雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，發(fā)明人從馬尾藻中制備了馬尾藻多糖可溶性粉。試驗(yàn)證明，本發(fā)明馬尾藻多糖可溶性粉對(duì)人工感染雞大腸桿菌病有預(yù)防和治療作用：在易發(fā)病的時(shí)間針對(duì)性使用，可起到預(yù)防作用；在疾病發(fā)生時(shí)使用，可達(dá)到治療效果。用法用量：馬尾藻多糖可溶性粉按100～400mg/kg體重飲水給藥，1次/d，連續(xù)給藥5天。本發(fā)明可作為一種防治雞大腸桿菌病的中藥制劑，具有純天然提取、低殘留、無(wú)毒副作用、防治效果良好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥提取物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉。
【背景技術(shù)】
[0002]禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(E.Coli)引起禽類不同類型疾病的總稱，包括急性敗血癥、肉芽腫、囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、眼球炎、關(guān)節(jié)炎、腸炎以及肺炎等，最常見(jiàn)的是急性敗血癥和卵黃性腹膜炎。近年來(lái)，隨著我國(guó)集約化養(yǎng)雞業(yè)的不斷發(fā)展，飼養(yǎng)密度增加，大腸桿菌病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，特別是雛雞的發(fā)病率和病死率均較高，常常因敗血癥而急性死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因大腸桿菌的血清型很多，菌苗的免疫效果尚不理想，藥物防治仍然是控制該病的主要手段。目前，臨床常用抗生素和其他化學(xué)抗菌藥進(jìn)行治療，但病原產(chǎn)生耐藥性日趨嚴(yán)重，藥物殘留亦帶來(lái)食品安全問(wèn)題，中草藥提取物多糖因其作為純天然提取藥物，低殘留，低耐藥，無(wú)毒副作用，防治效果良好而越來(lái)越受到人們的關(guān)注，可作為未來(lái)畜禽疾病防治的一個(gè)重點(diǎn)研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種純天然提取、低殘留、低耐藥、無(wú)毒副作用、防治效果良好的雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，按以下方法制備:將馬尾藻多糖用蒸餾水配成質(zhì)量濃度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min ;取出冷卻后，2000r/min離心10min，收集上清液；按質(zhì)量比1:20在離心后殘?jiān)屑尤胝麴s水，繼續(xù)在沸水浴中水浴20min，冷卻，2000r/min離心10min，收集上清液；合并兩次上清液，過(guò)濾，充分溶解后使用噴霧干燥儀進(jìn)行干燥，即得馬尾藻多糖可溶性粉。
`[0005]馬尾藻多糖采用水煎醇沉法制備。
[0006]水提醇沉法按以下操作進(jìn)行:稱取馬尾藻粉末，加20倍蒸餾水拌勻，浸泡過(guò)夜，于60~90°C水浴加熱6~9h,提取液經(jīng)3000r/min離心10min,所得上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到1/4體積,加入3倍量體積95%乙醇,沉淀過(guò)夜,3000r/min離心10min,棄上清液，
沉淀物真空冷凍干燥即得馬尾藻多糖。
[0007]上述馬尾藻多糖可溶性粉在制備防治雞大腸桿菌病藥物方面的應(yīng)用。
[0008]針對(duì)雞大腸桿菌病缺乏安全有效藥物的問(wèn)題，發(fā)明人從馬尾藻中制備了馬尾藻多糖可溶性粉。紙層析證明，其中含有吡喃多糖、木聚糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖等；紅外線光譜顯示馬尾藻多糖主要為吡喃多糖，其多糖分子結(jié)構(gòu)中存在β-2糖苷鍵，還存在a-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。試驗(yàn)證明，本發(fā)明馬尾藻多糖可溶性粉對(duì)人工感染雞大腸桿菌病有預(yù)防和治療作用:在易發(fā)病的時(shí)間針對(duì)性使用，可起到預(yù)防作用；在疾病發(fā)生時(shí)使用，可達(dá)到治療效果。用法用量:馬尾藻多糖可溶性粉按100~400mg/kg體重飲水給藥，I次/d，連續(xù)給藥5天。本發(fā)明可作為一種防治雞大腸桿菌病的中藥制劑，具有純天然提取、低殘留、無(wú)毒副作用、防治效果良好等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)施例1
[0010]〈1>制備馬尾藻多糖
[0011]稱取馬尾藻粉末，加20倍蒸餾水拌勻，浸泡過(guò)夜，于80°C水浴加熱8h，提取液經(jīng)3000r/min離心10min,所得上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到1/4體積,加入3倍量體積95%乙醇，沉淀過(guò)夜，3000r/min離心10min,棄上清液,沉淀物真空冷凍干燥即得馬尾藻多糖。
[0012]〈2>制備馬尾藻多糖可溶性粉
