樹突狀細胞疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞免疫領域，具體地說是一種樹突狀細胞疫苗的制備方法，包括從臍血中分離得到臍血單核細胞；從中篩選出DC細胞，培養(yǎng)并擴增，然后進行單表位多聚抗原肽（SEA-MVP）負載，并孵育過夜得到DC疫苗。本發(fā)明的有益效果在于選用單表位多聚抗原肽（SEA-MAP）負載DC細胞，單表位多聚抗原肽為體外合成，成份明確單一，純度高；堿性氨基酸作骨架將單表位連接成，使連接的表位肽的朝向具有一致性易被DC細胞識別呈遞，敏感性特異性強，負載有效率高，無免疫耐受；對激活CD4+細胞和CD8+細胞抗腫瘤細胞的能力較現(xiàn)有方法至少提高萬倍以上。
【專利說明】樹突狀細胞疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞免疫領域，具體地說是一種樹突狀細胞疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002]樹突狀細胞(Dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞(AntigenpresentingcelI, APC),能夠刺激初始的T細胞增殖,啟動免疫應答；還能夠呈遞抗原給MHC-1類限制性CD8+和MHC-1I類限制性CD4+T淋巴細胞，誘導特異性免疫反應，被稱為“天然免疫佐劑”，因此在誘導免疫應答中具有獨特的地位。近年來，以DC為基礎的免疫治療在臨床應用中得到越來越廣泛的關注，是國內(nèi)外研究的熱點。
[0003]現(xiàn)有的DC 疫苗制備方法中大多采用腫瘤組織塊或癌相關蛋白作為靶向物質(zhì)，負載有效率低，靶向性較低，特異性較差。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種高負載有效率，高靶向性的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0005]( 1)從臍血中分離得到臍血單核細胞；
[0006](2)用含1%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)臍血單核細胞，去除未貼壁細胞，向貼壁細胞中加入含有GM-CSF (粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子)、IL-4 (白細胞介素_4)、雙抗(青霉素加鏈霉素)和10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；三天后補加半量的GM-CSF、IL-4、雙抗和10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0007](3)第 6 天，將細胞混勻，換用含有 1%FBS、GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1 β 和 TNF-α(腫瘤壞死因子_α )的培養(yǎng)基，同時進行單表位多聚抗原肽(SEA-MVP)負載，并孵育過夜；
[0008](4)第7天，進行常規(guī)檢測后制備DC疫苗注射液。
[0009]優(yōu)選的，步驟(2)中，加入的GM-CSF濃度為500_1500n/ml，IL-4濃度為200-1000UI/ml, IL-6 濃度為 500-1500UI/ml。
[0010]優(yōu)選的，步驟(3)中，培養(yǎng)基中GM-CSF濃度為20_100ng/mL，IL-3濃度為50-150ng/mL，雙抗?jié)舛葹?50-150U/mL，IL-1 β 濃度為 1000_3000UI/ml、TNF-α 濃度為500U1-1500UI/ml。
[0011]優(yōu)選的，所述單表位多聚抗原肽的加入量為0.5-10mg/ml。
[0012]具體的，步驟(4)包括如下步驟:將促熟后的DC細胞進行離心清洗后吸去上清，用復方電解質(zhì)注射液重懸細胞沉淀；將細胞沉淀離心后反復清洗3遍；將清洗后的DC細胞用10%的人血白蛋白的復方電解質(zhì)注射液垂懸，混勻后進行裝袋封口，并抽取部分樣品進行檢測；檢測合格后的注射液須在4°C保存，并在24h之內(nèi)應用。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于選用單表位多聚抗原肽(SEA-MAP)負載DC細胞，單表位多聚抗原肽為體外合成，成份明確單一，純度高；堿性氨基酸作骨架將單表位連接成，使連接的表位肽的朝向具有一致性易被DC細胞識別呈遞，四分枝或者八分枝的多聚抗原肽單位空間內(nèi)指數(shù)級增加了表位肽的特異性結(jié)合能力和反應，敏感性特異性強，負載有效率高，無免疫耐受；對激活CD4+細胞和CD8+細胞抗腫瘤細胞的能力較現(xiàn)有方法至少提高萬倍以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1A和圖1B為不同培養(yǎng)時間細胞的形態(tài)，圖1A為促成熟前細胞細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)；圖1B為促成熟后細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)；放大倍率均為20 X。
[0015]圖2為促成熟后DC細胞中⑶IIC和HLA-DR的流式細胞分析結(jié)果。
[0016]圖3為促成熟后DC細胞中⑶83的流式細胞分析結(jié)果。
[0017]圖4為促成熟后DC細胞中⑶86的流式細胞分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018]實施例1臍帶血來源的DC的制備
