一種同軸靜電紡絲纖維支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同軸靜電紡絲纖維支架，屬于生物組織工程領(lǐng)域。該支架包括偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脂肪族聚酯殼層和負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β1的聚乙烯吡咯烷酮芯層，不僅安全無毒且生物相容性優(yōu)異，還能募集更多量的BMSC，并促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化，進(jìn)而得到更多的新生軟骨組織，使軟骨有效快速地進(jìn)行修復(fù)。本發(fā)明還公開了該同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，通過在無風(fēng)環(huán)境下，使用脂肪族聚酯殼層溶液和含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β1的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到纖維支架；將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到上述纖維支架表面，得到本發(fā)明納米級(jí)同軸靜電紡絲纖維支架。本發(fā)明方法簡單，易控制，實(shí)用性較強(qiáng)。
【專利說明】一種同軸靜電紡絲纖維支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種同軸靜電紡絲纖維支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維支架是一種生物組織工程支架，由于其具有與天然細(xì)胞外基質(zhì)相近的納米級(jí)結(jié)構(gòu)，能夠仿生細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有支撐細(xì)胞生長、引導(dǎo)組織再生、控制組織結(jié)構(gòu)和釋放生物活性因子等作用。由于纖維支架的材料和結(jié)構(gòu)是影響其功能的主要因素，所以對(duì)纖維支架的制備十分重要。利用同軸靜電紡絲技術(shù)所制備的納米級(jí)纖維不僅具有較高的比表面積和孔隙率，還具有和細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)，能夠有效應(yīng)用在組織工程法修復(fù)軟骨損傷過程中。在組織工程法修復(fù)軟骨損傷過程中，置于軟骨缺損區(qū)的纖維支架將募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC), BMSC 在該纖維支架中生長，并向成軟骨方向分化，引導(dǎo)軟骨組織再生，促進(jìn)軟骨修復(fù)。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)使用聚己內(nèi)酯的氯仿溶液作為殼層溶液，蛋白質(zhì)-聚乙二醇(PEG)的氯仿溶液作為芯層溶液，通過采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備得到具有與天然細(xì)胞外基質(zhì)相近的納米級(jí)結(jié)構(gòu)的同軸靜電紡絲纖維支架，該同軸靜電紡絲纖維支架包括聚己內(nèi)酯殼層和聚乙二醇芯層。
[0004]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:
[0005]由于現(xiàn)有技術(shù)制備的同軸靜電紡絲纖維支架中的聚己內(nèi)酯殼層為疏水性，難以結(jié)合BMSC， 使其在軟骨缺損區(qū)募集的BMSC較少、且BMSC成軟骨方向分化的能力較弱，致使新生軟骨組織較少，不利于軟骨有效快速地進(jìn)行修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)同軸靜電紡絲纖維支架在軟骨缺損區(qū)募集的BMSC較少、且BMSC成軟骨方向分化的能力較弱的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架。所述技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架，所述同軸靜電紡絲纖維支架包括脂肪族聚酯殼層和聚乙烯吡咯烷酮芯層，所述脂肪族聚酯殼層表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽，所述聚乙烯吡咯烷酮芯層中負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I。
[0008]具體地，作為優(yōu)選，所述同軸靜電紡絲纖維支架還包括牛血清蛋白，所述牛血清蛋白負(fù)載在所述聚乙烯吡咯烷酮芯層中。
[0009]具體地，作為優(yōu)選，所述脂肪族聚酯殼層中脂肪族聚酯選自聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚(乳酸-己醇)共聚物中的至少一種。
[0010]具體地，作為優(yōu)選，脂肪族聚酯殼層中脂肪族聚酯、聚乙烯吡咯烷酮芯層中聚乙烯吡咯烷酮和所述牛血清蛋白質(zhì)量比為1-1.5:0.35-0.55:0.01-0.015。
[0011]具體地，作為優(yōu)選，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。[0012]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，所述方法包括:
[0013]制備脂肪族聚酯殼層溶液:將脂肪族聚酯溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到所述脂肪族聚酯殼層溶液；
[0014]制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液:將聚乙烯吡咯烷酮溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到所述聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液，向所述聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液中加入重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β 1，攪拌至混合均勻，得到所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液；
[0015]在無風(fēng)環(huán)境下，分別將所述脂肪族聚酯殼層溶液和所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液注入殼層溶液注射器和芯層溶液注射器中，進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架；
[0016]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的同軸靜電紡絲纖維支架的表面，得到所述同軸靜電紡絲纖維支架；
[0017]制備脂肪族聚酯殼層溶液所用的有機(jī)溶劑與制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液所用的有機(jī)溶劑為同一種。
