具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子的制備方法。通過將氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液和硼氫化鈉制備出發(fā)熒光的金簇納米粒子，利用11-巰基十一烷酸和疊氮十一烷基硫醇功能化金簇表面；葉酸與炔丙胺通過N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺連接劑連接，形成炔基化葉酸；利用點擊化學方法，炔基與疊氮基發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，制備出葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子。葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子能夠選擇性識別葉酸過表達的K562細胞，對其進行熒光檢測，在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為470nm和650nm下進行測定。
【專利說明】具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于材料制備，特別涉及具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金納米團簇(AuNCs)是由幾個至幾十個Au原子組成的具熒光的分子級聚集體。其粒徑一般小于2 nm，介于原子與納米顆粒之間。金納米團簇特有的量子尺寸效應(yīng)使其光學性質(zhì)具有隨粒徑大小而變化的特性，這種特性使其熒光發(fā)射光譜從可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)可調(diào)諧。由于貴金屬具有化學惰性且生物相容性好，使得熒光金納米團簇具有一系列引人注目的特性，包括超小的尺寸、毒副作用小和良好的生物相容性、斯托克斯位移(Stockes shift)較大以及出色的光穩(wěn)定性,從而成為生物傳感與成像的理想突光探針。對于金納米團簇，自身具有熒光，對金納米團簇的表面進行功能化，能夠具有檢測的靶向性。
[0003]隨著對腫瘤分子水平研究的不斷深入，在腫瘤細胞表面發(fā)現(xiàn)一系列受體，這些受體在腫瘤組織中過度表達，但是在正常細胞中高度保守，特異性配體或抗體可以和這些受體進行結(jié)合，并被細胞內(nèi)化進入到細胞內(nèi)部。這些腫瘤特異性的受體為腫瘤檢測及治療提供了靶點。自從發(fā)現(xiàn)葉酸受體在絕大多數(shù)惡性腫瘤細胞中高度表達，而在正常細胞高度保守以來，葉酸/葉酸受體介導(dǎo)靶向傳遞成為該領(lǐng)域研究的熱點。基于金簇納米粒子具有熒光性能，且對其表面進行進行葉酸功能化，制備出具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法，所述的具有葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇是由葉酸和發(fā)熒光的金簇通過點擊化學偶聯(lián)所制備。
[0005]所述的葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法通過以下步驟制備得到:
1)將氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液和硼氫化鈉溶液混合攪拌，得到發(fā)熒光的金簇納米粒子；
2)將11-巰基十一烷酸和疊氮十一烷基硫醇加入到上述溶液中，放置、純化；
3)向2)中加入炔基化葉酸，炔基化葉酸溶于1:1的水和二甲基亞砜混合溶液中；
4)向3)中加入CuSO4和抗壞血酸催化下通過點擊化學連接疊氮十一烷基硫醇和炔基化葉酸，實現(xiàn)葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備；
5)葉酸受 體靶向和熒光雙功能金簇與葉酸過表達的K562細胞進行孵育；
6)對葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與葉酸過表達的K562細胞進行孵育前后熒光強度的測定。
[0006]所述的葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法具體通過以下步驟制備得到:
在步驟I)中，所述氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液和硼氫化鈉溶液的體積比為10:10:1 ;所述氯金酸溶液濃度為0.25臟01/1，所述檸檬酸三鈉溶液濃度為0.25 mmol/L，所述的硼氫化鈉溶液濃度為0.01 mol/L，所述的攪拌時間為30 S。
[0007]在步驟2)中，所述的ll-巰基^^一烷酸的濃度為100 mmol/L，所述的疊氮十一烷基硫醇10 mmol/L，所述的溶液在25°C下放置48小時，所述純化采用分子量10 kDa的半透膜進行透析60 min。
[0008]在步驟3)中，所述炔基化葉酸的制備過程是1.0 g葉酸溶入10 mL 二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26 g N-羥基琥珀酰亞胺和0.44 g 1_(3_ 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中繼續(xù)攪拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室溫下攪拌24 h，接著加入100 mL蒸餾水，攪拌40 min，產(chǎn)生沉淀，停止反應(yīng)，過濾，得到桔黃色沉淀，用丙酮洗滌，真空干燥，得炔基化葉酸。[0009]在步驟4)中，所述的CuSO4和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mol/L和0.05 mol/L。
[0010]在步驟5)中，所述葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與K 562細胞孵育時間30min。
