM 家族(The superfamily of tripartite motif-containingproteins)中新發(fā)現(xiàn)的一個蛋白質(zhì)，與其他家族成員不同，它只在骨骼肌和心肌表達(dá)。初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中MG 5 3能夠作為一種結(jié)構(gòu)蛋白促進(jìn)細(xì)胞膜損傷的修復(fù)，同時也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和骨骼肌細(xì)胞再生；另外在心肌中，MG53還通過介導(dǎo)Caveolin-3與PI3K的結(jié)合，激活再灌注損傷救援通路(reperfusion injurysalvagekinase pathway, RISK pathway),進(jìn)而在心臟缺血預(yù)處理中發(fā)揮重要保護(hù)功能。本申請發(fā)明人通過大量實驗摸索后，提出一種密碼子優(yōu)化的MG53基因核苷酸序列，SEQ IDNO:2，將其使用真核細(xì)胞表達(dá)載體體外表達(dá)，同等條件下可以獲得比野生型MG53高約30%，成為該核苷酸序列優(yōu)于人源野生型MG53基因核苷酸序列的重要特征。
[0008]本發(fā)明還提供了一種密碼子優(yōu)化的MG53核苷酸序列體外蛋白表達(dá)方法，該方法在于，根據(jù)全基因合成方式合成MG53mut基因，通過分子克隆方式連接于真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞中通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法來表達(dá)MG53蛋白。
[0009]在本發(fā)明的具體實施例中，所述的該同義突變MG53 (MG53mut)體外表達(dá)方法的過程為:
[0010](I)全基因合成SEQ ID N0:2所提供的核苷酸序列MG53mut ;作為模板，使用DNA聚合酶，用特異性突變引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0011](2)通過分子克隆方式，連入通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞T0P10，融解感受態(tài)T0P10，加入處理后的PCR產(chǎn)物，冰上孵育，加入LB,孵育，涂氨芐抗性LB平板，培養(yǎng)，挑取平板上的單菌落，DNA測序檢測得突變結(jié)果為陽性，得到MG53mut表達(dá)質(zhì)粒；
[0012](5)上述MG53mut質(zhì)粒通過利用ScreenFectA轉(zhuǎn)染細(xì)胞方式獲得MG53蛋白。
[0013]本發(fā)明還提供了上述的MG53mut在制備治療心肌細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的藥物中的用途。
[0014]上述的MG53突變體的用途，其中所述的治療心肌細(xì)胞損傷的藥物還包括治療/預(yù)防心臟缺血、再灌注損傷所致疾病的藥物；上述疾病進(jìn)一步還包括心肌細(xì)胞缺損、心肌缺血、心臟缺血/再灌損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂等的藥物。
[0015]關(guān)于MG53在治療 心臟損傷/心肌損傷中的應(yīng)用，以及其在治療/預(yù)防心臟缺血、再灌注損傷所致疾病中的用途，可參見200910241451.3公開的藥學(xué)實驗部分的實驗方法和實驗數(shù)據(jù)。
[0016]在心肌細(xì)胞中過表達(dá)MG53，能對缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
[0017]實驗方法總結(jié):
[0018]試劑和材料:anti_Myc抗體(Sigma-Aldrich,M4439)。如無特別說明，其他化學(xué)試劑均來自Sigma-Aldrich公司。
[0019]同源同齡雄性正常血壓大鼠來自北京市維通利華公司。所有動物程序和安樂死術(shù)都是按照中國北京大學(xué)動物研究委員會批準(zhǔn)的協(xié)議來執(zhí)行的，并且符合實驗動物護(hù)理和使用指南(1985年由美國國家衛(wèi)生研究所修訂發(fā)行，發(fā)行號為86-23)。所有動物都維持在中國北京大學(xué)實驗動物中心的一個光照/黑暗循環(huán)的溫控屏障設(shè)施里，他們可自由獲取食物和水。
[0020]質(zhì)粒和腺病毒載體:全長的野生型MG53序列通過人肌肉組織中通過逆轉(zhuǎn)錄程序獲得，而同義突變MG53核苷酸序列則通過全基因合成獲得。分別經(jīng)BamHI和XhoI兩個酶(NEB)切位點(diǎn)嵌入pcDNA4/T0/Myc_His B的表達(dá)載體(來自Invitrogen公司)。
[0021]細(xì)胞培養(yǎng)，腺病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:C2C12成肌細(xì)胞(來自細(xì)胞資源中心，IBMS，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué))置于37攝氏度含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，經(jīng)Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10%牛胎兒血清(Hyclone公司)，0.1lg/L丙酮酸鈉和I %的青霉素-鏈霉素。當(dāng)C2C12成肌細(xì)胞90%密度時，我們通過腺病毒感染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)行基因?qū)?。之后，?xì)胞在含有2%的馬血清的DMEM培養(yǎng)基里培養(yǎng)四天分化成肌管。