[0013]將步驟〈1>制得的馬尾藻多糖用蒸餾水配成質(zhì)量濃度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min ;取出冷卻后，2000r/min離心10min，收集上清液；按質(zhì)量比1:20在離心后殘?jiān)屑尤胝麴s水，繼續(xù)在沸水浴中水浴20min，冷卻，2000r/min離心10min，收集上清液；合并兩次上清液，過(guò)濾，充分溶解后使用噴霧干燥儀進(jìn)行干燥，即得馬尾藻多糖可溶性粉。
[0014]實(shí)施例2
[0015]基本同實(shí)施例1，僅步驟〈1>中于70°C水浴加熱9h。
[0016]實(shí)施例3
[0017]基本同實(shí)施例1，僅步驟〈1>中于90°C水浴加熱6h。
[0018]實(shí)施例4`[0019]基本同實(shí)施例1，僅步驟〈1>中于75 °C水浴加熱8h。
[0020]將實(shí)施例1至4所得馬尾藻多糖可溶性粉分別按100、200、300、400mg/kg體重飲水給藥，I次/d,連續(xù)給藥5天。結(jié)果:400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg組對(duì)人工感染雞大腸桿菌肉雞的保護(hù)率分別為80.0%、60%、50% ;預(yù)防高、中、低三組的存活率依次為86.7%、70.0%、56.7%，與感染對(duì)照組相比，存活率和保護(hù)率均明顯高于感染對(duì)照組的33.3%。雛雞于攻毒發(fā)病后按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg體重的劑量,飲水給藥，I次/d,連續(xù)5天,可使病情得到控制，并逐漸趨于緩解，48h后病雞臨床癥狀基本消失，食欲逐漸恢復(fù)正常，活動(dòng)增加。3個(gè)劑量的治療組對(duì)人工感染雞大腸桿菌肉雞的治愈率分別為86.7%,76.7%,66.7%，極顯著優(yōu)于感染對(duì)照組。
[0021]馬尾藻多糖可溶性粉對(duì)人工感染雞大腸桿菌肉雞的防治試驗(yàn)
[0022]1.材料與方法
[0023]1.1 材料
[0024]1.1.1馬尾藻多糖可溶性粉，由廣西大學(xué)和廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司研制(按實(shí)施例1制備)，廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司中試生產(chǎn)，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所檢驗(yàn)符合規(guī)定。主要成分:馬尾藻多糖。批號(hào):2011011601。規(guī)格:100g/包。
[0025]1.1.2氧氟沙星可溶性粉，由河北新世紀(jì)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào):獸藥字(2007)030292633 ;生產(chǎn)日期:2012年2月13日(有效期2年)，批號(hào):12021301，規(guī)格:100g,含氧氟沙星5g/瓶。
[0026]1.1.3菌株及標(biāo)準(zhǔn)血清
[0027]雞大腸桿菌02株(CVCC251)與大腸桿菌“O”抗原定型血清，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。
[0028]1.1.4其它試劑[0029]細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。普通瓊脂、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。鮮血瓊脂平板，購(gòu)自蘭州麥迪生物科技公司。
[0030]1.1.5試驗(yàn)雞種
[0031]未經(jīng)雞大腸桿菌疫苗免疫的I日齡健康嶺南黃雛雞300羽，雌雄兼有，由蘭州華隴農(nóng)牧生態(tài)科技有限公司提供。在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所大洼山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng)飼養(yǎng)觀察12d，確認(rèn)雞群無(wú)任何大腸桿菌病癥狀和其它病癥后用于試驗(yàn)。
[0032]1.1.6飼料及飼養(yǎng)管理
[0033]飼料為不含任何抗生素的肉用仔雞全價(jià)可溶性粉料，購(gòu)自蘭州正大有限公司。實(shí)驗(yàn)雞按常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食、飲水，雞舍保持通風(fēng)。
[0034]1.2 方法
[0035]1.2.1大腸桿菌02株復(fù)壯
[0036]將凍存的大腸桿菌02開(kāi)啟后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，經(jīng)37°C培養(yǎng)20h后，取3只健康雛雞，胸肌注射肉湯培養(yǎng)物1.0ml/只。無(wú)菌采集臨床癥狀和病理變化典型的死亡雞只的肝臟和心臟血，分別接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅-美蘭瓊脂上，經(jīng)37°C培養(yǎng)20h后，觀察培養(yǎng)的細(xì)菌菌落形態(tài)，對(duì)具有特征性的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，最后將分離純化的大腸桿菌接種于血斜面，37°C培養(yǎng)20h后作為母菌種，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0037]1.2.2生化鑒定