[0019](一)臍血單核細胞分離:
[0020]將臍血袋剪開，用50ml注射器量取臍血，用等量的復方電解質(zhì)注射液稀釋血液；以Ficoll分離液與細胞懸浮液2:3的比例，將稀釋好細胞懸浮液緩慢加到Ficoll分離液上層；離心，900g、25min ;吸取分界處白膜附近細胞，復方電解質(zhì)注射液重懸；離心400g、Smin ;吸去上清，用復方電解質(zhì)注射液重懸細胞沉淀；離心400g、8min ;吸去上清，細胞沉淀加IOml培養(yǎng)基重懸 后計數(shù)；根據(jù)計數(shù)結(jié)果，培養(yǎng)DC。
[0021](二)DC貼壁培養(yǎng)
[0022]用含1%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基調(diào)整單個核細胞濃度為4X 106/mL，取5ml加到T25培養(yǎng)瓶中，放置在37°C、5%C02孵箱中；2h后取出，鏡下觀察有細胞貼壁，吸去懸浮的細胞，并用培養(yǎng)基輕輕沖洗瓶底，將洗液與懸浮細胞離心后用于培養(yǎng)CIK;貼壁的細胞加入含GM-CSF (50ng/mL)、IL-4 (50ng/mL)、雙抗(100U/mL)和 10%FBS 的 RPM1-1640 培養(yǎng)基 6mL開始培養(yǎng)；3 天后補加含 GM-CSF (50ng/mL)、IL-4 (50ng/mL)、雙抗(100U/mL)和 10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基3ml繼續(xù)培養(yǎng)；第6天，將細胞混勻，取出一部分做FACS (HLA_DR\CDla\CD86)，其余換用配制好的培養(yǎng)基培養(yǎng)(1%FBS、GM-CSF1000UI/ml、IL_4500UI/ml、IL-61000UI/ml、IL-1 β 1900UI/ml、TNF-a llOOUI/ml),在這里進行單表位多聚抗原肽(SEA-MVP)負載，添加量為1.5，并孵育過夜；第7天，進行常規(guī)檢測后制備DC疫苗注射液。
[0023](三)DC疫苗制備
[0024]將促熟后的DC細胞進行離心清洗，400g、IOmin ;吸去上清，用復方電解質(zhì)注射液重懸細胞沉淀；離心400g、10min ;反復清洗3遍；將清洗后的DC細胞用10%的人血白蛋白的復方電解質(zhì)注射液垂懸；混勻后進行裝袋封口，并抽取部分樣品進行檢測；檢測合格后的注射液須在4°C保存，并在24h之內(nèi)應用。
[0025]實施例2促成熟后DC細胞的免疫表型檢測
[0026]取促成熟后DC細胞(第6天，將細胞混勻后取樣)，用無鈣鎂PBS洗2次后，各取I X 105/mL,分別加入相應的FCM管中。加入待檢測單克隆抗體包括⑶11C、HLA_DR、⑶83和⑶86抗體各5μ 1，4°C避光孵育30分鐘，每10分鐘搖晃I次，使細胞與抗體充分接觸。用PBS洗2次，并重懸在400 μ I的PBS中，采用流式細胞儀FASCSCalibur (BD Biosciences)檢測，結(jié)果見表1、圖2-4。[0027]表1
【權利要求】
1.樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)從臍血中分離得到臍血單核細胞； (2)用含1%FBS 的RPM1-1640培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)臍血單核細胞，去除未貼壁細胞，向貼壁細胞中加入含有GM-CSF、IL-4、雙抗和10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；三天后補加半量的所述RPM1-1640培養(yǎng)基； (3)第6 天，將細胞混勻，換用含有 1%FBS、GM-CSF, IL_4、IL_6、IL-1 β 和 TNF-α (腫瘤壞死因子_α )的培養(yǎng)基，同時進行單表位多聚抗原肽(SEA-MVP)負載，并孵育過夜； (4)第7天，進行常規(guī)檢測后制備DC疫苗注射液。
2.如權利要求1所述的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，加入的 GM-CSF 濃度為 500-1500UI/ml，IL-4 濃度為 200_1000UI/ml，IL-6 濃度為 500-1500UI/ml ο
3.如權利要求1所述的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，培養(yǎng)基中 GM-CSF 濃度為 20-100ng/mL，IL-3 濃度為 50_150ng/mL，雙抗?jié)舛葹?50_150U/mL，IL-1 β 濃度為 1000-3000UI/ml、TNF-a 濃度為 500UI_1500UI/ml。
4.如權利要求1-3任一項所述的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述所述單表位多聚抗原肽的加入量為0.5-10mg/ml。
5.如權利要求1-3任一項所述的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，具體的，步驟(4)包括如下步驟:將促熟后的DC細胞進行離心清洗后吸去上清，用復方電解質(zhì)注射液重懸細胞沉淀；將細胞沉淀離心后反復清洗3遍；將清洗后的DC細胞用10%的人血白蛋白的復方電解質(zhì)注射液垂懸，混勻后進行裝袋封口。
【文檔編號】A61P35/00GK103948917SQ201410131192
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權日:2014年4月2日
【發(fā)明者】劉樂鋒 申請人:江蘇和澤生物科技有限公司