一種在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法。選用人血管內(nèi)皮細(xì)胞作為原料制備細(xì)胞膜微囊；將得到的細(xì)胞膜微囊浸泡在洋地黃皂苷與藥物的混合溶液中，用洋地黃皂苷可提高細(xì)胞膜通透性，藥物滲透進(jìn)入細(xì)胞膜微囊；使用鈣離子封閉細(xì)胞膜，得到載藥的細(xì)胞膜微囊。本發(fā)明制備方法簡便可控，速度快，生產(chǎn)效率高，可以方便地在細(xì)胞膜微囊中裝載多種藥物并調(diào)節(jié)其載藥量，有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法。尤其是利用洋地黃皂苷提高細(xì)胞膜通透性，并在裝載藥物后使用鈣離子封閉細(xì)胞膜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物在載體中的高效裝載和可控釋放是實(shí)現(xiàn)藥物有效利用、降低毒性的重要前提。藥物在載體中的裝載可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的保護(hù)，提高其穩(wěn)定性；同時(shí)可調(diào)控藥物的釋放速度和釋放位置，降低其對(duì)健康細(xì)胞和組織的毒性。
[0003]通常的藥物載體主要是使用人工合成的聚合物或天然來源的蛋白質(zhì)和多糖作為原料，其結(jié)構(gòu)比較簡單。但是往往生物相容性差，較易被人體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，具有體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短且不易到達(dá)病變部位的缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)限制了其推廣與應(yīng)用。
[0004]仿細(xì)胞微囊是由細(xì)胞膜將囊內(nèi)空間與囊外空間隔離開來形成的球狀物質(zhì)。利用細(xì)胞松弛素b處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，破壞維持細(xì)胞形態(tài)的肌動(dòng)蛋白的組裝，然后在機(jī)械剪切的作用下制備仿細(xì)胞微囊。[0005]仿細(xì)胞微囊作為癌細(xì)胞靶向性的藥物載體有諸多優(yōu)點(diǎn):一方面是由于微囊表面實(shí)質(zhì)是一層類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，因此具有極佳的生物相容性，并且有望降低自體免疫系統(tǒng)的清除作用，具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，細(xì)胞膜微囊也存在著囊壁通透性差、只能負(fù)載特定分子的缺點(diǎn)。洋地黃皂苷是一種表面活性劑，可以提高細(xì)胞膜的通透性，使得一些分子量較大的藥物分子也可以進(jìn)入細(xì)胞膜微囊內(nèi)部；同時(shí)洋地黃皂苷可以與高濃度的鈣離子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的再次封閉。這一方法可大大提高細(xì)胞膜微囊的藥物裝載量同時(shí)也拓展了可負(fù)載藥物分子的種類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法。
[0007]本發(fā)明的在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法，包括以下步驟:
1)在培養(yǎng)有人血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)盤中加入20μL濃度為lmg/mL的細(xì)胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸鹽緩沖液洗數(shù)次，胰酶消化收集細(xì)胞和細(xì)胞膜微囊，離心分離得到細(xì)胞膜微囊懸液；
2)取200μg步驟I)所得的細(xì)胞膜微囊加入到ImL洋地黃皂苷與藥物的混合溶液中，洋地黃皂苷與藥物的濃度分別為lOPg/mL和200mg/mL，37°C孵育I~24h ;
3)在步驟2)的溶液中加入IOPL0.5mol/mL氯化鈣溶液，37°C下孵育2h ;離心收集微囊，洗滌，得到裝載藥物的細(xì)胞膜微囊。
[0008]本發(fā)明中，所說的藥物可以是鹽酸阿霉素、釓噴酸葡胺或葡聚糖。
[0009]本發(fā)明的原理:使用洋地黃皂苷提高細(xì)胞膜通透性，利用濃度差將藥物裝入細(xì)胞膜微囊，隨后使用氯化鈣溶液封閉細(xì)胞膜。
