一種基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于納米材料仿生載藥分級(jí)緩釋骨支架的制備方法，包括負(fù)型的制備，漿料的制備，內(nèi)層載藥骨支架的制備，外層載藥骨支架的制備和封裝等步驟。該骨支架除滿足一般骨支架對(duì)孔隙率、強(qiáng)度、表面形態(tài)的要求外，還實(shí)現(xiàn)了骨支架載藥的多樣性，具備裝載藥物的梯度緩釋功能，可有效提高臨床上復(fù)雜骨缺損治療的成功率，在臨床上有著廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提出一種新型仿生載藥分級(jí)緩釋骨支架的制備方法，特別是一種基于納米材料仿生載藥分級(jí)緩釋骨支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，應(yīng)用于臨床上的骨缺損修復(fù)方法中，應(yīng)用組織工程技術(shù)，采用生物材料制造的仿生骨，在解決骨源不足的問(wèn)題上是替代自體骨移植最佳方案之一。
[0003]熔融堆積成型技術(shù)是增材制造技術(shù)之一，該技術(shù)是將熱塑性塑料聚合體材料加熱熔融成絲，堆積在成型面上成型，成型速度和精度較高，可用于制作復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的模具。生物制造是制造科學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)的交叉技術(shù)，生物活性組織的工程化制造是其主要研究領(lǐng)域之一。將經(jīng)過(guò)改性的材料應(yīng)用于生物制造領(lǐng)域，可以使仿生骨支架具有良好的生物相容性、生物降解性和機(jī)械強(qiáng)度。將藥物載入骨支架，可以實(shí)現(xiàn)藥物的梯度緩釋和靶向藥物的傳遞。 目前，針對(duì)藥品開(kāi)發(fā)合適的傳遞系統(tǒng)仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。以往，用于植入的聚合物裝置是由硅膠、橡膠和聚乙烯制成。采用這些化學(xué)惰性聚合物作為給藥裝置的主要缺陷是其非可生物降解性，這使得藥物在體內(nèi)釋放完后需經(jīng)手術(shù)將裝置取出。為了克服這一難題，許多可生物降解聚合物被合成并用于藥物傳遞。這些聚合物在體內(nèi)通過(guò)酶或非酶的途徑降解生成具有生物相容性或無(wú)毒的副產(chǎn)物，從而可以避免通過(guò)手術(shù)取出耗盡藥物的傳遞裝置。
聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由兩種單體-乳酸
和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無(wú)毒、良好的成囊和成膜的性能。β -碳酸鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)是一種應(yīng)用廣泛的可降解生物陶瓷，但由單一 β-TCP作為材料的制備的骨支架有機(jī)械強(qiáng)度不足的缺點(diǎn)，由生物材料PLGA與β -TCP混合制備而成的復(fù)合材料骨支架可有效提高骨支架的機(jī)械強(qiáng)度。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenic proteins, BMPs)是最值得關(guān)注的生長(zhǎng)因子之一，BMPs既能誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生直接作用，能誘導(dǎo)纖維組織中基質(zhì)干細(xì)胞在異位發(fā)生成骨，其極高的成骨活性預(yù)示著巨大臨床應(yīng)用價(jià)值。骨支架不合理的載藥方式，使藥物在骨支架表面聚集，從而導(dǎo)致較高的突釋。構(gòu)建用于骨修復(fù)的具有良好支架性能和負(fù)載藥物梯度緩釋的復(fù)合功能仿生載藥支架仍需要艱難探索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種基于納米材料仿生載藥分級(jí)緩釋骨支架的制備方法。該仿生載藥梯度緩釋骨支架不僅要滿足一般骨支架對(duì)骨缺損部位的支撐要求，還要實(shí)現(xiàn)藥物梯度緩釋誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，提高成骨量。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法，工藝步驟如下:
