一種番鴨細小病毒滅活疫苗及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種番鴨細小病毒滅活疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其所用的抗原為滅活的番鴨細小病毒，該番鴨細小病毒的保藏編號為CGMCC?No.8504。本發(fā)明通過篩選出具有毒性小，免疫原性高的用番鴨細小病毒YBMDP株。再接種后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。本發(fā)明制備的疫苗能提高種番鴨的抗體水平，保證其子代母源抗體水平，預防番鴨細小病毒引起的雛鴨細小病毒感染，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點。
【專利說明】一種番鴨細小病毒滅活疫苗及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于家禽病源微生物篩選【技術領域】，具體涉及一種番鴨細小病毒滅活疫苗及其應用。
【背景技術】
[0002]番鴨細小病毒病是侵害雛番鴨的一種急性或亞急性傳染病，是以喘氣、腹瀉及胰臟壞死和出血為主要特征的傳染?。痪哂懈叨葌魅拘?，且發(fā)病率和死亡率都很高，常造成嚴重的經(jīng)濟損失。該病主要發(fā)生于I~3周齡的雛番鴨，尤其是10日齡左右的雛番鴨，而當達到3周齡以上就基本不發(fā)病了。本病最早于20世紀80年代中后期出現(xiàn)于中國福建和法國西部Brittany地區(qū)，20世紀90年代初才認識到它是不同于小鵝瘟的獨立疾病。如果對死亡的番鴨處理不當，往往造成病毒的蔓延，產(chǎn)生更大的危害。因此，就需要篩選出效價高、免疫原性好的番鴨細小病毒來制備疫苗。而且，由于病毒變異導致使用的疫苗效價降低，也需要篩選出變異的病毒株來制備療效更高的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種番鴨細小病毒滅活疫苗及其應用；所提供的疫苗具有高效、安全性好、保護率高的優(yōu)點，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0004]本發(fā)明的番鴨細小病毒滅活疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其所用的抗原為滅活的番鴨細小病毒，該番鴨細小病毒的保藏編號為CGMCC N0.8504。
[0005]該保藏編號為CGMCC N0.8504的番鴨細小病毒，為YBMDV株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0006]其中的番鴨細小病毒是經(jīng)過甲醛溶液滅活的；
[0007]上述的疫苗中番鴨細小病毒的含量為IO5 7ELD5tl;
[0008]上述滅活疫苗的制備方法如下:
[0009]I)油相制備:取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加5份的司本-80，至溫度達到115°C時，維持30min，冷卻后備用；
[0010]2)水相制備:將滅活的YBMDV株病毒液加入水中，使每0.2ml水中含YBMDV株病毒含量不低于105_7ELD5tl ;取滅菌后的5份吐溫-80，加入配液罐中，同時加入病毒液95份，攪拌20~30min，使吐溫-80完全溶解；
[0011]3)乳化:取油相2份放于高速剪切機內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相1份，以10000r/min,乳化5分鐘，乳化后，取IOml,以3000r/min離心15分鐘完成制備。
[0012]本發(fā)明通過篩選出具有毒性小，免疫原性高的用番鴨細小病毒YBMDP株。再接種后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。本發(fā)明制備的疫苗能提高種番鴨的抗體水平，保證其子代母源抗體水平，預防番鴨細小病毒引起的雛鴨細小病毒感染，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點?！揪唧w實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。本發(fā)明所應用的方法可以采用疫苗制備領域中常用的方法，而不僅限于本發(fā)明實施例的具體記載，本領域的普通技術人員可以其它常規(guī)方法來實現(xiàn)本發(fā)明。
[0014]實施例1、YBMDV株的篩選
[0015]2011年從浙江省某鴨場爆發(fā)了急性的番鴨細小病毒病，取病死鴨的胰臟及腸道，將胰臟及腸道組織用無生理鹽水勻漿制成20%懸液，3000r/min離心15min，取上清除菌后經(jīng)尿囊腔分別接種13日齡番鴨胚，孵化120小時，收集尿囊液及胚體組織，經(jīng)勻漿后，反復凍融3次，取上清液凍存。收獲的病毒液經(jīng)純化后進行了病毒含量、免疫原性、特異性及純凈性等方面的病毒特性的分析檢測，結(jié)果表明該毒株病毒含量為105_7ELD5(i/0.2ml,最小免疫劑量為102_°ELD5(i/0.2ml，該病毒僅與番鴨細小病毒發(fā)生特異性反應，無細菌、支原體及外源病毒污染，適合作為制苗用毒株。將篩選的病毒株于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8504。
[0016]對于本發(fā)明篩選的毒株的性狀進行檢測，結(jié)果表明，該株病毒屬細小病毒，圓形無囊膜，直徑在20μ m左右、對乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，對紅細胞無凝集現(xiàn)象。該病毒可引起雛番鴨發(fā)生以出血性腸炎為特征的急性敗血性傳染病。該毒株制備的疫苗免疫成年番鴨后，能保護免疫4個月內(nèi)種番鴨所產(chǎn)子代免受流行毒株的攻擊。該毒株作100倍稀釋后，與等量雛番鴨細小病毒病抗血清中和，接種13日齡番鴨胚，結(jié)果表明，中和組番鴨胚全部健活，而病毒對照組番鴨胚全部死亡。
[0017]對篩選的YBMDV 株的結(jié)構(gòu)基因VP進行測序，結(jié)果VP全長為2199bp，編碼732個氨基酸；NCBI的blast序列分析表明，YBMDV株的結(jié)構(gòu)基因VP與已公開的番鴨細小病毒的VP存在差異位點，同源性為97.7%~98.3% (即存在著9_16個氨基酸的差異)。
[0018]為了檢測上述氨基酸的差異對YBMDV株抗原性的影響，用YBMDV株來制備抗原來檢測其免疫原性。
[0019]實施例2制備疫苗
[0020]1.制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種YBMDV株，尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚，每胚0.2ml，36~37°C孵育，每日2次照胚檢查。選擇接種后48~120小時內(nèi)死亡，且胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨毛尿膜有輕度水腫的胚，取其尿囊液及胚體放入組織搗碎機中粉碎，取粉碎后的組織按1:2加入生理鹽水混合；置2~8°C 4~12小時，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2~8°C保存。
[0021]2.滅活將YBMDV株病毒液置于滅活瓶內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.2%。加甲醛溶液后倒入另一滅活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時后取出，置2~8°C保存。