[0010]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明工藝過程簡單，制備速度快，可控性好，材料來源于天然細(xì)胞，具有優(yōu)越的生物相容性和傳遞性能；洋地黃皂苷的引入，可暫時(shí)增加細(xì)胞膜微囊的通透性，實(shí)現(xiàn)多種藥物分子的包埋，并調(diào)控其包埋量，有望作為多功能藥物載體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是標(biāo)記有細(xì)胞膜紅色熒光探針DiI的細(xì)胞膜微囊的熒光照片。
[0012]圖2是實(shí)施例1所得的細(xì)胞膜微囊中的鹽酸阿霉素濃度和孵育時(shí)間的關(guān)系。
[0013]圖3是實(shí)施例2所得的細(xì)胞膜微囊中的釓噴酸葡胺濃度和孵育時(shí)間的關(guān)系。
[0014]圖4是實(shí)施例3所得的細(xì)胞膜微囊中的葡聚糖濃度和孵育時(shí)間的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來限制本發(fā)明。
[0016]實(shí)施例1
I)在培養(yǎng)有人血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)盤中加入20 μL細(xì)胞松弛素b溶液(濃度為Img/mL)，37°C下孵育30min后用磷酸鹽緩沖液洗三次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞；渦旋處理所得細(xì)胞Imin ;離心收集所得上清液即為細(xì)胞膜微囊懸液。
[0017]將20(^g上述所得的細(xì)胞膜微囊分散在ImL磷酸鹽緩沖液中；向其中加入lOPLlmg/mL的細(xì)胞膜紅色染料Dil，使其混合均勻，孵育15min ;將所得細(xì)胞膜微囊離心洗滌數(shù)次以去除未標(biāo)記上的染料；分散在磷酸鹽緩沖液中的細(xì)胞膜微囊的熒光照片見圖1。
[0018]2)取200 μg步驟I)所得的細(xì)胞膜微囊加入到洋地黃皂苷與鹽酸阿霉素的混合溶液中，使洋地黃皂苷與鹽酸阿霉素的濃度分別為lOPg/mL和200mg/mL，37°C孵育l~24h ;加入氯化鈣溶液，使鈣離子濃度為5mM，37°C下孵育2h ;離心磷酸鹽緩沖液洗數(shù)次，得到裝載鹽酸阿霉素的細(xì)胞膜微囊。根據(jù)紫外光譜圖中543nm處的吸光度得到不同孵育時(shí)間下該微囊中的藥物濃度為2.8、6.5、9.3、20.1,28.9Pg/mL，見圖2。
[0019]實(shí)施例2
同實(shí)施例1，區(qū)別在于步驟2)，取200 μδ步驟I)所得的細(xì)胞膜微囊加入到洋地黃皂苷和釓噴酸葡胺的混合溶液中，使洋地黃皂苷和釓噴酸葡胺的濃度分別為lOPg/mL和200μ8/mL，在37°C孵育3~24h ;加入氯化鈣溶液，使鈣離子濃度為5mM，37°C下孵育2h ;離心磷酸鹽緩沖液洗三次，得到裝載釓噴酸葡胺的細(xì)胞膜微囊。根據(jù)電感耦合等離子體質(zhì)譜得到該微囊中藥物濃度為0.8、2、16.2Pg/mL，見圖3。
[0020]實(shí)施例3
同實(shí)施例1，區(qū)別在于步驟2)，取200 μδ步驟I)所得的細(xì)胞膜微囊加入到洋地黃皂苷和熒光素標(biāo)記的葡聚糖(分子量4kD)的混合溶液中，使洋地黃皂苷和葡聚糖的濃度分別為lOPg/mL和200mg/mL，在37°C孵育3~24h ;加入氯化鈣溶液，使鈣離子濃度為5mM，37°C下孵育2h ;離心磷酸鹽緩沖液洗三次，得到裝載葡聚糖的細(xì)胞膜微囊。根據(jù)熒光光譜圖中488nm激發(fā)、525nm發(fā)射的峰強(qiáng)度得到該微囊中熒光素修飾的葡聚糖的濃度分別為0.8、0.9、1.lPg/mL，見圖 4。
【權(quán)利要求】
1.一種在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法，包括以下步驟: 1)在培養(yǎng)有人血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)盤中加入20μL濃度為lmg/mL的細(xì)胞松弛素b溶液，37°C下孵育30min ;磷酸鹽緩沖液洗數(shù)次，胰酶消化收集細(xì)胞和細(xì)胞膜微囊，離心分離得到細(xì)胞膜微囊懸液； 2)取200μg步驟I)所得的細(xì)胞膜微囊加入到1mL洋地黃皂苷與藥物的混合溶液中，洋地黃皂苷與藥物的濃度分別為lOPg/mL和200mg/mL，37°C孵育I~24h ; 3)在步驟2)的溶液中加入1OPL0.5mol/mL氯化鈣溶液，37°C下孵育2h ;離心收集微囊，洗滌，得到裝載藥物的細(xì)胞膜微囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞膜微囊中高效裝載藥物的方法，其特征在于所述的藥物是鹽酸阿霉素、釓噴酸葡胺或葡聚糖。
【文檔編號(hào)】A61K47/46GK103920161SQ201410117807
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】毛崢偉, 張?jiān)? 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)