[0022]免疫共沉淀，免疫印跡:組織或細(xì)胞在冰上經(jīng)裂解緩沖液(pH7.6的30mM的HEPES, IOOmM的氯化鈉，0.5 % ΝΡ-40,和蛋白酶抑制劑混合物)裂解10分鐘，裂解物以13，OOOrpm離心10分鐘。免疫共沉淀和免疫印跡檢測在之前已作說明。
[0023]統(tǒng)計方法:統(tǒng)計顯著性檢驗組間差異采用單因素方差分析(ANOVA)或重復(fù)測量的方差分析，適當(dāng)時候用Bonfeironi后t檢驗。所有P值小于0.05認(rèn)為顯著。數(shù)據(jù)表示為mean+s.e.m。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 序列表1人源(Homo sapiens)野生型MG53cDNA序列
[0025]序列表2人源MG53同義突變cDNA序列
[0026]圖1:突變的人MG53 (MG53mut)的cDNA序列和野生型MG53cDNA序列的比較。
[0027]經(jīng)過同義突變的人MG53的cDNA序列和野生型MG53cDNA序列比較。圖中MG53mut表示突變后的序列，MG53代表野生型MG53序列，consensus表示兩者一致的序列。
[0028]圖2:人野生型MG53和MG53mut的載體質(zhì)粒跑膠圖。
[0029]通過細(xì)菌擴(kuò)增，質(zhì)粒提取后的人野生型MG53和MG53mut的載體質(zhì)粒的跑膠圖，用以確定質(zhì)粒的濃度和純度。
[0030]圖3:靜脈注射重組MG53蛋白保護(hù)大鼠心臟缺血/再灌損傷。
[0031]心臟圖片顯示，與靜脈注射BSA相比，靜脈注射MG53重組蛋白能夠顯著減少缺血/再灌引起的心肌梗死(白色區(qū)域)。圖中藍(lán)色的是非缺血區(qū)，其他區(qū)域是缺血區(qū)，缺血區(qū)中紅色的是非梗死區(qū)，白色的是梗死區(qū)。
[0032]圖4:MG53mut比人野生型MG53的載體具有更高的MG53蛋白表達(dá)效率。
[0033]人野生型MG53和MG53mut的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，36_48小時后提取細(xì)胞蛋白，利用western blot檢測MG53蛋白表達(dá)。
[0034]圖片左側(cè)上下兩條灰色條帶分別代表野生型MG53的細(xì)胞蛋白表達(dá)量和GAPDH細(xì)胞內(nèi)參照物，右側(cè)上下兩條灰色條帶分別代表同義突變MG53序列的細(xì)胞蛋白表達(dá)量和GAPDH細(xì)胞內(nèi)參照物。
[0035]圖5:MG53mut和人野生型MG53的載體表達(dá)的MG53蛋白都具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用。
[0036]利用人野生型MG53和MG53mut的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞系以后，利用H2O2造成氧化應(yīng)激損傷(模擬缺血/再灌損傷)發(fā)現(xiàn)與對照載體(Control)相比，細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞損傷標(biāo)志物(LDH)的濃度明顯下降，而且MG53mut組的下降比野生型MG53組更加明顯。說明兩種載體表達(dá)的MG53都能夠保護(hù)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，而且MG53mut組具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。*表示如圖所示p〈0.05。
[0037]柱形圖內(nèi)三種柱形表示:未填充柱形為空載體轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞對照組，斜線填充柱形為野生型MG53組，黑色填充柱形為同義突變MG53組。縱坐標(biāo)為培養(yǎng)基內(nèi)LDH濃度(U/ml),左側(cè)和右側(cè)三條柱狀值分別為未營造缺氧環(huán)境下和使用200 μ M Η20220小時所營造缺氧環(huán)境下的培養(yǎng)基LDH濃度值。
具體實施方案:
[0038]1.MG53的克隆，野生型和同義突變表達(dá)載體的構(gòu)建。[0039]人肌肉組織利用TRIZOL法提取人肌肉組織的總RNA:
[0040]I) 100毫克組織樣本加I毫升的TRIzol試劑，勻漿組織；
[0041 ] 2)室溫放置15分鐘，加入0.2mL的氯仿，混勻，室溫靜置3分鐘；
[0042]3)離心12000gl5分鐘，取上層液相；
[0043]4)加入0.5mL異丙醇，在4度12000g離心10分鐘，棄上清，75%乙醇洗RNA ；
[0044]5)晾干后溶解RNA并測定濃度。[0045]野生型MG53總RNA的逆轉(zhuǎn)錄過程
[0046]利用提取的總RNA做逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。利用OligodT作為引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA文庫。
[0047]野生型MG53cDNA序列的分子克隆過程
[0048]以合成的cDNA文庫做模板，利用特異性引物，通過PCR方法獲得MG53的編碼序列:
[0049]PCR程序:變形溫度，98度3min,循環(huán)過程98度30sec, 65度30sec, 72度90sec,30個循環(huán)，72度5min延伸后4度保存。獲得野生型MG53序列(序列SEQ ID NO:1)
