microRNA-23b及其擬似物在制備防治腎病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及microRNA-23b及其擬似物在制備防治腎病的藥物中的應(yīng)用，所述的microRNA-23b的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述microRNA-23b擬似物的核苷酸序列為在microRNA-23b的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，對除了UCACAUU堿基外的其它核苷酸進(jìn)行的核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合或核苷酸的增減、替換。本發(fā)明制備的藥物可為microRNA-23b及其擬似物的單一成分，也可為一種藥物組合物。本發(fā)明將microRNA-23b和/或其擬似物與可接受的載體鏈接形成藥物，通過靜脈，肌肉或腹腔注射等用來治療腎臟疾病，尤其針對糖尿病腎病。
【專利說明】microRNA-23b及其擬似物在制備防治腎病的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及miCix)RNA-23b及其擬似物在制備防治腎病的藥物中的應(yīng)用，具體涉及micix)RNA-23b及其擬似物在制備防治糖尿病腎病、腎小球腎炎、腎小球硬化癥、腎病綜合征、高血壓腎病等腎病的藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種世界性疾病，是目前發(fā)病率極高的一種代謝綜合征，根據(jù)WHO報(bào)道，目前全世界超過346million人患有糖尿病。在我國，目前大約有4300萬名糖尿病患者，居全球第二位。糖尿病可并發(fā)多種并發(fā)癥，糖尿病腎病(Diabeticnephropathy, DN)是其并發(fā)癥之一，約占糖尿病慢性并發(fā)癥的20_30%，是引起終末期腎衰竭，DM病人死亡的主要原因之一。據(jù)估計(jì)10-20%的糖尿病患者死于腎功能衰竭。
[0003]DN同其他腎性疾病相類似如腎小球腎炎、腎病綜合征、高血壓腎病等腎病一樣，主要臨床癥狀都表現(xiàn)為蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能異常等臨床癥狀。早期的主要病理特征同腎小球腎炎、腎病綜合征、高血壓腎病一樣主要表現(xiàn)為腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚及系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)的進(jìn)行性積聚；后期為腎小球、腎小管間質(zhì)的纖維化，最終導(dǎo)致蛋白尿和腎功能衰竭。糖尿病高糖血癥是導(dǎo)致DN的重要因素，細(xì)胞內(nèi)高葡萄糖濃度引起的山梨糖醇-醛糖還原酶的激活通路，氨基己糖生物合成途徑，蛋白激酶C，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，參與糖尿病腎病的發(fā)病 [0004]目前，對于糖尿病腎病的防治效果并不理想，極易造成多種并發(fā)癥的產(chǎn)生，因此急需建立一種以新的治療靶點(diǎn)研發(fā)的有效藥物。microRNAUiRNA)起源于內(nèi)源性表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，是長約21-25nt的雙鏈RNA分子。成熟的microRNA可以結(jié)合基因沉默復(fù)合體(RNA-1nducedSilencing Complex, RISC)并與祀標(biāo)mRNA并列互補(bǔ)；microRNA和祀序列的互補(bǔ)程度決定了靶基因mRNA在翻譯水平被部分抑制或完全斷裂。植物體中，斷裂似乎是主要的工作方式，而哺乳動物中則以翻譯水平的抑制為主要方式。研究表明，miCToRNA廣泛參與發(fā)育、凋亡、分化、增殖、代謝等過程的調(diào)控，在生命體的各種生命活動中發(fā)揮著重要作用。近年來，基于microRNA為靶點(diǎn)的藥物不斷獲得實(shí)驗(yàn)成功，從而為各種病癥的治療帶來新的希望，因此，以microRNA做為治療肥胖和血脂異常的新靶點(diǎn)有著十分重大的突破性和應(yīng)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明米用多種技術(shù)手段證明了 microRNA_23b (miR_23b)及其擬似物在制備防治腎病的藥物中的應(yīng)用，具體涉及microRNA-23b及其擬似物在制備防治糖尿病腎病、腎小球腎炎、腎病綜合征、高血壓腎病等腎病的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的microRNA-23b的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；所述microRNA_23b擬似物的核苷酸序列為為在microRNA-23b的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，對除了 UCACAUU堿基外的其它核苷酸進(jìn)行的核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合或核苷酸的增減、替換。優(yōu)選的，所述的microRNA-23b擬似物的核苷酸序列為在microRNA-23b的核苷酸序列的基礎(chǔ)上對堿基進(jìn)行了甲基化修飾，并對5’端利用膽固醇進(jìn)行了標(biāo)記。