[0018]具體地，作為優(yōu)選，所述方法還包括:在制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的過程中，向所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液中加入牛血清蛋白。
[0019]具體地，作為優(yōu)選，所述脂肪族聚酯殼層溶液的濃度為0.14g/ml-0.16g/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的濃度為0.065g/ml-0.075g/ml。
[0020]具體地，作為優(yōu)選，所述有機(jī)溶劑選自三氟乙醇、甲酸、六氟異丙醇、三氯甲烷、乙醇中的至少一種。
[0021]具體地，作為優(yōu)選，所述同軸靜電紡絲的操作參數(shù)為:紡絲電壓為10.5-10.SKv ;噴絲頭到收集板的距離為18-20cm ;脂肪族聚酯殼層溶液的推進(jìn)速度為0.20-0.22毫升/小時(shí)；含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的推進(jìn)速度為0.13-0.15毫升/小時(shí)；殼層溶液注射器的針頭內(nèi)徑為0.89-0.91毫米；芯層溶液注射器的針頭內(nèi)徑為 0.40-0.42 毫米。
[0022]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:
[0023]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架，其包括偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脂肪族聚酯殼層和負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層。通過脂肪族聚酯殼層與聚乙烯吡咯烷酮芯層的結(jié)合，不僅使該纖維支架具有了安全無毒且生物相容性優(yōu)異的特點(diǎn)，還使該纖維支架為負(fù)載并緩釋生物活性因子提供了良好的生物平臺(tái)。在該生物平臺(tái)的基礎(chǔ)上，通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到脂肪族聚酯殼層表面，能夠加強(qiáng)BMSC與纖維支架的結(jié)合，促使該纖維支架將在軟骨缺損區(qū)募集到更多量的BMSC ;通過將重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I負(fù)載到聚乙烯吡咯烷酮芯層中，能夠促進(jìn)該更多量的BMSC成軟骨方向分化，進(jìn)而得到更多的新生軟骨組織，使軟骨有效快速地進(jìn)行修復(fù)。
[0024]本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，通過在無風(fēng)環(huán)境下，使用脂肪族聚 酯殼層溶液和含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架；并將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到上述纖維支架中脂肪族聚酯殼層的表面，得到本發(fā)明期望的具有與天然細(xì)胞外基質(zhì)相近的納米級(jí)結(jié)構(gòu)的同軸靜電紡絲纖維支架。該支架安全無毒，比表面積和孔隙率較高，且具有募集BMSC并促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化的能力。本發(fā)明方法簡單，易控制，實(shí)用性較強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0026]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架的制備流程圖；
[0027]圖2是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架的制備流程圖；
[0028]圖3是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架的制備過程示意圖；
[0029]圖4是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架的透射電鏡圖；
[0030]圖5是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架的掃描電鏡圖；
[0031]圖6是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架的直徑分布圖；
[0032]圖7a、圖7b、圖7c和圖7d是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架募集BMSC的能力示意圖；
[0033]圖8a、圖8b和圖8c是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架對(duì)rhTGF-β I的緩釋能力示意圖；
[0034]圖9a、圖％、圖9c和圖9d是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架促BMSC成軟骨方向分化的能力示意圖。
[0035]其中，I殼層溶液注射器，
[0036]2芯層溶液注射器，
[0037]3噴絲頭，
[0038]4收集板，
[0039]5同軸靜電紡絲纖維支架，
[0040]51脂肪族聚酯殼層，
[0041]52聚乙烯吡咯烷酮芯層，
[0042]53 rhTGF-β I 因子，
[0043]6中空狀同軸電紡絲纖維支架，
[0044]7不含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架，
[0045]8含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架，
[0046]9含Ε7多肽和rhTGF- β I的同軸靜電紡絲纖維支架。
【具體實(shí)施方式】
[0047]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0048] 實(shí)施例1[0049]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架5，該纖維支架包括脂肪族聚酯殼層51和聚乙烯吡咯烷酮芯層52，該脂肪族聚酯殼層51表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽，該聚乙烯吡咯烷酮芯層52中負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I。
[0050]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架5，其包括偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脂肪族聚酯殼層51和負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層52。通過脂肪族聚酯殼層51與聚乙烯吡咯烷酮芯層52的結(jié)合，不僅使該纖維支架具有了安全無毒且生物相容性優(yōu)異的特點(diǎn)，還使該纖維支架為負(fù)載并緩釋生物活性因子提供了良好的生物平臺(tái)。在該生物平臺(tái)的基礎(chǔ)上，通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到脂肪族聚酯殼層51表面，能夠加強(qiáng)BMSC與纖維支架的結(jié)合，促使該纖維支架將在軟骨缺損區(qū)募集到更多量的BMSC ;通過將重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I負(fù)載到聚乙烯吡咯烷酮芯層52中，能夠促進(jìn)該更多量的BMSC成軟骨方向分化，進(jìn)而得到更多的新生軟骨組織，使軟骨有效快速地進(jìn)行修復(fù)。