[0050]使用引物序列為，
[0051]上游引物:5，-ata ggatcc gccacc atgtcggctgcgcccggcct-3，；
[0052]下游引物:5，_atactcgag ac ggcctcggcgccttcgggacc-3，；攜帶有 BamHI 和 XhoI酶切位點(diǎn)。
[0053]PCR產(chǎn)物利用BamHI和XhoI雙酶切，同時利用同樣的雙酶切處理空載體質(zhì)粒pcDNA4/T0/myc-Hi sB，膠回收并利用T4連接酶將PCR產(chǎn)物連接入載體。測序驗證序列正確。
[0054]利用軟件分析MG53編碼區(qū)DNA序列，設(shè)計同義突變編碼序列，全基因合成的方式來獲得突變序列MG53mut (SEQ ID N0:2)。PCR產(chǎn)物利用BamHI和XhoI雙酶切，同時利用同樣的雙酶切處理空載體質(zhì)粒pcDNA4/T0/myC-HisB，膠回收并利用T4連接酶將PCR產(chǎn)物連接入載體。測序驗證序列正確。
[0055]大提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠驗證質(zhì)粒質(zhì)量與濃度。
[0056]IOOmL LB培養(yǎng)基(Ig蛋白胨，0.5g酵母提取物，Ig NaCl，NaOH調(diào)pH至7.5)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的TOPlO細(xì)菌，離心收集細(xì)菌，加入5mL裂解液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0),lmM EDTA)，漩渦震蕩，加入新配制的堿液(200mM NaOH, 1%SDS)，放置5分鐘，加入冰冷的5ml7.5M醋酸銨(pH7.6)，離心取上清，加入9mL異丙醇沉淀，棄上清，再用5ml的2M醋酸銨(PH7.4)溶解沉淀，再離心取上清，加5mL異丙醇沉淀，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，得到質(zhì)粒DNA。
[0057]利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒純度與濃度，結(jié)果如圖2。.[0058]2.MG53重組蛋白心臟保護(hù)作用。
[0059](I)利用 HEK293T 細(xì)胞表達(dá) MG53 和 MG53mut 蛋白。
[0060]HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)在15cm培養(yǎng)皿中，密度達(dá)到80%，利用脂質(zhì)體(ScreenFect A，IncellarTM)將構(gòu)建好的人MG53野生型和同義突變的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體方法如下:
[0061]以 DMEM給 293T 細(xì)胞換液，將 IOOuL ScreenFect A 與 2000uL dilution buffer 混合；同時將30ug質(zhì)粒與2000uL dilution buffer混合；5分鐘后將兩者混合均勻，室溫放置30分鐘；均勻滴加入換液后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；四小時后給細(xì)胞換成正常培養(yǎng)基(10%FBS的DMEM)ο轉(zhuǎn)染36-48小時后裂解細(xì)胞，以相應(yīng)抗體進(jìn)行western Blot檢測蛋白水平。48小時后，每盤細(xì)胞用 ImL Co-1P buffer (30mM HEPES，ρΗ7.5，IOOmM NaCl, ImM EDTA,0.5%ΝΡ40,protease inhibitor (Roche,04693132001，I 片/50mL buffer))裂解細(xì)胞。利用蛋白帶有的myc標(biāo)簽來純化蛋白。具體步驟如下:
[0062]首先利用冰冷的PBS洗ant1-myc的beads(E6654_lmL, Sigma),洗漆3次，以冷的Co-1P buffer洗beads I次。將beads與裂解液混合,4 °C混合3小時,之后將磁珠以Co-1Pbuffer洗5次，盡量去除上清，利用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脫蛋白，洗脫液以NaCl (濃度)和Tris-Cl (濃度)(pH8.0)中和洗脫液。蛋白_80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭康鞍字茦?，同時取BSA做對照，跑SDS-PAGE膠，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色驗證濃度與純度。
[0063](2)大鼠心肌梗塞模型的建立和評價
[0064]大鼠(北京市維通利華公司，SD大鼠，200克體重)利用30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，氣管插管，第四肋間開胸，打開心包，暴露心臟。穿線活結(jié)結(jié)扎大鼠左前降支冠狀動脈45分鐘，而后放開，開始再灌。
[0065]對于MG53治療組，在缺血前5分鐘和再灌前I分鐘，分別靜脈注射3mg/kg的MG53蛋白。
[0066]再灌48小時以后，利用30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開胸，取下心臟，主動脈插管，逆向灌流生理鹽水沖洗心臟。而后從開始穿線結(jié)扎冠狀動脈的位置重新結(jié)扎冠狀動脈，灌流Alcian blue染料，染色的部分就是非缺血區(qū)，未染色的部分是缺血區(qū)。而后把心臟橫切成5-6個薄片，1%TTC溶液37攝氏度染色15分鐘，白色的部分就是梗塞區(qū)。