[0006]本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明所述的miCix)RNA-23b及其擬似物的核苷酸序列進(jìn)行適當(dāng)修飾，所述的修飾包括任意核苷酸的核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合或任意核苷酸的增減、替換，只要修飾后的核苷酸序列仍具有與miCix)RNA-23b相同的活性就應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍之內(nèi)。
[0007]進(jìn)一步的，本發(fā)明還包括microRNA_23b作為腎臟疾病的診斷檢測的血清biomarker (標(biāo)志物)，優(yōu)選的，所述腎臟疾病包括糖尿病腎病、腎小球腎炎、腎小球硬化征、腎病綜合征或高血壓腎病等。
[0008]更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防或治療腎臟疾病藥物組合物，所述組合物含有microRNA-23b或者microRNA-23b的擬似物以及藥學(xué)上接受的載體。優(yōu)選的，所述腎臟疾病選自糖尿病腎病、腎小球腎炎、腎小球硬化征、腎病綜合征或高血壓腎病等。更優(yōu)選的，所述的載體為病毒、膽固醇、納米顆粒、殼聚糖或脂質(zhì)體。
[0009]在本發(fā)明中，可將上述組合物按照藥物制備的常規(guī)方法制成注射制劑，口服制劑，噴霧制劑，軟膏制劑或貼劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為糖尿病患者及糖尿病腎病和其他炎性腎病患者血清中miCix)RNA-23b的表達(dá)變化情況；及糖尿病腎病患者血清中miCix)RNA-23b的表達(dá)量與尿液中尿蛋白含量的相關(guān)性；I型糖尿腎病及I I型糖尿腎病小鼠腎臟組織中miCix)RNA-23b表達(dá)變化；其中，圖1A中Con為正常人血清，2Di為2型糖尿病病人血清，IDi為I型糖尿病病人血清，DN為糖尿病腎病病人血清，Cl為其他炎性腎病病人的血清；圖1B中Con為正常C57小鼠，Db/Db為2型轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠；圖1C中Con為正常C57小鼠，Dia為I型糖尿病小鼠；圖1D中糖尿病腎病患者血清中microRNA-23b的表達(dá)與尿液中蛋白含量的相關(guān)性，結(jié)果顯示為R2=0.3336,p值小于0.01 ；
[0011]圖2為I型糖尿病I個(gè)月至6個(gè)月腎臟組織中microRNA-23b的表達(dá)變化圖；
[0012]圖3為miCix)RNA-23b升高可抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，降低可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖圖；其中，A:miCix)RNA-23b擬似物抑制高糖所誘導(dǎo)的HK-2 (腎小管上皮細(xì)胞)細(xì)胞增殖；B:microRNA-23b抑制劑促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖；
[0013]圖4為miCix)RNA-23b抑制糖尿病腎病細(xì)胞模型和動物模型中纖維蛋白的生成圖；其中，A:micr0RNA-23b抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2 (腎小管上皮細(xì)胞)細(xì)胞中纖維蛋白(FN)的產(chǎn)生；B:miR-23b抑制糖尿病腎病小鼠腎小球中的纖維蛋白(FN)生成；
[0014]圖5為microRNA-23b抑制糖尿病腎病腎臟組織中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)圖；
[0015]圖6為microRNA-23b抑制糖尿病腎病中蛋白尿圖；其中，Con為正常C57小鼠尿液尿微量白蛋白含量；Db/Db為2型糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠尿液中尿微量白蛋白含量；microRNA-23b為2型糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠注射microRNA-23b擬似物后尿液中尿微量白蛋白含量；MiNEG為2型糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠注射microRNA-23b擬似物陰性對照后尿液中尿微量白蛋白含量；
[0016]圖7為miCix)RNA-23b抑制糖尿病腎病腎小球中足突融合圖；其中，A為正常C57小鼠腎臟中腎小球內(nèi)足突；B為2型糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟中腎小球內(nèi)足突；C為2型糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠注射microRNA-23b擬似物一個(gè)月后腎小球內(nèi)足突；D為2型糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠注射microRNA-23b擬似物陰性對照一個(gè)月后腎小球內(nèi)足突。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0018]實(shí)施例1 microRNA-23b及其擬似物對糖尿病腎病的治療作用
