含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架及其制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為治療下腰痛提供一種組織工程支架。本發(fā)明的技術(shù)方案是含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架，為采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備得到的同軸電紡支架；所述的生長(zhǎng)因子為TGF-β1。本發(fā)明還提供了所述的椎間盤組織支架的制備方法。本發(fā)明可用于下腰痛的治療。
【專利說明】含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架及其制備 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 下腰痛是一種臨床常見疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。研究表明，椎間盤退變及 髓核鈣化與下腰痛密切相關(guān)。保守治療只能緩解癥狀，椎間盤髓核摘除術(shù)或脊柱節(jié)段融合 內(nèi)固定等手術(shù)雖然能解除神經(jīng)壓迫癥狀，但術(shù)后椎間關(guān)節(jié)強(qiáng)硬高發(fā)及椎間盤突出復(fù)發(fā)等問 題。目前，生物治療的方式包括基因治療，生長(zhǎng)因子治療，細(xì)胞和組織工程等。
[0003] 組織工程是把細(xì)胞和支架結(jié)合起來，對(duì)損傷部分進(jìn)行替代治療的一種方法。然而， 目前仍面臨許多問題，如缺少能夠維持種子細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及基質(zhì)合成的理想支架。 間充質(zhì)干細(xì)胞是目前應(yīng)用廣泛的一種細(xì)胞，但其分化需要一定的物理、化學(xué)、生物刺激。生 長(zhǎng)因子作為生物刺激的一種經(jīng)常用于刺激干細(xì)胞的增殖和分化。若組織工程支架能長(zhǎng)時(shí)間 穩(wěn)定釋放生長(zhǎng)因子，將會(huì)是對(duì)細(xì)胞的增殖分化起到良好的作用。之前的研究多使用水凝膠 作為承載生長(zhǎng)因子的載體，但其缺點(diǎn)有水凝膠內(nèi)部的細(xì)胞容易死亡、水凝膠力學(xué)性能差、用 途局限等。靜電紡絲技術(shù)在1934年由Formalas發(fā)明。主要指聚合物熔體或者溶液在高 壓靜電場(chǎng)作用下形成纖維的過程。目前，靜電紡絲已經(jīng)成為一種用于生產(chǎn)不同功能多聚納 米纖維的新技術(shù)，并已經(jīng)發(fā)展成為一種傳遞生物活性材料的工具。納米纖維表面的小孔用 于釋放存放在纖維中的藥劑。與傳統(tǒng)的藥物傳遞系統(tǒng)相比，這個(gè)方法極大的增加了作用時(shí) 間。這個(gè)方法也具有質(zhì)量小，傷口閉合率高的優(yōu)越性，從而有效的輔助傷口復(fù)原。特別是，含 有血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)和PDGF，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta (TFG-beta)等多種生長(zhǎng)因子的納米纖維的制造已有報(bào)道。除了同軸電紡以外，共軸電紡技 術(shù)也已經(jīng)廣泛應(yīng)用。
[0004] 靜電紡絲技術(shù)在骨科迅速發(fā)展，通過靜電紡絲技術(shù)制成的納米支架具有纖維直徑 小(幾十到數(shù)百納米)，孔隙率高，比表面積大，均一性好等優(yōu)點(diǎn)。同軸電紡因?yàn)榫哂袃?nèi)外雙 層結(jié)構(gòu)，克服了單軸靜電紡絲時(shí)水溶性和脂溶性材料相互難融合的問題。將生長(zhǎng)因子作為 靜電紡絲支架的一部分，構(gòu)建促進(jìn)間充質(zhì)千細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化的組織工程支架，有望 成為生物治療的有效手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為治療下腰痛提供一種組織工程支架。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架，為采用同軸靜電紡絲裝置制 備得到的同軸電紡支架；所述的生長(zhǎng)因子為TGF-β 1 ;其中，同軸電紡支架外層溶液為以六 氟異丙醇為溶劑的13?17%g/mL聚乳酸PLGA ;同軸電紡支架內(nèi)層溶液為13?17%g/mL聚 乙烯醇PVA和3 μ LTGF- β 1 ;其中TGF- β 1溶解于1%的BSA中，其濃度為lng/ μ L。