[0067]結(jié)論:靜脈 注射重組MG53蛋白保護(hù)大鼠心臟缺血/再灌損傷，結(jié)果見圖3。
[0068]3.MG53和MG53mut表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)檢測。
[0069]HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在60mm培養(yǎng)皿中，密度達(dá)到80%，利用脂質(zhì)體(ScreenFect A ；Incellar?)將構(gòu)建好的人MG53野生型和同義突變的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體方法如下:以DMEM 給 293T 細(xì)胞換液，將 IOuL ScreenFect A 與 200uL dilution buffer 混合；同時將3ug質(zhì)粒與200uL dilution buffer混合；5分鐘后將兩者混合均勻，室溫放置30分鐘；均勻滴加入換液后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；四小時后給細(xì)胞換成正常培養(yǎng)基(10%FBS的DMEM)。轉(zhuǎn)染36-48小時后裂解細(xì)胞，以ant1-myc抗體進(jìn)行western Blot檢測蛋白水平，同時利用GAPDH抗體做WB檢測蛋白上樣量的情況。結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)同樣量的質(zhì)粒，MG53mut比WT序列的質(zhì)粒表達(dá)量提高很多，接近30%。
[0070]4.H9C2心肌細(xì)胞系缺氧和細(xì)胞損傷檢測。
[0071]H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，細(xì)胞生長達(dá)到80%的時候轉(zhuǎn)染質(zhì)粒=Control組轉(zhuǎn)染 pcDNA4/T0/myc-HisB ；human MG53WT 組:轉(zhuǎn)染野生型 MG53 質(zhì)粒；human MG53Mut:同義突變的MG53質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法同上。30小時后，換新鮮培養(yǎng)基，加入200uM的H2O2，刺激細(xì)胞。20小時后，取40uL培養(yǎng)基，利用LDH檢測試劑盒檢測培養(yǎng)基中的LDH含量(乳酸脫氫酶測定試劑盒，LDH0360，上海景源醫(yī)療器械有限公司)，結(jié)果見圖5。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA分子，核苷酸序列編碼野生型人源MG53蛋白，其特征及核苷酸序列不同于野生型的人源MG53編碼序列。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于該DNA分子為核苷酸序列為SEQIDN0:2。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于核苷酸序列SEQID N0:2的任意位點(diǎn)發(fā)生一個或多個同義突變。
4.一種重組載體，其中含有權(quán)利要求1-3任意一項的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于重組載體為動物表達(dá)載體。
6.如權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于動物表達(dá)載體可以為腺病毒載體。
7.權(quán)利要求6的重組載體，其特征在于該重組載體為pcDNA4/T0系列載體或pcDNA4系列載體。
8.權(quán)利要求7的重組載體，其特征在于該重組載體為pcDNA4/T0/myc-HisB載體。
9.一種宿主細(xì)胞,其中含有權(quán)利要求4-8所述的DNA分子任一的重組載體。
10.權(quán) 利要求9的宿主細(xì)胞，其為動物細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其為HEK293T。
12.一種提高野生型MG53蛋白表達(dá)量的方法，該方法包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9-11任意一項的宿主細(xì)胞并獲得野生型人源MG53蛋白。
13.權(quán)利要求1-3的DNA分子在制備心肌損傷的藥物中的用途。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述藥物包括治療與心肌細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病的藥物，該疾病包括心肌缺血、心臟缺血/再灌損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂的藥物。
15.權(quán)利要求4-8之一的重組載體在制備心肌損傷的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求12方法獲得的野生型人源MG53蛋白在制備心肌損傷的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P9/10GK103966227SQ201410080068
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】肖瑞平, 曹春梅, 張巖, 呂鳳祥 申請人:北京博雅和瑞科技有限公司