[0051]實(shí)施例2
[0052]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架5，該纖維支架包括脂肪族聚酯殼層51和聚乙烯吡咯烷酮芯層52，該脂肪族聚酯殼層51表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽，該聚乙烯吡咯烷酮芯層52中負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I和牛血清蛋白。
[0053]由于聚乙烯吡咯烷酮是一種安全無毒的水溶性醫(yī)藥中間體及藥物輔劑，能與多種物質(zhì)互溶或復(fù)合，使同軸靜電紡絲纖維支架5安全無毒且具有優(yōu)異的生物相容性；由于聚乙烯吡咯烷酮的N-H或O-H鍵能與多種藥物和/或生物活性因子形成分子間的締合作用，并通過該締合作用控制藥物和/或生物活性因子的釋放時(shí)間和作用強(qiáng)度，延長該藥物和/或生物活性因子在體內(nèi)的釋放和吸收時(shí)間，能夠賦予同軸靜電紡絲纖維支架5負(fù)載并緩釋藥物和/或生物活性因子的功能。基于以上所述，本發(fā)明實(shí)施例使用聚乙烯吡咯烷酮材料作為同軸靜電紡絲纖維支架5的芯層。
[0054]對(duì)于生物活性因子而言，重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I (以下簡稱:rhTGF_i3 I)是促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化的標(biāo)準(zhǔn)生物因子，所以本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選rhTGF-β I?？梢岳斫獾氖?，還可將其它具有促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化能力的生物活性因子負(fù)載到聚乙烯吡咯烷酮芯層52中。由于rhTGF-β I的生物半衰期較短，易流失，本發(fā)明實(shí)施例將rhTGF-β I負(fù)載(即包裹)在同軸電紡絲纖維支架的聚乙烯吡咯烷酮芯層52結(jié)構(gòu)中，以防止其流失，保證其能夠促進(jìn)該更多量的BMSC成軟骨方向分化。進(jìn)一步地，為了保證rhTGF-β I在較長的時(shí)間內(nèi)具有良好的生物活性，本發(fā)明實(shí)施例還將作為蛋白保護(hù)劑和穩(wěn)定劑的牛血清蛋白加入聚乙烯吡咯烷酮芯層52，以助于保持rhTGF-β I的生物活性。
[0055]具體地，作為優(yōu)選，脂肪族聚酯殼層51中脂肪族聚酯選自聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚(乳酸-己醇)共聚物中的至少一種。
[0056]基于對(duì)殼層的生物分解性、機(jī)械性能和加工性能的要求，本發(fā)明實(shí)施例纖維支架的殼層材料選用聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚(乳酸-己醇)共聚物中的至少一種。而聚己內(nèi)酯由于具有良好的生物相容性及生物降解性、與其它高分子聚合物良好的相容性、良好的溶劑溶解性等優(yōu)點(diǎn) ，本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選聚己內(nèi)酯作為殼層材料，從而賦予所制備的同軸靜電紡絲纖維支架5優(yōu)異的支架性能。
[0057]具體地，脂肪族聚酯殼層中脂肪族聚酯、聚乙烯吡咯烷酮芯層中聚乙烯吡咯烷酮和牛血清蛋白質(zhì)量比為1-1.5:0.35-0.55:0.01-0.015。
[0058]為了較好地控制所制備的同軸靜電紡絲纖維支架5的結(jié)構(gòu)，使其具有較高的比表面積和孔隙率，同時(shí)使重組人轉(zhuǎn)化生長因子I和牛血清蛋白的負(fù)載量和緩釋能力處于較佳的平衡點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例將脂肪族聚酯、聚乙烯吡咯烷酮以及牛血清蛋白的質(zhì)量比控制在1-1.5:0.35-0.55:0.01-0.015。作為優(yōu)選，脂肪族聚酯、聚乙烯吡咯烷酮以及牛血清蛋白的質(zhì)量比為1:0.35:0.015?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明提供的同軸靜電紡絲纖維支架5中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的量控制在其剛好充分地均勻分布在脂肪族聚酯殼層51為宜；重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的量控制在其剛好充分地均勻分布在牛血清蛋白中為宜。
[0059]具體地，作為優(yōu)選，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。
[0060]為了使本發(fā)明實(shí)施例提供的纖維支架在軟骨缺損區(qū)募集到更多的BMSC，提高該纖維支架募集BMSC的能力，本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。更具體地，該骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽為一種由7個(gè)氨基酸組成的功能性BMSC特異性親和肽:Ε7多肽。
[0061]可以理解的是，為了保證BMSC成軟骨方向分化的能力，重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的純度也應(yīng)控制在大于等于95%的范圍內(nèi)。
[0062]實(shí)施例3
[0063]如附圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架5的制備方法，包括:
[0064]步驟101:制備脂肪族聚酯殼層溶液:將脂肪族聚酯溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到脂肪族聚酯殼層溶液。
[0065]步驟102:制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液:將聚乙烯吡咯烷酮溶于同有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液，向該聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液中加入重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β 1，攪拌至混合均勻，得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液。
[0066]步驟103:在無風(fēng)環(huán)境下，分別將脂肪族聚酯殼層溶液和含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液注入殼層溶液注射器I和芯層溶液注射器2中，進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架。
