一種豬流行性腹瀉活疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種豬流行性腹瀉疫苗，包含有抗原和保護(hù)劑，其中抗原是保藏編號(hào)為CGMCC?No.8503的豬流行性腹瀉病毒SD10株。本發(fā)明的疫苗所使用的抗原豬流行性腹瀉病毒SD10株的毒性低，免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗體產(chǎn)生快，產(chǎn)生的抗體滴度高且維持時(shí)間長，保存期長，免疫劑量小，在配種前進(jìn)行免疫注射可使懷孕母豬所產(chǎn)仔豬獲得較好的被動(dòng)免疫，使仔豬產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，能夠抵抗強(qiáng)毒的攻擊，提高仔豬的存活率。
【專利說明】一種豬流行性腹瀉活疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行性腹瀉活疫苗及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹灣病毒引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，本病對(duì)不同年齡的豬均易感，尤其哺乳仔豬危害最嚴(yán)重，是一種高度接觸性傳染病。該病于1971年首發(fā)于英國，20世紀(jì)80年代初我國陸續(xù)發(fā)生本病。近幾年，全國豬流行性腹瀉呈爆發(fā)流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病感染目前還沒有有效的治療方法，主要是以疫苗免疫預(yù)防為主。目前，國外主要是韓國的弱毒苗，國內(nèi)主要是哈獸研研制的豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉滅活疫苗等，但臨床應(yīng)用效果不是很理想。因此，有必要篩選出低毒，且保持高免疫原性的豬流行性腹瀉病毒來制備疫苗。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種豬流行性腹瀉活疫苗，即由一種弱毒性作為抗原制備的疫苗，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的豬流行性腹瀉疫苗，包含有抗原和保護(hù)劑，其中抗原是保藏編號(hào)為CGMCCN0.8503的豬流行性腹瀉病毒SDlO株。
[0005]其中的保護(hù)劑可以為目前使用的任一種病毒疫苗用保護(hù)劑，
[0006]優(yōu)選保護(hù)劑為蔗糖和明膠，其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為5%和1% ；
[0007]更優(yōu)選在保護(hù)劑中添加酪蛋白酸鈉，添加的質(zhì)量百分比濃度為0.5%。
[0008]優(yōu)選在保護(hù)劑中添加用于防止細(xì)菌感染的抗生素。
[0009]本發(fā)明的疫苗所使用的抗原豬流行性腹瀉病毒SDlO株的毒性低，免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗體產(chǎn)生快，產(chǎn)生的抗體滴度高且維持時(shí)間長，保存期長，免疫劑量小，在配種前進(jìn)行免疫注射可使懷孕母豬所產(chǎn)仔豬獲得較好的被動(dòng)免疫，使仔豬產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，能夠抵抗強(qiáng)毒的攻擊，提高仔豬的存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的疫苗進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0011 ] 實(shí)施例1:豬流行性腹瀉病毒SDlO株的篩選
[0012]1.1豬流行性腹瀉病毒SDlO株的分離和鑒定在進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，從山東萊西某豬場(chǎng)送檢的腹瀉豬小腸內(nèi)容物中分離到一株豬流行性腹瀉病毒(命名為SDlOAl株)，豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)陽性，盲傳至第8代出現(xiàn)細(xì)胞病變，第16代出現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定的細(xì)胞病變，病毒含量> 105 0TCID50/0.1ml，能夠被抗豬流行性腹瀉病毒特異性血清中和，傳至第121代時(shí)，傳代的病毒對(duì)3~5日齡健康未吃初乳仔豬安全，純凈，無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒(豬瘟、豬細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬口蹄疫病毒)污染。將最終傳代分離的SDlO株(豬流行性腹?寫病毒Porcine Epidemic Diarrhea Virus)進(jìn)行保藏，于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8503。
[0013]1.2本毒株接種母豬后，母豬未見流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良反應(yīng)，所產(chǎn)仔豬未有腹瀉發(fā)生。
[0014]1.3本發(fā)明毒株的病毒含量> 105'°TCID50/0.1ml。
[0015]1.4本發(fā)明毒株安全性好,對(duì)3~5日齡健康未吃初乳仔豬安全。
[0016]1.5本發(fā)明毒株病毒液與凍干保護(hù)劑混合，經(jīng)冷凍真空干燥制備的疫苗，免疫母豬后，所產(chǎn)仔豬能夠100%抵抗強(qiáng)毒的攻擊。
[0017]1.6克隆SDlO株的0RF3基因，其全長為675bp，編碼有224個(gè)氨基酸。通過在NCBI中進(jìn)行blastn分析，結(jié)果分離的0RF3基因與已報(bào)道的豬流行性腹瀉病毒的0RF3基因都存在3-5個(gè)氨基酸的差別。表明本發(fā)明所分離的SDlO株與已有的豬流行性腹瀉病毒都存在遺傳上的差異，為一新的病毒株。
[0018]二、用篩選的SDlO株制備疫苗
[0019]1.1疫苗的制備