[0007] 優(yōu)選的，同軸電紡支架外層溶液為以六氟異丙醇為溶劑的15%g/mL聚乳酸PLGA。
[0008] 優(yōu)選的，同軸電紡支架內(nèi)層溶液為15%g/mL聚乙烯醇pVA。
[0009] 本發(fā)明還提供了椎間盤組織支架的制備方法，包括如下步驟：
[0010] 步驟1、將聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA溶解于六氟異丙醇hfip中，制成13? 17%g/mLPLGA溶液，即為同軸靜電紡絲外層溶液；
[0011] 步驟2、將TGF-β 1用1%牛血清白蛋白BSA稀釋為濃度lng/yL ;
[0012] 步驟3、將PVA溶于超純水中，成為I3?l7%g/mLPVA溶液。
[0013] 步驟4、在2mL15%PVA溶液中加入6 μ Ling/ μ L的TGF-β 1，此為同軸靜電紡絲的 內(nèi)層溶液；
[0014] 步驟5、組裝好儀器，針頭距離接受裝置15cm,電壓16?18Κν，注射速度0.2? 0. 4mL/h，內(nèi)、外層溶液都紡1. 2mL。
[0015] 步驟6、支架完成后，保存于-20°C。
[0016] 優(yōu)選的，步驟1中PLGA的濃度為15%g/mL。
[0017] 優(yōu)選的，步驟3中PVA的濃度為15%g/mL。
[0018] 優(yōu)選的，步驟5中注射速度為0. 3mL/h。
[0019] 本發(fā)明組織工程支架紡絲均一性好，具有內(nèi)外雙層結(jié)構(gòu)。該支架具有良好的力學(xué) 特性、親水性，可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定釋放生長(zhǎng)因子TGF-βΙ，促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和向髓 核樣細(xì)胞的分化。其制備方法簡(jiǎn)單易行。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1、靜電紡絲裝置，由高壓電源、噴頭及給液裝置、接受裝置構(gòu)成。高壓電源是提 供高達(dá)幾萬伏特的直流電源；噴頭為含內(nèi)外兩層的同軸噴頭，給液裝置為內(nèi)含配好的溶液 的注射器及固定注射器的注射泵；接收裝置為金屬接收板，并有導(dǎo)線接地。
[0021]圖2、A圖對(duì)構(gòu)建的椎間盤組織支架進(jìn)行掃描電鏡觀察，B圖為紡絲直徑分布進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)。
[0022] 圖3、使用投射電鏡觀察椎間盤組織支架的紡絲殼-核雙層結(jié)構(gòu)。
[0023] 圖4、使用高效液相色譜分析法測(cè)量椎間盤組織支架TGF- β 1釋放。
[0024]圖5、對(duì)椎間盤組織支架進(jìn)行了水接觸角測(cè)試。
[0025]圖6、使用ΜΤΤ方法測(cè)量人間充質(zhì)千細(xì)胞在椎間盤組織支架表面增殖情況。
[0026] 圖7、人間充質(zhì)干細(xì)胞在椎間盤組織支架表面的生長(zhǎng)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1采用本發(fā)明方法制備同椎間盤組織支架
[0028] 步驟1、將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)溶解于六氟異丙醇（HFIP)中，制成 15%PLGA溶液，即為同軸靜電紡絲外層溶液；
[0029] 步驟2、將TGF-β 1 (Prospec公司）用1%牛血清白蛋白（BSA)稀釋為濃度lng/ μ l ；
[0030] 步驟3、將聚醋酸乙烯酯（PVA)溶于超純水中，成為15%PVA溶液。
[0031] 步驟4、在2mL15%PVA溶液中加入6 μ Llng/μ L的TGF-β 1，此為同軸靜電紡絲的 內(nèi)層溶液；
[0032] 步驟5、如圖1組裝好儀器，注射器為（LSP02-1B，保定蘭格公司，China)，高壓 電源為中頻直流高壓器（RXZGF，上海日行公司，China)，針頭距離接受裝置15cm，電壓 16-18KV，注射速度0. 3mL/h，內(nèi)、外層溶液都紡1. 2mL。
[0033] 步驟6、支架完成后，保存于-20°C。
[0034] 實(shí)施例2對(duì)本發(fā)明椎間盤組織支架的性能檢測(cè)
[0035] 1、對(duì)構(gòu)建的椎間盤組織支架進(jìn)行掃描電鏡觀察，并對(duì)紡絲直徑分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié) 果見圖2。掃描電鏡結(jié)果可見紡絲直徑較為均一，大部分都分布在200?500nm范圍內(nèi)。投 射電鏡可以明顯看到椎間盤組織支架的雙層結(jié)構(gòu)。