[0067]步驟104:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的同軸靜電紡絲纖維支架的表面，得到同軸靜電紡絲纖維支架5。
[0068]其中，制備脂肪族聚酯殼層51的溶液所用的有機(jī)溶劑與制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層52的溶液所用的有機(jī)溶劑為同一種。
[0069]本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架5的制備方法，通過在無風(fēng)環(huán)境下，使用脂肪族聚酯殼層51的溶液和含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層52的溶液進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架；并將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到上述纖維支架中脂肪族聚酯殼層51的表面，得到本發(fā)明 期望的納米級(jí)同軸靜電紡絲纖維支架5。該支架安全無毒，比表面積和孔隙率較高，且具有募集更多BMSC并促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化的能力。本發(fā)明方法簡單，易控制，實(shí)用性較強(qiáng)。
[0070]實(shí)施例4[0071]如附圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同軸靜電紡絲纖維支架5的制備方法，包括:
[0072]步驟201:制備脂肪族聚酯殼層溶液:將脂肪族聚酯溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到脂肪族聚酯殼層51的溶液，控制該脂肪族聚酯殼層溶液的濃度為0.Hg/ml-0.16g/ml。
[0073]同軸靜電紡絲過程要求殼層和芯層溶液具有合適的濃度，可以理解的是，濃度和粘度成正比。為了保證脂肪族聚酯殼層溶液有足夠大的表面張力和電場(chǎng)力相平衡，并通過該平衡力的作用在噴絲口處形成穩(wěn)定的泰勒錐，進(jìn)而保證所制備的纖維支架具有穩(wěn)定均一的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明實(shí)施例在可紡絲的情況下，控制該脂肪族聚酯殼層溶液的濃度為0.Hg/ml-0.16g/ml,優(yōu)選 0.15g/ml。
[0074]步驟202:制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液:將聚乙烯吡咯烷酮溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液，控制該聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的濃度為0.065g/ml-0.075g/ml,向該聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液中加入重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I和牛血清蛋白，攪拌至混合均勻，得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液。
[0075]其中，為了提高纖維支架中殼層與芯層的相容性，步驟201中制備脂肪族聚酯殼層溶液所用的有機(jī)溶劑與步驟202中制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液所用的有機(jī)溶劑為同一種。
[0076]由于芯層溶液的濃度既不能太大又不能太小，因?yàn)樵谄渌麠l件恒定的情況下，芯層溶液的濃度過大，則殼層溶液在交界面處產(chǎn)生的對(duì)芯層溶液的粘性摩擦力將不能克服自身的粘彈力，進(jìn)而不 能很好的牽伸形成復(fù)合噴射細(xì)流；芯層溶液的粘度過小，則不能形成連續(xù)的穩(wěn)定的噴射細(xì)流，導(dǎo)致該同軸靜電紡絲過程的不穩(wěn)定性增加。所以，本發(fā)明實(shí)施例控制該聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的濃度為0.065g/ml-0.075g/ml，優(yōu)選0.07g/ml。
[0077]步驟203:在無風(fēng)環(huán)境下，分別將所脂肪族聚酯殼層溶液和含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液注入殼層溶液注射器I和芯層溶液注射器2中，進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架。
[0078]如附圖3所示，同軸靜電紡絲過程中，殼層溶液和芯層溶液分別經(jīng)殼層溶液注射器I和芯層溶液注射器2進(jìn)行推注，在同一噴絲頭3處形成纖維射流，并由收集板4 (優(yōu)選鋁箔)進(jìn)行收集，得到同軸靜電紡絲纖維支架。該纖維射流在未固化之前，其結(jié)構(gòu)很容易受到外界因素的影響，為了保證所得到的纖維支架的結(jié)構(gòu)及長度均一穩(wěn)定，本發(fā)明實(shí)施例在無風(fēng)環(huán)境下進(jìn)行同軸靜電紡絲操作。
[0079]步驟204:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的同軸靜電紡絲纖維支架的表面，得到同軸靜電紡絲纖維支架5。
[0080]其中，上述將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的同軸靜電紡絲纖維支架的表面指的是將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到該纖維支架中脂肪族聚酯殼層51的表面。
[0081]具體地，上述有機(jī)溶劑選自三氟乙醇、甲酸、六氟異丙醇、三氯甲烷、乙醇中的至少一種。
[0082]為了有效減小殼層和芯層溶液之間的界面張力，使殼層溶液帶動(dòng)芯層溶液進(jìn)行更好的牽伸，形成較好的復(fù)合噴射細(xì)流；且保證得到的纖維支架中芯層-殼層邊界分明，結(jié)構(gòu)更加完善，本發(fā)明實(shí)施例選用三氟乙醇、甲酸、六氟異丙醇、三氯甲烷、乙醇中的至少一種作為靜電紡絲有機(jī)溶劑，優(yōu)選三氟乙醇。
[0083]具體地，作為優(yōu)選，上述同軸靜電紡絲的操作參數(shù)為:紡絲電壓為10.5-10.SKv ;噴絲頭3到收集板4的距離為18-20cm ;脂肪族聚酯殼層溶液的推進(jìn)速度為0.20-0.22毫升/小時(shí)；含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的推進(jìn)速度為
0.13-0.15毫升/小時(shí)；殼層溶液注射器I的針頭內(nèi)徑為0.89-0.91毫米；芯層溶液注射器2的針頭內(nèi)徑為0.40-0.42毫米。