[0011]在步驟6)中，所述對葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與葉酸過表達的K 562細胞進行孵育前后溶液在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為470 nm和650 nm下進行測定。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明所述一種葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子能夠特異性識別表面有高水平葉酸受體表達的細胞，可作為檢測腫瘤細胞的分子探針，在腫瘤細胞檢測中具有重要的應(yīng)用價值。
[0013](I)葉酸可以與癌細胞表面的葉酸受體特異性的結(jié)合，從而內(nèi)化進入細胞內(nèi)部，對癌癥的診斷起到重要的作用。
[0014](2)金簇納米粒子具有非常高的穩(wěn)定性，在生理環(huán)境下能夠穩(wěn)定存在；葉酸通過“點擊化學”反應(yīng)可以與金簇形成共價鍵，連接牢固；葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子具有很好的生物相容性，
(3)由于所用的葉酸分子小，更有利于細胞對其的攝取；具有良好的葉酸受體靶向性，并且金簇具有發(fā)射熒光功能，所以葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子可作為檢測腫瘤細胞的探針，用于熒光成像，實現(xiàn)對腫瘤細胞的定位檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子的制備示意圖。
[0016]圖2為葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子紫外可見吸收光譜圖和熒光光譜圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備及檢測細胞的應(yīng)用 I葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備
I)將20 mL 0.25 mmol/L氯金酸溶液、20mL 0.01 mol/L檸檬酸三鈉溶液和2mL 0.01mol/L硼氫化鈉溶液混合,攪拌30 S。[0018]2)向 I)中加入 100 μ L 100 mmol/L 11-巰基十一烷酸，100 μ L 10 mmol/L 疊氮十一烷基硫醇，溶液在25°C下放置48小時，采用分子量10 kDa的半透膜進行透析60min。
[0019]3)秤取1.0 g葉酸溶入10 mL 二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26g N-羥基琥珀酰亞胺和0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中繼續(xù)攪拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室溫下攪拌24 h，接著加入100 mL蒸餾水，攪拌40 min，產(chǎn)生沉淀。停止反應(yīng)，過濾，得到桔黃色沉淀，用丙酮洗滌，真空干燥，得炔基化葉酸。
[0020] 4)配制3)制備的炔基化葉酸溶液濃度為0.02g/mL,向2)中加入lmL。
[0021]5)向溶液中加入ImL 0.01 M CuSO4溶液和ImL 0.05 M抗壞血酸溶液。
[0022]2 K562細胞的培養(yǎng)
RPM1-1640培養(yǎng)液:稱取RPM1-1640粉10.4 g，溶于三蒸水1000 mL，加入2 gNaHCO3，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用0.22 μπι的微孔濾膜正壓過濾除菌，用之前加入10 %胎牛血清(FBS)，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μ g/mL, I mmol/L L-谷氨酰胺，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0023]從液氮中取出凍存管后立即置于38 1:恒溫水浴中解凍，取出凍存管，用75 %酒精清潔管口，將凍存細胞轉(zhuǎn)移到大玻璃培養(yǎng)瓶，加入20 mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，復(fù)蘇次日更換培養(yǎng)液。K562細胞在含有10 %滅活胎牛血清(FBS)、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μ g/mL的RPM1-1640培養(yǎng)液中，于37 °C、5 % CO2、水飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0024]3 K562細胞的測定
O葉酸受體靶向與熒光雙功能金簇與K 562細胞，A 549細胞、MCF-7細胞和H9c2細胞共培養(yǎng)2h，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞的變化發(fā)現(xiàn)。K 562細胞和A 549細胞表面具有許多紅色熒光物(即為葉酸受體靶向和熒光雙功能的金簇納米粒子)吸附，部分K 562細胞和A 549細胞內(nèi)也可見綠色熒光物，而作為對照的MCF-7細胞和H9c2細胞表面和細胞內(nèi)基本上沒有出現(xiàn)紅色熒光物。由此可以看出，是由于K 562細胞和A 549細胞中的葉酸受體高表達，而MCF-7細胞和H9c2細胞中的葉酸受體低表達。葉酸受體靶向和熒光雙功能的金簇納米粒子能夠與K 562細胞和A 549細胞高表達的葉酸受體特異性結(jié)合，并且K 562細胞和A 549細胞表面被熒光物覆蓋，表明了葉酸受體靶向和熒光雙功能的金簇納米粒子與葉酸受體高表達的腫瘤細胞存在很好的結(jié)合，故可以作為該類腫瘤細胞早期診斷的工具。同時上述結(jié)果還表明，被修飾在金簇納米粒子表面的葉酸的活性并沒有受到影響，主要由于葉酸與金簇納米粒子通過點擊化學反應(yīng)形成共價鍵，在與葉酸過表達的腫瘤細胞孵育時，可以特異性地和葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇納米粒子相結(jié)合，使得靶細胞被金簇納米粒子所識別。結(jié)果表明制備的葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇納米粒子對葉酸高表達的細胞具有優(yōu)越的靶向性。