I)負(fù)型a、負(fù)型b的設(shè)計(jì)與制造:設(shè)計(jì)出兩種負(fù)型，即負(fù)型a、負(fù)型b ;負(fù)型包括三個(gè)組件，即底座、左半環(huán)和右半環(huán)；所述負(fù)型b底部開(kāi)有凹槽，方便冰柱的垂直裝入，避免冰柱傾倒；應(yīng)用熔融堆積成型法制造出負(fù)型的各個(gè)組件，裝配好后備用；
2)載藥漿料的制備:將生物材料PLGA溶于二氯甲烷，后加入納米級(jí)β-TCP和去離子7jC, PLGA與β-TCP的質(zhì)量之比為4:6，置于震蕩研磨儀，使?jié){料混合均勻，制備出兩份同樣的漿料Α、Β ;分別將質(zhì)量為1、II的ΒΜΡ-2 (骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一)溶解于DMSO，制備出混合溶液C丨、C u，后將C丨、C工工分別加入Α、B中，再次置于震蕩研磨儀，使?jié){料與藥物混合均勻，取出，置于真空干燥機(jī)中真空消泡，去除漿料中存在的氣泡；制備好的漿料A+ C,,B+ Cii,備用;
3)內(nèi)層載藥骨支架61的制備:將漿料A+C丨負(fù)壓灌入負(fù)型a，將灌入漿料的負(fù)型a在低溫真空環(huán)境下冷凍干燥后，取出，拆除負(fù)型，所得骨支架經(jīng)后處理得到內(nèi)層載藥骨支架G1 ；
4)冰柱制備:將去離子水灌入到負(fù)型a中，低溫冷凍，待完全結(jié)冰后，拆除負(fù)型，取出冰柱，將冰柱裝入負(fù)型b中心位置；
5)外層載藥骨支架G2的制備:將漿料B+C π負(fù)壓灌入已裝有冰柱的負(fù)型b，將灌入漿料的負(fù)型b在低溫真空環(huán)境下冷凍干燥后，取出，拆除負(fù)型，得到外層載藥骨支架G2 ;將支架62中心的冰柱升華后，形成具有環(huán)狀外形的外層載藥骨支架G2 ；
6)骨支架的封裝:將漿料B+C π負(fù)壓灌入外層載藥骨支架G2的中心孔洞中，使?jié){料灌至距底部1/3高度處，冷凍干燥；取出后，將內(nèi)層載藥骨支架G1裝入外層載藥骨支架G2的中心孔洞中；最后將漿料B+ C11負(fù)壓灌入外層載藥骨支架G2中心孔洞中，灌滿孔洞封裝內(nèi)層載藥骨支架G1，冷凍干燥，最終制得仿生載藥梯度緩釋骨支架。
[0006]所述冷凍干燥的條件為:溫度為-42—-48°C之間，冷凍干燥機(jī)內(nèi)部的真空度為18-45pa，處理時(shí)間 46-48h。
[0007]所述漿料A+ C I的載藥濃度為2.42X10—4 mol/kg，漿料B+ C11的載藥濃度為
6.06X 10 5mol/kg。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下顯而易見(jiàn)的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新型負(fù)型，該負(fù)型底部開(kāi)有凹槽，能夠有效保證冰柱的垂直裝入，避免冰柱出現(xiàn)傾倒。
[0009]2.本發(fā)明引入冰柱來(lái)制造出具有環(huán)狀外形的骨支架。保證了骨支架的良好外形，為解決如何制備環(huán)狀骨支架的難題提供了一種可靠解決方案。
[0010]3.本發(fā)明采用骨形態(tài)發(fā)生蛋白作為裝載藥物，有效的保證了載藥骨支架促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