[0038]將具有特征性形態(tài)和革蘭氏染色陰性的菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，進(jìn)行12項(xiàng)生化指標(biāo)的鑒定。
[0039]1.2.3凝集試驗(yàn)
[0040]按照中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所大腸桿菌O抗原定型血清使用說(shuō)明書(shū)制備抗原和稀釋血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)操作，明顯凝集者記為陽(yáng)性反應(yīng)，以菌液與0.5石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象。將鑒定正確的大腸桿菌02株接種于血斜面，37°C培養(yǎng)20h后，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0041]1.3雞大腸桿菌感染模型的建立
[0042]1.3.1 預(yù)攻毒
[0043]調(diào)取斜面保存的大腸桿菌02株，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)20h，菌液濃度調(diào)整為 5X108cfu/ml、lX108cfu/ml、0.2X108cfu/ml 和 0.04X 108cfu/ml4 個(gè)攻毒劑量組，每組10只雛雞，胸肌注射攻毒菌液1.0ml0攻毒6h后，雛雞開(kāi)始出現(xiàn)精神不振、縮頸扎堆癥狀，12h開(kāi)始有雞只死亡，具體如下:5X108cfu/ml劑量組(12h死亡3只，24h全部死亡)、
IX 108cfu/ml (12h 死亡 2 只，24h 全部死亡)、(λ 2X 108cfu/ml (12h 死亡 I 只，24h 死亡 5只，存活4只，72h全部死亡)，0.04X 108cfu/ml (24h死亡2只，存活8只，其中瀕死2只；48h存活8只，其中瀕死5只； 72h死亡3只，存活5只，其中瀕死2只)。
[0044]1.3.2最佳攻菌量確定
[0045]將0.2X108cfu/ml至0.04X 108cfu/ml之間的菌液濃度調(diào)整為5個(gè)濃度組，分別為 15X106cfu/ml、12.5 X 106cfu/ml UOX 106cfu/ml,7.5 X 106cfu/ml,5 X 106cfu/ml,每組10只雛雞，胸肌注射攻毒菌液1.0ml0攻毒12h后，雛雞開(kāi)始出現(xiàn)精神不振、縮頸扎堆癥狀，100%發(fā)病，根據(jù)每組肉雞發(fā)病和死亡情況確定最佳感染量，以O(shè)~72h內(nèi)死亡率60-70%為最佳感染量，并將其作為判定標(biāo)準(zhǔn)。其次，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際中雞大腸桿菌的死亡率，最終選擇
5.2X106cfu/ml作為建立雞大腸桿菌感染模型的攻毒劑量。
[0046]1.4正式試驗(yàn)分組及方法
[0047]試驗(yàn)雞除正常接種疫苗(大腸桿菌病疫苗除外)，未用任何藥物。在試驗(yàn)雞舍飼養(yǎng)至7日齡，期間剔除弱雛，選擇300羽健康供試雞隨機(jī)分為10組，每組30只，分組及處理方法見(jiàn)表1。
[0048]表1試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，其特征在于按以下方法制備:將馬尾藻多糖用蒸餾水配成質(zhì)量濃度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min ;取出冷卻后，2000r/min離心10min，收集上清液；按質(zhì)量比1:20在離心后殘?jiān)屑尤胝麴s水，繼續(xù)在沸水浴中水浴20min，冷卻，2000r/min離心10min，收集上清液；合并兩次上清液，過(guò)濾，充分溶解后使用噴霧干燥儀進(jìn)行干燥，即得馬尾藻多糖可溶性粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，其特征在于:所述馬尾藻多糖采用水煎醇沉法制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，其特征在于所述水提醇沉法按以下操作進(jìn)行:稱取馬尾藻粉末，加20倍蒸餾水拌勻，浸泡過(guò)夜，于60~90°C水浴加熱6~9h,提取液經(jīng)3000r/min離心10min,所得上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到1/4體積,加入3倍量體積95%乙醇,沉淀過(guò)夜,3000r/min離心10min,棄上清液,沉淀物真空冷凍干燥即得馬尾藻多糖。
4.權(quán)利要求1所述馬尾`藻多糖可溶性粉在制備防治雞大腸桿菌病藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/715GK103860477SQ201410088169
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】胡庭俊, 崔月明, 韋現(xiàn)色 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)