定點(diǎn)突變的戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白ORF2的第439～617位氨基酸中第562位氨基酸的定點(diǎn)突變體。本發(fā)明還公開了一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白的制備方法。本發(fā)明制備了5種重組蛋白p179N562、p179N562Q﹑p179N562D﹑p179N562P﹑p179N562Y，均可以分泌表達(dá)，培養(yǎng)上清中的表達(dá)量達(dá)到50mg/L。5種蛋白除具有良好的抗原性外，在免疫BALB/c小鼠后，均有良好的免疫原性。更重要的是，在體外，5種蛋白的免疫血清具有中和戊型肝炎病毒的作用。本發(fā)明是一個(gè)基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型戊型肝炎疫苗的方法以及它的制品，可用于疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)，是新一代高效﹑廉價(jià)戊型肝炎疫苗的優(yōu)選蛋白。
【專利說明】定點(diǎn)突變的戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學(xué)的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及定點(diǎn)突變的戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]戊型肝炎病毒(h印atitis E virus, HEV)是一種嚴(yán)重危害人類健康的肝炎病毒，它主要經(jīng)糞-口途徑傳播(污染的水源)，引起的急性戊型肝炎(h印atitis E，HE)分布于世界許多國家，最常見于亞洲和非洲不發(fā)達(dá)國家。HEV在我國流行方式主要有暴發(fā)流行和散發(fā)兩種。我國戊型肝炎大暴發(fā)規(guī)模最大的一次發(fā)生于1986-1988年的新疆，共發(fā)病119280例，死亡707人，其中414名為孕婦。散發(fā)病例主要在城市流行，我國人群HEV感染率約為17.2%，散發(fā)流行具有明顯的春冬季高峰。HEV除了引起急性戊型肝炎外，最近報(bào)道若病人為器官移植術(shù)后或HIV攜帶者等免疫缺陷患者，亦可轉(zhuǎn)為慢性戊型肝炎。在60歲以上的老人中戊型肝炎的發(fā)病率逐漸上升，表現(xiàn)出病情重，病程長，病死率高，并發(fā)癥多，重度黃疸比例高的老年戊型肝炎特點(diǎn)。HEV感染在我國已經(jīng)構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，研發(fā)高保護(hù)性的疫苗和高靈敏度特異性的診斷試劑尤為迫切。[0003]HEV是單股正鏈的RNA病毒，電鏡下HEV是直徑27~34nm球形顆粒，呈20面體立體對稱，無包膜，病毒衣殼表面有突起?；蚪M全長大約7200個(gè)核苷酸，具有3個(gè)互相重疊的開放讀碼框架(open reading frame, 0RF)。其中0RF2編碼660個(gè)氨基酸的衣殼蛋白，功能是完成病毒粒子的組裝、與宿主細(xì)胞的吸附、刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是目前疫苗研發(fā)的主要靶點(diǎn)。P0RF2有三個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(Asn-137、Asn-310和Asn_562)，在真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，Asn-137、Asn-310和Asn_562殘基進(jìn)行糖基化修飾。p0RF2可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，S domain (128 ~319aa)、M domain (320 ~455aa)和 P domain (456 ~606aa)。從p0RF2晶體衍射結(jié)構(gòu)來看,P domain以二聚體的結(jié)構(gòu)形式組成病毒衣殼表面的突起，Asn-562潛在的糖基化位點(diǎn)正好處于P domain突起頂部的中心位置，此位置是病毒粒子與細(xì)胞粘附和產(chǎn)生中和抗體的部位。如果Asn-562發(fā)生糖基化，那么形成的糖鏈對Pdomain 二聚體的形成、抗原性和免疫原性以及中和抗體的產(chǎn)生會帶來什么樣的影響，目前為止未見有報(bào)道。反之將Asn-562糖基化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，Asn-562糖基化位點(diǎn)突變體的生物學(xué)功能還未見報(bào)道。
[0004]由于HEV不能有效地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，故無法制備其減毒或滅活疫苗，目前國內(nèi)外學(xué)者多采用基因工程技術(shù)在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中研發(fā)重組戊型肝炎疫苗。近年來，酵母表達(dá)系統(tǒng)以其高穩(wěn)定、高表達(dá)、高分泌等特點(diǎn)得到廣泛利用。酵母屬于低等真核微生物。當(dāng)前對酵母特性和遺傳背景的研究較清楚:①基因重組易操作②易于在營養(yǎng)成份簡單的培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵培養(yǎng)，適于工業(yè)化生產(chǎn)③具有分泌型表達(dá)模式，正確的折疊和修飾④發(fā)酵液中雜蛋白少，產(chǎn)物易于純化，無熱原和其它病原體，且不含癌基因，表達(dá)產(chǎn)物的安全性高。目前全世界大規(guī)模生產(chǎn)和使用的乙型肝炎疫苗也是由酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物制成。因此如何利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)高表達(dá)水平、低成本的基因工程疫苗對我國的戊型肝炎流行控制十分重要。