[0025]2)取0.5 mL 10 nmol/L的葉酸受體靶向和熒光雙功能的金簇溶液置于1.0 mL的離心管中，向其中加入0.2 mL不同濃度的K 562細胞溶液，輕微震蕩混勻后，在4°C的條件下孵育30 min。
[0026]3)孵育完成后，在轉(zhuǎn)速為1000 rpm離心5min，收集上清液，用熒光光度計記錄在最大激發(fā)波長為470 nm，最大發(fā)射波長650 nm出的熒光光度值?？瞻捉M為含有葉酸受體靶向和熒光雙功能的金簇的RPM1-1640培養(yǎng)基，未加細胞。計算葉酸受體靶向和熒光雙功能的金簇溶液離心后與離心前在最大發(fā)射波長650 nm處的熒光強度的變化值(Al)。隨著K562細胞濃度的增加，Al的值也隨之變大，表明結(jié)合在細胞表面的葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇就越多，因此離心后，上清液中的葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇就越少。而葉酸受體低表達的成纖維細胞中，隨著濃度的增加，△ I的值并沒有發(fā)生多大的變化，這是因為葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇并不能有效地、穩(wěn)定地吸附在細胞表面，不能隨著細胞的濃度增加而減少上清液中葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇的量。隨著K562細胞檢測濃度的降低，K562細胞濃度為100-10000 cells/mL時，葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇與K562細胞呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΛΙ=54.01+0.083c，R=0.9976。因此，基于葉酸受體靶向的熒光雙功能金簇檢測腫瘤細胞的檢測限為50個/mL，這種方法能夠簡便的用于檢測葉酸受體過表達 的細胞。
【權(quán)利要求】
1.葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備方法及應(yīng)用，其特征是包括以下步驟: 1)將氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液和硼氫化鈉溶液混合攪拌，得到發(fā)熒光的金簇納米粒子； 2)將11-巰基十一烷酸和疊氮十一烷基硫醇加入到上述溶液中，放置、純化； 3)向2)中加入炔基化葉酸，炔基化葉酸溶于1:1的水和二甲基亞砜混合溶液中； 4)向3)中加入CuSO4和抗壞血酸催化下通過點擊化學連接疊氮十一烷基硫醇和炔基化葉酸，實現(xiàn)葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇的制備； 5)葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與葉酸過表達的K562細胞進行孵育； 6)對葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與葉酸過表達的K562細胞進行孵育前后熒光強度的測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述在步驟I)中，所述氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液和硼氫化鈉溶液的體積比為10:10:1 ;所述氯金酸溶液濃度為0.25 mmol/L，所述檸檬酸三鈉溶液濃度為0.25臟01/1，所述的硼氫化鈉溶液濃度為0.01 mol/L，所述的攪拌時間為30 S。
3.根據(jù)權(quán) 利要求1所述在步驟2)中，所述的11-巰基十一烷酸的濃度為100mmol/L,所述的疊氮i 烷基硫醇10 mmol/L,所述的溶液在25°C下放置48小時,所述純化采用分子量10 kDa的半透膜進行透析60 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述在步驟3)中，所述炔基化葉酸的制備過程是1.0 g葉酸溶入10 mL 二甲基甲酰胺(DMF)，待完全溶解后再加入0.26 g N-羥基琥珀酰亞胺和0.44 g1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，得到的混合物在冰浴中繼續(xù)攪拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入0.124 g炔丙胺的DMF溶液(5 mL)，得到的混合物在室溫下攪拌24 h,接著加入100 mL蒸懼水,攪拌40 min,產(chǎn)生沉淀,停止反應(yīng),過濾,得到桔黃色沉淀，用丙酮洗滌，真空干燥，得炔基化葉酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述在步驟4)中，所述的CuSO4和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mol/L和 0.05 mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述在步驟5)中，所述葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與K562細胞孵育時間30 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述在步驟6)中，所述對葉酸受體靶向和熒光雙功能金簇與葉酸過表達的K 562細胞進行孵育前后溶液在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為470 nm和650 nm下進行測定。
【文檔編號】A61K49/00GK103920155SQ201410125041
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】葛慎光, 于京華, 顏梅, 葛磊, 張彥, 黃加棟, 孫國強 申請人:濟南大學