[0036] 2、使用投射電鏡觀察椎間盤組織支架的紡絲殼-核雙層結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3。內(nèi)層核 層與外層的殼層之間可見明顯界限，說明成功得到內(nèi)外雙層殼-核結(jié)構(gòu)的紡絲。
[0037] 3、為了明確椎間盤組織支架緩釋TGF-β 1的作用，使用高效液相色譜分析法測(cè)量 其釋放。具體的，將同軸電紡支架分別置于裝有PBS緩沖液的透析袋內(nèi)，將其放置于37°C的 溫育箱內(nèi)，用處理攪拌器以50rpm的速率攪拌。按照設(shè)定好的時(shí)間（在第1，2, 3, 7, 14天)， 取出5mL的PBS，同時(shí)放入新的PBS緩沖液。釋放出TGF-β 1用HPLC/MS(Agilent，USA)測(cè) 量。共測(cè)量了 1，2, 3, 7, 14天共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果見圖4,可見蛋白的釋放隨著時(shí)間不斷增 多，具有明顯的緩釋效果。
[0038] 4、為了 了解椎間盤組織支架表面的親水性，進(jìn)行了水接觸角測(cè)試，將同軸電紡支 架以lcmX2cm的尺寸分別進(jìn)行裁剪，且注意將內(nèi)膜朝上平放在玻璃平面上，再用另一面玻 璃進(jìn)行適量按壓，使得樣品表面較為平整。然后用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量接觸角，每次用0. 5mL 超純水檢測(cè)樣品，取統(tǒng)計(jì)值分析。結(jié)果見圖5和表1。在3s，6s，12s，18s分別測(cè)量了其接觸 角。可見材料表面具有良好的親水性，且可以預(yù)測(cè)其表面適合細(xì)胞粘附、增殖、生長(zhǎng)、分化。 [0039] 表1水接觸角測(cè)試
[0040]
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 含生長(zhǎng)因子的椎間盤組織支架，其特征在于：為采用同軸靜電紡絲裝置制備得到的 同軸電紡支架；所述的生長(zhǎng)因子為TGF-β 1 ;其中，同軸電紡支架外層溶液為以六氟異丙醇 為溶劑的13?17%g/mL聚乳酸PLGA ;同軸電紡支架內(nèi)層溶液為13?17%g/mL聚乙烯醇PVA 和3 μ LTGF- β 1 ;其中TGF- β 1溶解于1%的BSA中，其濃度為lng/ μ L。
2. 如權(quán)利要求1所述的椎間盤組織支架，其特征在于：同軸電紡支架外層溶液為以六 氟異丙醇為溶劑的15%g/mL聚乳酸PLGA。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的椎間盤組織支架，其特征在于：同軸電紡支架內(nèi)層溶液為 15%g/mL聚乙烯醇PVA。
4. 椎間盤組織支架的制備方法，其特征在于：包括如下步驟： 步驟1、將聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA溶解于六氟異丙醇HFIP中，制成13?17%g/ mLPLGA溶液，即為同軸靜電紡絲外層溶液； 步驟2、將TGF-β 1用1%牛血清白蛋白BSA稀釋為濃度lng/μ L ; 步驟3、將PVA溶于超純水中，成為13?17%g/mLPVA溶液。 步驟4、在2mL15%PVA溶液中加入6μ Llng/μ L的TGF-β 1，此為同軸靜電紡絲的內(nèi)層 溶液； 步驟5、組裝好儀器，針頭距離接受裝置15cm,電壓16?18Κν，注射速度〇· 2?0. 4mL/ h，內(nèi)、外層溶液都紡1.2mL。 步驟6、支架完成后，保存于-20°C。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟！中PLGA的濃度為15%g/mL。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于：步驟3中pVA的濃度為15%g/mL。 7·如權(quán)利要求4?6任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：步驟5中注射速度為〇· 3mL/ h〇
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK104189959SQ201410087968
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】崔翔, 劉銘漢, 王加旭, 黃博, 向強(qiáng), 周躍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院