[0084]同軸靜電紡絲過程中，對(duì)其操作參數(shù)的控制十分關(guān)鍵。具體地，控制芯層和殼層溶液的流速對(duì)于得到形態(tài)良好的芯-殼結(jié)構(gòu)的纖維支架來說十分關(guān)鍵。為了防止芯層溶液流速太快以至于突破殼層溶液的包裹，以形成穩(wěn)定的復(fù)合噴射細(xì)流；為了避免殼層溶液進(jìn)行單獨(dú)的靜電紡絲，得到形態(tài)良好的粗細(xì)均勻的連續(xù)的芯-殼結(jié)構(gòu)的纖維支架，本發(fā)明實(shí)施例將聚己內(nèi)酯殼層溶液的推進(jìn)速度控制在0.20-0.22毫升/小時(shí)，優(yōu)選0.21毫升/小時(shí)；將含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的推進(jìn)速度控制在0.13-0.15毫升/小時(shí)，優(yōu)選0.14毫升/小時(shí)。
[0085]對(duì)于紡絲電壓而言，當(dāng)所加的電壓不同時(shí)，為打破表面張力與電場(chǎng)力的平衡，毛細(xì)管頂端的液滴將會(huì)產(chǎn)生不同的表面形狀，影響隨后產(chǎn)生的噴射液滴及細(xì)流尺寸的分布情況、纖維形態(tài)和其所傳導(dǎo)的電流大小。當(dāng)所施加的電壓較低時(shí)，初始噴射點(diǎn)突于噴頭的外偵牝噴射細(xì)流也將于液滴尖端產(chǎn)生，此時(shí)液滴的直徑大于噴射針頭的孔徑，所得的納米纖維較細(xì)，結(jié)珠較少；當(dāng)電壓增加后，噴射液滴將縮入噴射針頭中，使噴射細(xì)流隨之由針頭尖端產(chǎn)生，所得納米纖維的線密度和結(jié)珠密度也會(huì)有相應(yīng)的增加；電壓繼續(xù)增加至上臨界，則細(xì)流將會(huì)由針頭內(nèi)壁直接劇烈噴射而出，不再形成噴射細(xì)流，而只形成噴射液滴，使接珠密度急劇上升。基于以上，本發(fā)明實(shí)施例將紡絲電壓控制在10.5-10.8Κν，優(yōu)選10.6Κν，從而保證所得到的纖維支架為納米級(jí)結(jié)構(gòu)，且順滑無結(jié)珠。
[0086]對(duì)于噴絲頭3到收集板4的距離來說，一方面，為了防止所制備的纖維支架過于分散，收集板4收集一定厚度的纖維支架所需時(shí)間過長；另一方面，為了防止所得到的纖維支架形成帶狀或串珠狀結(jié)構(gòu)，本發(fā)明實(shí)施例控制噴絲頭3到收集板4的距離為18-20cm，優(yōu)選20cmo
[0087]進(jìn)一步地，為了使所制備的纖維支架的芯-殼結(jié)構(gòu)清晰且均勻，本發(fā)明實(shí)施例將殼層溶液注射器I的針頭內(nèi)徑控制在0.89-0.91毫米，優(yōu)選0.90毫米；將芯層溶液注射器2的針頭內(nèi)徑控制在0.40-0.42毫米，優(yōu)選0.41毫米。
[0088]實(shí)施例5
[0089]1)制備含有rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架:
[0090]配制濃度為0.15g/ml的聚己內(nèi)酯的三氟乙醇溶液作為殼層溶液，配制濃度為0.07g/ml的聚乙烯吡咯烷酮的三氟乙醇溶液作為芯層溶液，并向該芯層溶液中加入rhTGF-β I和牛血清蛋白，攪拌均勻，制備得到含rhTGF-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液，控制該溶液中rhTGF-β I的濃度為5μ g/ml ;牛血清蛋白的濃度為0.002g/ml。
[0091]如附圖3所示，在無風(fēng)環(huán)境下，分別將上述制備的聚己內(nèi)酯殼層溶液和含rhTGF- β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液加入殼層溶液注射器I和芯層溶液注射器2中，進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架。具體地，該支架為大致均勻的圓柱狀纖維，該支架的殼層為聚己內(nèi)酯；該支架的芯層為含rhTGF-βΙ和牛血清蛋白的聚乙烯吡咯烷酮。
[0092]在上述同軸靜電紡絲過程中，控制紡絲電壓為10.6Κν ;噴絲頭3到收集板4的距離為20cm;聚己內(nèi)酯殼層溶液的推進(jìn)速度為0.21毫升/小時(shí)；含rhTGF-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的推進(jìn)速度為0.14毫升/小時(shí)；殼層溶液注射器I的針頭內(nèi)徑為0.90毫米；芯層溶液注射器2的針頭內(nèi)徑為0.41毫米。
[0093]2)將Ε7多肽偶聯(lián)到含有rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架上
[0094]a)將含有rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架放入12孔板的孔洞中，并加入I毫升濃度為0.lg/ml的1，6-己二胺溶液，37°C反應(yīng)lh。反應(yīng)完畢后，去離子水小心洗滌該支架2遍。
[0095]b)在12孔板的每個(gè)孔洞中加入400 μ I濃度為2mg/mL的4_(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉，室溫反應(yīng)lh。
[0096]c)將異硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的E7多肽溶于磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為0.lmg/ml的E7多肽的磷酸鹽緩沖溶液，在上述12孔板的每個(gè)孔洞注入400 μ I該Ε7多肽的磷酸鹽緩沖溶液來浸潤上述纖維支架，37°C反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢，去離子水沖洗上述各支架2遍，得到含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9。將該纖維支架真空冷凍干燥，-20°C保存。
[0097]利用透射電鏡觀察上述制備的纖維支架，如附圖4所示，本發(fā)明實(shí)施例制備的同軸靜電紡絲纖維支架5可 見明顯的清晰的“殼-芯”雙層結(jié)構(gòu)，且脂肪族聚酯殼層51和聚乙烯吡咯烷酮芯層52的結(jié)構(gòu)完整均一，說明負(fù)載有牛血清蛋白和rhTGF-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層52被脂肪族聚酯殼層51成功包裹?？梢岳斫獾氖?，本發(fā)明實(shí)施例中同軸靜電紡絲纖維支架5與含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9為同一種。
[0098]利用掃描電鏡觀察所制備的纖維支架，如附圖5所示，本發(fā)明實(shí)施例制備的同軸靜電紡絲纖維支架5的纖維形態(tài)均一，順滑，無結(jié)珠形成。且本發(fā)明實(shí)施例制備的纖維支架的直徑主要分布于600-700納米左右，屬于納米級(jí)結(jié)構(gòu)，參照?qǐng)D6?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架5結(jié)構(gòu)參數(shù)均較佳，能夠模仿天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，適合組織工程中細(xì)胞的生長，達(dá)到了生物組織工程的應(yīng)用要求。
[0099]分別對(duì)該纖維支架中的Ε7多肽和牛血清蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過共聚焦顯微鏡觀察本發(fā)明實(shí)施例制備的纖維支架中Ε7多肽和牛血清蛋白均勻且連續(xù)分布?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例制備的纖維支架成功偶聯(lián)了 Ε7多肽，具備了特異性募集BMSC的能力。