[0011]4.本發(fā)明對(duì)載藥骨支架采用分級(jí)制造，在內(nèi)外兩個(gè)支架上，可以裝載不同劑量、不同種類的藥物，實(shí)現(xiàn)了骨支架載藥的多樣化。
[0012]5.本發(fā)明分別制造了含不同劑量藥物的兩種骨支架，經(jīng)裝配后，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)骨支架的分級(jí)載藥，為藥物的梯度釋放提供了可能。
[0013]6.本發(fā)明可通過(guò)調(diào)整負(fù)型的尺寸形狀，來(lái)獲取不同尺寸形狀的仿生載藥骨支架，因此，該方法可以實(shí)現(xiàn)骨缺損部位植入支架的定制化制造，可有效提高臨床復(fù)雜骨缺損治療的成功率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0014]圖1為仿生載藥梯度緩釋骨支架結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2為內(nèi)部載藥骨支架G1制備流程圖。
[0016]圖3為仿生載藥梯度緩釋骨支架制備流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下通過(guò)具體實(shí)例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明如下:
如圖1所示，一種基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法，工藝步驟如下:
1)負(fù)型a、負(fù)型b的設(shè)計(jì)與制造
使用CATIA V5R19 (France, Dassault System)設(shè)計(jì)出兩種負(fù)型，即負(fù)型a、負(fù)型b。負(fù)型包括三個(gè)組件，即底座、左半環(huán)和右半環(huán)。其中負(fù)型b底部開(kāi)有凹槽，方便冰柱的垂直裝入，避免出現(xiàn)冰柱傾倒的狀況。借助于熔融堆積成型技術(shù)制造出負(fù)型組件，將負(fù)型的三維實(shí)體模型以STL格式保存，導(dǎo)入熔融堆積成型設(shè)備，以ABS為材料，制造出負(fù)型組件，去除負(fù)型表面的殘留絲線，裝配，獲得支架的組合式負(fù)型模具。
[0018]2)載藥漿料的制備
取0.6gPLGA溶于Iml 二氯甲烷，后加入1.4g納米級(jí)β -TCP，最后加4ml去離子水，置于震蕩研磨儀，震蕩頻率設(shè)置為15Hz，震蕩lh，使?jié){料混合均勻，取出備用，此種漿料需制備同樣的兩份A、B。用電子天平稱取質(zhì)量分別為1:6.5mg、I1:1.625mg的BMP-2，取兩只試管，在試管內(nèi)滴加0.5ml的DMSOJf 1、II兩份BMP-2加入到兩只試管內(nèi)，震蕩，待充分溶解后，即制備出 BMP-2 與 DMSO 的混合溶液 C1: (0.5mlDMS0+6.5mg BMP-2)、C π: (0.5ml DMSO+ 6.5mg BMP-2)，將C ^C11分別加入A、B中，再次置于震蕩研磨儀，震蕩頻率設(shè)置為15Hz，震蕩0.2h，使?jié){料與BMP-2溶液混合均勻，取出，置真空干燥機(jī)中真空消泡，去除漿料中存在的氣泡，制備出載藥漿料A+ CmB+ C11,備用。
[0019]3)內(nèi)層載藥骨支架G1的制備
如圖2所示，將載藥漿料A+ C i負(fù)壓載入負(fù)型a ;將灌入漿料的負(fù)型a置于-42°C的低溫環(huán)境中3h后，將冷凍干燥機(jī)內(nèi)部的真空度降到18-30pa之間，之后每隔2小時(shí)抽真空一次，使真空度保持在18-30pa之間；該操作48h后，取出負(fù)型，拆除負(fù)型；后將所得骨支架用刀片裁切成2mm高，即得內(nèi)層載藥支架G1 (PLGA/β-TCP+ ΒΜΡ-2 (2.42 X 10_4mol/kg))。
[0020]4)制備冰柱
如圖3所示，將去離子水滴加到負(fù)型a，置于冷凍干燥機(jī)中迅速冷凍，、拆除負(fù)型，取出冰柱，裝入負(fù)型b中心位置。
[0021]5)外層載藥骨支架G2的制備