[0022]3.半成品檢驗
[0023](I)無菌檢驗取滅活的胚液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。
[0024](2)病毒含量測定將病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_2、10_3、10_4、10_54個稀釋度，分別尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚，每胚0.2ml,同時設接種生理鹽水對照5枚，每胚0.2ml。置36~37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計算ELD5Q。
[0025](3)滅活檢驗將YBMDV株滅活后的病毒液尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚10枚，每胚0.2ml，置36~37°C繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察168小時。
[0026]三、滅活疫苗的制備:經(jīng)過檢驗合格后的半成品抗原進行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計)。
[0027](I)油相制備取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加司本一 805份，至溫度達到115°C時，維持30min，冷卻后備用。[0028](2)水相制備將滅活檢驗合格的YBMDV株病毒液適當比例混合，使每0.2ml水相中含YBMDV株病毒含量不低于104_°ELD5(i。取滅菌后的吐溫-805份，加入配液罐中，同時加混合抗原液95份，開動攪拌電機攪拌20~30min，使吐溫-80完全溶解。
[0029](3)乳化取油相2份放于高速剪切機內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相1份，以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后,取IOml,以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應不超過0.5ml。
[0030]四、疫苗成品檢驗
[0031](I)性狀
[0032]外觀疫苗應為乳白色乳劑，無雜質(zhì)并且外包裝應合格。
[0033]劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應不擴散。
[0034]穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應不超過0.5ml。
[0035]黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
[0036](2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
[0037](3)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規(guī)定。
[0038](4)安全檢驗用21日齡番鴨10只，每只頸部皮下注射疫苗2.0ml,同時設對照5只，在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗雞采食、飲水及臨床情況。應不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。
[0039](5)效力檢驗
[0040]①血清學方法用21~35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日齡雞不免疫作對照，免后21日，采血分離血清，分別測定番鴨細小病毒瓊擴抗體。免疫組AGP抗體效價，應不低于1:4，對照組應均為陰性。
[0041]②子代母源抗體與攻毒保護的關系90日齡種番鴨20只，每只頸部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日齡種番鴨不免疫作對照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次，收集開產(chǎn)后4月時所產(chǎn)種蛋孵化出雛，于雛番鴨7日齡時，免疫組子代取10只，對照組子代取10只，攻毒YBMDP株，每只肌肉注射0.5ml。免疫組子代保護率應不低于8只，對照組發(fā)病率應不低于9只。
[0042]③對地方流行毒株的攻毒保護(毒株的篩選)將各地方流行毒株分別制備滅活疫苗，取90日齡種番鴨20只，每只頸部皮下注射疫苗，2ml/只，另取10只同日齡種番鴨不免疫作對照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次，收集開產(chǎn)I個月內(nèi)所產(chǎn)種蛋孵化出雛，于雛番鴨7日齡時，免疫組子代取10只，對照組子代取10只，攻毒6株各地方分離株，每只肌肉注射0.5ml。觀察攻毒保護情況。
[0043]實施例3
[0044]—、制苗用抗原的制備
[0045]1.制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種YBMDV株，尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚，每胚0.2ml，36~37°C孵育，每日2次照胚檢查。選擇接種后48~120小時內(nèi)死亡，且胚體有廣泛出血，毛囊出血，肝臟變性和壞死，絨毛尿囊膜有輕度水腫的番鴨胚，取其尿囊液及番鴨胚體放入組織搗碎機中粉碎，取粉碎后的組織按I: 2加入生理鹽水混合；置2~80C 4~12小時，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2~8°C保存。(參見表1)。
[0046]表1毒液的制備
[0047]
【權利要求】
1.一種滅活疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其特征在于，所述的抗原為滅活的番鴨細小病毒，該番鴨細小病毒的保藏編號為CGMCC N0.8504。
2.如權利要求1所述的滅活疫苗，其特征在于所述的番鴨細小病毒是經(jīng)過甲醛溶液滅活的。
3.如權利要求1所述的滅活疫苗，其特征在于所述的番鴨細小病毒的含量為105.7ELD500
4.權利要求1所述的滅活疫苗，其制備方法如下: 1)油相制備:取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加5份的司本-80，至溫度達到115°C時，維持30min，冷卻后備用； 2)水相制備:將滅活的YBMDV株病毒液加入水中，使每0.2ml水中含YBMDV株病毒含量不低于IO5 7ELD5tl ;取滅菌后的5份吐溫-80，加入配液罐中，同時加入病毒液95份，攪拌20~30min，使吐溫-80完全溶解； 3)乳化:取油相2份放于高速剪切機內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分鐘，乳化后，取IOml,以3000r/min離心15分鐘完成制備。
5.權利要求1所述的滅活疫苗用于預防番鴨細小病毒病。
【文檔編號】A61P31/20GK103830724SQ201410083495
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權日:2014年3月7日
【發(fā)明者】李陸梅, 宮曉, 徐保娟, 王紅, 宋新宇, 鄒敏, 李芳
申請人:青島易邦生物工程有限公司