[0100]實(shí)施例6
[0101]本發(fā)明實(shí)施例對(duì)同軸靜電紡絲纖維支架5募集BMSC的能力進(jìn)行了檢測(cè)，具體過程如下:
[0102]I)根據(jù)上述實(shí)施例5中的操作條件，在同樣的條件下，分別制備得到含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8、不含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7。可以理解的是，含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9還包括牛血清蛋白，以下不再一一重復(fù)。
[0103]2)分別將大鼠的BMSC種植到上述含Ε7多肽和rhTGF- β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含E7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8、不含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7上，均用分析培養(yǎng)基培養(yǎng)1、3、5、7小時(shí)，檢測(cè)BMSC在上述各纖維支架上的粘附數(shù)目，如附圖7a所示，相比不含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7，含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8上黏附更多數(shù)量的BMSC，其中，含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9上黏附的BMSC更多?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例通過將Ε7多肽和rhTGF-β I負(fù)載到同軸靜電紡絲纖維支架5上，明顯提高了纖維支架募集BMSC的能力。
[0104]將上述各支架分別培養(yǎng)24小時(shí)后，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)BMSC的細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，利用顯微鏡觀察BMSC在上述各支架上的伸展?fàn)顟B(tài)，如附圖7b所示，相比不含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7，含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8上募集的BMSC的伸展?fàn)顟B(tài)明顯較好(其中，圖中灰白色區(qū)域即代表分布的BMSC)。其中，含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9上募集的BMSC的伸展?fàn)顟B(tài)最優(yōu)。可見，本發(fā)明實(shí)施例通過將Ε7多肽和rhTGF-β I負(fù)載到同軸靜電紡絲纖維支架5上，不僅明顯提高了纖維支架募集BMSC的能力，且為BMSC的生長提供了更適宜的平臺(tái)。
[0105]將上述各支架分別培養(yǎng)7及14天后，檢測(cè)上述各支架中BMSC的DNA含量，并在電鏡下觀察BMSC在上述各支架上的生長狀態(tài)。如附圖7c及附圖7d(其中電鏡圖中較致密的區(qū)域即為分布的BMSC)所示，相比不含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7，含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8上募集的BMSC的生長狀態(tài)更優(yōu)，其中，含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9上募集的BMSC的生長狀態(tài)最優(yōu)?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例通過將Ε7多肽和rhTGF-β I負(fù)載到同軸靜電紡絲纖維支架5上，不僅能募集到更多的BMSC，且明顯改善了所募集到的BMSC的生長狀態(tài)。
[0106]其中，本發(fā)明實(shí)施例中所用的分析培養(yǎng)基的組成成分為:DMEM (dulbecco’smodified eagle medium)培養(yǎng)液、IOOnm地塞米松、50 μ g/mL的抗壞血酸維生素C、100 μ g/mL的丙酮酸鈉，40 μ g/mL的脯氨酸、100U/mL的青霉素和鏈霉素、ITS+Premix生長因子(其包括6.25 μ g/mL的胰島素、6.25 μ g/mL的運(yùn)鐵蛋白、6.25 μ g/mL的亞硒酸、5.35 μ g/mL的亞油酸和1.25 μ g/mL的牛血清蛋白)。
[0107]實(shí)施例7
[0108]本發(fā)明實(shí)施例對(duì)上述制備的含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9對(duì)rhTGF-β I因子53的緩釋能力進(jìn)行了測(cè)試，具體過程如下:
[0109]取30毫克上述制備的含Ε7多肽和rhTGF-βΙ的同軸靜電紡絲纖維支架9，并用
1.5毫升的磷酸鹽緩沖液浸泡，得到浸泡液，置于37°C中。每天定時(shí)取浸泡液500微升，作為樣本，然后用新鮮的磷酸鹽緩沖液將浸泡液添至1.5毫升。重復(fù)上述操作至第21天，用rhTGF-β I的ELISA試劑盒檢測(cè)所取標(biāo)本中rhTGF-β I的含量。根據(jù)累積釋放量計(jì)算公式來計(jì)算rhTGF-β I的累積釋放量，以反映上述含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9中的rhTGF-β I的 緩釋能力。其中累積釋放量計(jì)算公式為:
[0110]累積釋放量(％)=100XMt/Mn
[0111]Mt表示在時(shí)間點(diǎn)t支架所釋放出rhTGF-β I的質(zhì)量，Mn表示支架中所承載的rhTGF- β I的質(zhì)量(本發(fā)明實(shí)施例中Mn取6 )。
[0112]如附圖8a及附圖8b所示，rhTGF-β I因子53在本發(fā)明含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9中得到成功釋放，rhTGF-β I因子53釋放后，該含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9變成中空狀同軸電紡絲纖維支架6。可見，本發(fā)明實(shí)施例提供的含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9作為rhTGF-β I因子53的載體能夠?qū)ζ溥M(jìn)行有效釋放。如附圖8c所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9對(duì)rhTGF-β I因子53的釋放過程可分為兩個(gè)階段，第1_7天是rhTGF- β I因子53的逐漸釋放期，第8_21天是rhTGF- β I因子53的緩慢釋放期，緩釋過程穩(wěn)定?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例提供的含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9成功對(duì)rhTGF-β I因子53進(jìn)行了緩釋，且緩釋效果穩(wěn)定，緩釋時(shí)間長。