將漿料B+ C11負(fù)壓載入已裝有冰柱的負(fù)型b，注意要使?jié){料充分灌入負(fù)型，將灌入漿料的負(fù)型b置于-42°C的低溫環(huán)境中3h后，將冷凍干燥機(jī)內(nèi)部的真空度降到18-30pa之間，之后每隔2小時(shí)抽真空一次，使真空度保持在18-30pa之間；該操作48h后，取出負(fù)型，拆除負(fù)型，即得到具有環(huán)狀外形的骨支架G2 (PLGA/ β -TCP+ BMP-2 (6.06 X 10_5mol/kg))。
[0022]6)載藥支架的封裝
將漿料B+ C11負(fù)壓載入G2中心孔洞中，將漿料灌至距底部1/3高度處，凍干，冷凍干燥完成后，將G1裝入G2的中心孔洞中，將漿料B+ C11負(fù)壓載AG2中心孔洞中，完全灌滿孔洞，凍干，實(shí)現(xiàn)封裝。
【權(quán)利要求】
1.一種基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法，其特征在于，工藝步驟如下: 1)負(fù)型a、負(fù)型b的設(shè)計(jì)與制造:設(shè)計(jì)出兩種負(fù)型，即負(fù)型a、負(fù)型b;負(fù)型包括三個(gè)組件，即底座、左半環(huán)和右半環(huán)；所述負(fù)型b底部開(kāi)有凹槽，方便冰柱的垂直裝入，避免冰柱傾倒；應(yīng)用熔融堆積成型法制造出負(fù)型的各個(gè)組件，裝配好后備用； 2)載藥漿料的制備:將生物材料PLGA溶于二氯甲烷，后加入納米級(jí)β-TCP和去離子水，置于震蕩研磨儀，使?jié){料混合均勻，制備出兩份同樣的漿料A、B ;分別將質(zhì)量為1、II的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2溶解于DMSO，制備出混合溶液C丨、C11,后將C M C11分別加入A、B中，再次置于震蕩研磨儀，使?jié){料與藥物混合均勻，取出，置于真空干燥機(jī)中真空消泡，去除漿料中存在的氣泡；制備好的漿料A+ CmB+ C u，備用； 3)內(nèi)層載藥骨支架61的制備:將漿料A+C丨負(fù)壓灌入負(fù)型a，將灌入漿料的負(fù)型a在低溫真空環(huán)境下冷凍干燥后，取出，拆除負(fù)型，所得骨支架經(jīng)后處理得到內(nèi)層載藥骨支架G1 ； 4)冰柱制備:將去離子水灌入到負(fù)型a中，低溫冷凍，待完全結(jié)冰后，拆除負(fù)型，取出冰柱，將冰柱裝入負(fù)型b中心位置； 5)外層載藥骨支架G2的制備:將漿料B+C π負(fù)壓灌入已裝有冰柱的負(fù)型b，將灌入漿料的負(fù)型b在低溫真空環(huán)境下冷凍干燥后，取出，拆除負(fù)型，得到外層載藥骨支架G2 ;將支架62中心的冰柱升華后，形成具有環(huán)狀外形的外層載藥骨支架G2 ； 6)骨支架的封裝:將漿料B+C π負(fù)壓灌入外層載藥骨支架G2的中心孔洞中，使?jié){料灌至距底部1/3高度處，冷凍干燥；取出后，將內(nèi)層載藥骨支架G1裝入外層載藥骨支架G2的中心孔洞中；最后將漿料B+ C11負(fù)壓灌入外層載藥骨支架G2中心孔洞中，灌滿孔洞封裝內(nèi)層載藥骨支架G1，冷凍干燥，最終制得仿生載藥梯度緩釋骨支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥的條件為:溫度為-42—-48°C之間，冷凍干燥機(jī)內(nèi)部的真空度為18-45pa，處理時(shí)間 46-48h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米材料仿生載藥梯度緩釋骨支架的制備方法，其特征在于，所述漿料A+ C1的載藥濃度為2.42 X 10_4 mol/kg，漿料B+ C11的載藥濃度為6.06X105mol/kg。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103908702SQ201410084819
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】高海濤, 林柳蘭, 董洋洋, 陸宇杰, 胡慶夕 申請(qǐng)人:上海大學(xué)