[0020]1.2按照常規(guī)方法制備VeiO細(xì)胞(Veix)細(xì)胞購自美國ATCC)，生長液為含8%新生牛血清的MEM，培養(yǎng)細(xì)胞長成單層時(shí)接種SDlO株病毒；
[0021]1.3取SDlO株毒種(≥105 0TCID50/0.1ml)按1%接種長勢(shì)良好的Vero細(xì)胞單層，置37°C吸附1.5小時(shí)，加含2%新生牛血清MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)；
[0022]1.4接毒后，每日觀察2次，記錄細(xì)胞病變情況，細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲，反復(fù)凍融3次；
[0023]1.5取凍融后的病毒液測(cè)定病毒含量,每0.1ml病毒含量不低于105_°TCID5(I ；
[0024]1.6將檢驗(yàn)合格的細(xì)胞毒液與保護(hù)劑按常規(guī)方法制備成疫苗。
[0025]其中的保護(hù)劑可以為目前使用的任一種病毒疫苗用保護(hù)劑，例如蔗糖牛奶凍干保護(hù)劑；以及蔗糖和明膠的保護(hù)劑其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為5%和1%。
[0026]為了提供疫苗的保存時(shí)間，本申請(qǐng)對(duì)疫苗的保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化，最終制成的疫苗中包含有質(zhì)量百分比濃度為5%的蔗糖、1%明膠和0.5%的酪蛋白酸鈉(將Iml疫苗視為lg)。通過添加上述的組分，可以使疫苗在長期保存后，還能保持活力。在4°C條件下放置180日，其效價(jià)基本不變，放置360日，其抗體阻斷率稍有下降，但仍高于規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)；而用普通保護(hù)劑凍干的產(chǎn)品，在4°C條件下放置180日，其抗體效價(jià)基本上能達(dá)到規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，但放置360日后抗體效價(jià)下降很快，尤其720日后不可再使用，只能按報(bào)廢品處理。
[0027]2.疫苗檢驗(yàn)方法及結(jié)果
[0028]2.1性狀檢驗(yàn)3批活疫苗外觀呈淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，加入稀釋液后迅速溶解，易與瓶壁脫離。
[0029]2.2無菌檢驗(yàn)3批活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均無菌生長。
[0030]2.3支原體檢驗(yàn)3批活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均無支原體生長。
[0031]2.4外源病毒檢驗(yàn)3批活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均無豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒污染。[0032]2.5剩余水分檢驗(yàn)3批活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，剩余水分分別為2.5%、2.2%、2.4%。
[0033]2.6真空度檢驗(yàn)3批活疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，均呈紫色輝光。
[0034]2.7安全檢驗(yàn)取豬流行性腹瀉中和抗體、抗原均為陰性的3日齡仔豬20頭，隨機(jī)分成4組，每組5頭，口服10頭份疫苗，臨床觀察14日，均5/5健活，未見不良反應(yīng)發(fā)生。
[0035]2.8效力檢驗(yàn)用細(xì)胞維持液將疫苗稀釋為每1.0ml含I頭份，再作10倍系列稀釋，取10_3、10_4、10_5、10_64個(gè)稀釋度，分別接種長勢(shì)良好的VeiO細(xì)胞(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，每個(gè)稀釋度接種6孔，每孔0.1ml,同時(shí)設(shè)細(xì)胞陰性對(duì)照孔。接種后，置37°C、含5%C02培養(yǎng)72~96小時(shí)，觀察細(xì)胞病變，出現(xiàn)CPE者判為感染，計(jì)算TCID5tlt5 3批活疫苗每頭份病毒含量分別為 105_5TCID5Q、105_7TCID5Q、105.5TCID5tl，均不低于 IO5 0TCID500
[0036]表1:3批活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種豬流行性腹瀉疫苗，包含有抗原和保護(hù)劑，其特征在于，所述的抗原是保藏編號(hào)為CGMCC N0.8503的豬流行性腹瀉病毒SDlO株。
2.如權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉疫苗，其特征在于，所述的豬流行性腹瀉病毒SDlO株是由強(qiáng)毒株經(jīng)過傳代后獲得的。
3.如權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉疫苗，其特征在于，所述的保護(hù)劑為蔗糖和明膠，其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為5%和1% ；
4.如權(quán)利要求3所述的豬流行性腹瀉疫苗，其特征在于，所述的保護(hù)劑中添加有酪蛋白酸鈉。
5.如權(quán)利要求4所述的豬流行性腹瀉疫苗，其特征在于，所述的酪蛋白酸鈉添加的質(zhì)量百分比濃度為0.5%。
6.權(quán)利要求3或4所述的豬流行性腹瀉疫苗，其特征在于，所述的保護(hù)劑中添加有用于防止細(xì)菌感染的抗生素。
7.權(quán)利要求 1所述的豬流行性腹瀉疫苗用于預(yù)防豬流行性腹瀉。
【文檔編號(hào)】A61K47/42GK103933561SQ201410082924
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】陶曉珊, 劉蕾, 申洪銀, 鄒桂榮, 鄒敏, 胡瀟, 張維, 范根成, 孫健 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司