[0113]實(shí)施例8
[0114]本發(fā)明實(shí)施例分別對(duì)上述同樣操作條件下制備的含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8 (第一對(duì)照組)、不含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7 (第二對(duì)照組)的促BMSC成軟骨方向分化的能力進(jìn)行了測(cè)試，具體測(cè)試過程如下:
[0115] 分別將大鼠的BMSC種植到含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8和不含Ε7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7上，用分析培養(yǎng)基(與實(shí)施例6所用的分析培養(yǎng)基為同種)培養(yǎng)14天后，取材，進(jìn)行如下檢測(cè):
[0116]I)軟骨特異基因:二型膠原(collagen2,C0L2)、蛋白多糖(Proteoglycan)基因的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)檢測(cè):
[0117]所用的引物序列如下:
[0118]二型膠原的正向引物:5' -ACGGCGGCTTCCACTTCAGC-3'；
[0119]二型膠原的反向引物:5' -TTGCCGGCTGCTTCGTCCAG-3'；
[0120]蛋白多糖的正向引物:5'-CATTCGCACGGGAGCAGCCA-3'；
[0121]蛋白多糖的反向引物:5'-TGGGGTCCGTGGGCTCACAA-3'；
[0122]β -肌動(dòng)蛋白的正向引物:5' -CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'；
[0123]β -肌動(dòng)蛋白的反向引物:5' -AACACAGCCTGGATGGCTAC-3'。
[0124]實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)操作條件如下:
[0125]7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng):95°C變性10分鐘；
[0126]40個(gè)循環(huán):95°C下15秒，60°C下延伸I分鐘
[0127]溶解曲線:95°C下15秒，60°C下30秒后逐步升溫至95°C解鏈。
[0128]使用2_“CT計(jì)算方法，來統(tǒng)計(jì)最終結(jié)果，其中所用公式如下:
[0129]Δ CT實(shí)驗(yàn)組=CT實(shí)驗(yàn)組基因-CT實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參；
[0130]Δ CT對(duì)照組=CT對(duì)照組基因-CT對(duì)照組內(nèi)參；
[0131]Λ Λ CT= Λ CT 實(shí)驗(yàn)組-Λ CT 對(duì)照組；
[0132]2_δ Δα=2_ (Δστ實(shí)驗(yàn)組_八口對(duì)照組)
[0133]如附圖9a和9b所示(其中，圖中的表達(dá)量均表示表達(dá)倍數(shù))，相比含E7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8和不含E7多肽和rhTGF-β I的同軸靜電紡絲纖維支架7，本發(fā)明實(shí)施例提供的含E7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架9的二型膠原和蛋白多糖的基因表達(dá)量更高，可見，本發(fā)明通過將rhTGF-β l負(fù)載到纖維支架中能夠顯著促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化，對(duì)于受損軟骨的再生修復(fù)具有重要的意義。
[0134]2)用二甲基亞甲基藍(lán)(1，9-dlmethylmethylene blue,DMMB)法測(cè)定對(duì)蛋白多糖進(jìn)行定量檢測(cè)，具體過程如下:
[0135]a)將種植有BMSCs含E7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架9、含E7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8和不含E7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架7培養(yǎng)14天后，分別加入1毫升木瓜蛋白酶，在60°C下孵育24小時(shí)。
[0136]b)分別向96孔板中的每孔內(nèi)加入200 μ l的DMMB，然后取20ul的上述各支架以及18ul磷酸鹽緩沖液加入上述96孔板中與DMMB混勻。
[0137]c)利用酶標(biāo)儀(525納米波長)測(cè)定吸光度值，計(jì)算上述各支架中蛋白多糖的含量。
[0138]如附圖9c所示(其中，蛋白多糖含量的單位為微克/支架)，相比含E7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8和不含E7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架7，本發(fā)明實(shí)施例提供的含Ε7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架9中蛋白多糖的量更高，可見，本發(fā)明通過將rhTGF-β l負(fù)載到纖維支架中能夠顯著促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化，對(duì)于受損軟骨的再生修復(fù)具有重要的意義。
[0139]3) 二型膠原的免疫熒光檢測(cè):
[0140]a)標(biāo)本固定:將分別種植有BMSC的含E7多肽和rhTGF- β l的同軸靜電紡絲纖維支架9、含Ε7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8和不含Ε7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架7培養(yǎng)14天后，用濃度為4%的多聚甲醛室溫固定10分鐘。
[0141]b)細(xì)胞通透化:用通透液(磷酸鹽吐溫緩沖液:含濃度為0.3-0.5%的TrltonX-100, pH為7.4)覆蓋上述各支架，室溫，漂洗5分鐘及3次。
[0142]c)封閉支架:利用濃度為2%的牛血清蛋白覆蓋上述各支架，37°C下濕盒內(nèi)封閉45分鐘。
[0143]d) —抗孵育:向上述各支架加入未標(biāo)記的抗二型膠原抗體(1:200稀釋)，4°C過夜。
[0144]e)漂洗:磷酸鹽緩沖液漂洗上述各支架5分鐘及3次。
[0145]f ) 二抗孵育:向上述各支架加入羅丹明標(biāo)記的二抗抗體，37°C濕盒避光40分鐘。
[0146]g)利用Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核(Nuclel),漂洗,封片,共聚焦顯微鏡下觀察。