[0019]選用體重為45_50g成年健康db/db轉(zhuǎn)基因II型糖尿病肥胖小鼠，分為4組:(I)正常對照組；(2) db/db轉(zhuǎn)基因II型糖尿病肥胖小鼠；(3) db/db轉(zhuǎn)基因II型糖尿病肥胖小鼠注射含有microRNA-23b序列(SEQ ID N0.1所示)的試劑，注射劑量為0.2ml/1OnM ； (4)db/db轉(zhuǎn)基因II型糖尿病肥胖小鼠注射陰性對照試劑，陰性對照試劑主要成分為含有SEQID N0.2所示序列的試劑，注射劑量為0.2ml/10nM。
[0020]該microRNA與任何人、大鼠、小鼠microRNA幾乎無同源性，廣泛用于microRNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，注射注射劑量為0.2ml/10nM。3、4、5組Db/Db小鼠每3天注射一次，一個(gè)月后進(jìn)行取材、取血清。
[0021]試驗(yàn)結(jié)果:
[0022]如圖1所示，結(jié)果可見miciORNAISb在I型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病腎病、及其他腎小球腎炎腎病中顯著降低(p<0.05，P〈0.001), microRNA-23b與糖尿病腎病患者尿液中蛋白含量呈負(fù)相關(guān)有顯著性差異，同時(shí)在I型糖尿病和II型糖尿病腎病小鼠組織中顯著降低，miCix)RNA-23b可以作為糖尿病腎病和炎性腎病的生物標(biāo)志物。圖2所示miCix)RNA-23b在I型糖尿病動物模型1_6個(gè)月腎臟中呈持續(xù)性降低。圖3所示miCix)RNA-23b表達(dá)升高可以抑制細(xì)胞增殖，表達(dá)降低促進(jìn)細(xì)胞增殖。圖4所示microRNA-23b在細(xì)胞模型和動物模型中顯著抑制纖維蛋白的產(chǎn)生，具有抗纖維化作用。圖5所示microRNA-23b還拮抗其他纖維環(huán)因子基因表達(dá)。圖6所示microRNA_23b可以抑制糖尿病腎病小鼠尿液中尿微量白蛋白的產(chǎn)生。圖7所示miCix)RNA-23b可以抑制糖尿病腎病小鼠腎臟腎小球內(nèi)足突融合。
[0023] 本實(shí)驗(yàn)證明了 microRNA_23b體內(nèi)注射可顯著改善糖尿病腎病，說明microRNA-23b可作為糖尿病腎病和腎小球腎炎腎病的生物標(biāo)記物，microRNA_23b可以作為預(yù)防和治療糖尿病腎病及腎小球腎炎疾病的新藥物。
【權(quán)利要求】
1.microRNA-23b及其擬似物在制備防治腎病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的microRNA-23b的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；所述microRNA_23b擬似物的核苷酸序列為在microRNA-23b的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，對除了 UCACAUU堿基外的其它核苷酸進(jìn)行的核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合或核苷酸的增減、替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miCix)RNA-23b擬似物的核苷酸序列為在micr0RNA-23b的核苷酸序列的基礎(chǔ)上對堿基進(jìn)行了甲基化修飾，并對5’端利用膽固醇進(jìn)行了標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腎病包括糖尿病腎病、腎小球腎炎、腎小球硬化征、腎病綜合征或高血壓腎病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的microRNA-23b的核苷酸序列作為腎臟疾病診斷檢測的血清標(biāo)志物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腎臟疾病包括糖尿病腎病、腎小球腎炎、腎小球硬化征、腎病綜合征或高血壓腎病等。
6.一種用于預(yù)防或治療腎臟疾病藥物組合物，其特征在于，所述組合物中含有microRNA-23b或者microRNA_23b的擬似物以及藥學(xué)上接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的載體為病毒、膽固醇、納米顆粒、殼聚糖或脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物按照藥物制備的常規(guī)方法制成注射制劑，口服制劑，噴霧制劑，軟膏制劑或貼劑等。
【文檔編號】A61P3/10GK103948940SQ201410095609
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】趙冰海, 初彥輝, 李洪志, 劉潔婷, 柏合, 張春雷 申請人:牡丹江醫(yī)學(xué)院