[0147]如附圖9d所示，體外培養(yǎng)BMSC —段時(shí)間后，相比含E7多肽的同軸靜電紡絲纖維支架8和不含E7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架7，本發(fā)明實(shí)施例提供的含Ε7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架9中BMSC增殖更明顯，二型膠原(C0L2)的合成量更高。可見，本發(fā)明通過將rhTGF-β l負(fù)載到纖維支架中能夠顯著促進(jìn)BMSC成軟骨方向分化，對(duì)于受損軟骨的再生修復(fù)具有重要的意義。
[0148]綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例制備的含Ε7多肽和rhTGF-β l的同軸靜電紡絲纖維支架9在軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)為如下:1)作為支架具有納米級(jí)結(jié)構(gòu)，能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞生長；2)能夠募集種子細(xì)胞:BMSC，且能明顯改善并利于BMSCs在支架上的粘附和生長；3)能夠分泌生物活性因子:rhTGF-13 1，顯著地促進(jìn)了 BMSC成軟骨方向分化?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例提供的同軸靜電紡絲纖維支架5通過負(fù)載E7多肽和rhTGF-β 1，能夠有效地對(duì)受損軟骨進(jìn)行修復(fù)，在軟骨修復(fù)領(lǐng)域具有較強(qiáng)的實(shí)用性和適應(yīng)性。
[0149] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種同軸靜電紡絲纖維支架，其特征在于，所述同軸靜電紡絲纖維支架包括脂肪族聚酯殼層和聚乙烯吡咯烷酮芯層，所述脂肪族聚酯殼層表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽，所述聚乙烯吡咯烷酮芯層中負(fù)載有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同軸靜電紡絲纖維支架，其特征在于，所述同軸靜電紡絲纖維支架還包括牛血清蛋白，所述牛血清蛋白負(fù)載在所述聚乙烯吡咯烷酮芯層中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同軸靜電紡絲纖維支架，其特征在于，所述脂肪族聚酯殼層中脂肪族聚酯選自聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚(乳酸-己醇)共聚物中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同軸靜電紡絲纖維支架，其特征在于，脂肪族聚酯殼層中脂肪族聚酯、聚乙烯吡咯烷酮芯層中聚乙烯吡咯烷酮和所述牛血清蛋白質(zhì)量比為1-1.5:0.35-0.55:0.01-0.015。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同軸靜電紡絲纖維支架，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。
6.—種權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法,其特征在于，所述方法包括: 制備脂肪族聚酯殼層溶液:將脂肪族聚酯溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到所述脂肪族聚酯殼層溶液； 制備含有重組人轉(zhuǎn)化 長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液:將聚乙烯吡咯烷酮溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至完全溶解，得到所述聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液，向所述聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液中加入重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β 1，攪拌至混合均勻，得到所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液； 在無風(fēng)環(huán)境下，分別將所述脂肪族聚酯殼層溶液和所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液注入殼層溶液注射器和芯層溶液注射器中，進(jìn)行同軸靜電紡絲，制備得到含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架； 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β I的同軸靜電紡絲纖維支架的表面，得到所述同軸靜電紡絲纖維支架； 制備脂肪族聚酯殼層溶液所用的有機(jī)溶劑與制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液所用的有機(jī)溶劑為同一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，其特征在于，所述方法還包括:在制備含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的過程中，向所述含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子_β I的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液中加入牛血清蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯殼層溶液的濃度為0.14g/ml-0.16g/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的濃度為0.065g/ml_0.075g/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑選自三氟乙醇、甲酸、六氟異丙醇、三氯甲烷、乙醇中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的同軸靜電紡絲纖維支架的制備方法，其特征在于，所述同軸靜電紡絲的操作參數(shù)為:紡絲電壓為10.5-10.SKv ;噴絲頭到收集板的距離為18-20cm ;脂肪族聚酯殼層溶液的推進(jìn)速度為0.20-0.22毫升/小時(shí)；含有重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β 1的聚乙烯吡咯烷酮芯層溶液的推進(jìn)速度為0.13-0.15毫升/小時(shí)；殼層溶液注射器的針頭內(nèi)徑為0.89-0.91毫米；芯層溶液注射器的針頭內(nèi)徑為0.40-0.42毫米。
【文檔編號(hào)】A61L27/34GK103893819SQ201410105964
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】敖英芳, 滿振濤, 邵振興, 陳海峰, 黃洪杰 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院