[0005]HEV在體外不能大量細(xì)胞培養(yǎng)，組裝成為有功能的病毒粒子衣殼蛋白的p0RF2是糖基化還是非糖基化形式，目前還不明確。如果Asn-562發(fā)生糖基化，那么形成的糖鏈對Pdomain 二聚體的形成、抗原性和免疫原性以及中和抗體的產(chǎn)生會帶來什么樣的影響，目前為止未見有報(bào)道。反之將Asn-562糖基化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，Asn-562糖基化位點(diǎn)突變體的生物學(xué)功能還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:為解決上述問題，本發(fā)明在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)含有Asn-562糖基化位點(diǎn)的0RF2pl79 (439-617aa)，并設(shè)計(jì)針對Asn-562糖基化位點(diǎn)的突變體，來研究糖基化P179與點(diǎn)突變的pl79在二聚體的形成、抗原性、免疫原性以及中和抗體的產(chǎn)生等方面的改變。以深入了解HEV結(jié)構(gòu)蛋白中保護(hù)性中和表位的結(jié)構(gòu)特征，因?yàn)橹挥猩钊肓私釮EV結(jié)構(gòu)蛋白中保護(hù)性中和表位的結(jié)構(gòu)特征，才能研發(fā)出高保護(hù)性的疫苗和高靈敏度特異性的診斷試劑。[0007]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白0RF2的第439~617位氨基酸中第562位氨基酸的定點(diǎn)突變體。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種重組質(zhì)粒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了一種基因工程菌株。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供了一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白的制備方法。
[0008]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白0RF2的第439~617位氨基酸中第562位氨基酸的定點(diǎn)突變體，分別為P179N562Q, pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y，所述氨基酸序列分別如 SEQ ID N0.2, SEQID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8 所述。
[0009]其中，上述pl79N562Q，pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y 的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7 所述。
[0010]一種重組質(zhì)粒，包含上述的定點(diǎn)突變體的核苷酸序列。
[0011]其中，上述重組質(zhì)粒分別為pPICZ aA/pl79N562Q，pPICZ a A/pl79N562D,pPICZaA/pl79N562P 和 pPICZ aA/pl79N562Y。
[0012]一種基因工程菌株，它包含有上述的重組質(zhì)粒。
[0013]其中，上述基因工程菌株為巴斯德畢赤酵母菌株。
[0014]一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白的制備方法，包括以下步驟:
[0015]I) PCR 擴(kuò)增獲得 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y 的目的
基因;
[0016]2)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPICZaA/pl79N562，pPICZa A/pl79N562Q，pPICZaA/P179N562D, pPICZaA/pl79N562P 和 pPICZaA/pl79N562Y ；
[0017]3)將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母菌株獲得重組工程菌；
[0018]4)將重組工程菌利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并通過硫酸銨鹽析法純化獲得目的蛋白。
[0019]上述制備方法制備的戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
[0020]上述戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白在制備戊型肝炎疫苗方面的應(yīng)用。[0021]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明為我國戊型肝炎流行控制提供了一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白。本發(fā)明提供的特異性戊型肝炎病毒的重組結(jié)構(gòu)蛋白制備簡便，降低了疫苗生產(chǎn)的成本，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的戊型肝炎病毒的特異性重組結(jié)構(gòu)蛋白的免疫血清具有中和戊型肝炎病毒的能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0023]其中圖1A為 PCR擴(kuò)增pl79N562及重組PCR擴(kuò)增pl79N562Q，pl79N562D，pl79N562P和 P179N562Y 基因；
[0024]圖1B為酵母菌落PCR擴(kuò)增2000 μ g / mLZeocin的YPDS平板上生長的pl79N562及 pl79N562Q, pl79N562D, pl79N562P 和 pl79N562Y 基因；[0025]圖 2 為 SDS-PAGE分析pl79N562 及pl79N562Q，pl79N562D，pl79N562P和 pl79N562Y重組蛋白72h誘導(dǎo)表達(dá)上清,其中M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),N表示樣品未經(jīng)100°C加熱5min,H表示樣品經(jīng)過100°C加熱5min ；
[0026]圖 3 為 SDS-PAGE 分析 Western-blot 分析 tunicamycin (衣霉素)對 pl79N562及P179N562Q，pl79N562D, pl79N562P和pl79N562Y的干預(yù)結(jié)果，其中M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、3、5、7、9 為 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y 加 Λtunicamycin (50 μ g/ml).2、4、6、8、10 為 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y 未加入 tunicamycin ；
[0027]圖 4 為 Western-blot 分析 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P 和P179N562Y重組蛋白抗原的免疫反應(yīng)性比較；
[0028]其中圖4A、4B 和 4C 分別為 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D, pl79N562P 和P179N562Y重組蛋白抗原與中和性單克隆抗體5G5、HEV IgG陽性病人血清和線性單克隆抗體6F9反應(yīng)，其中M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、3、5、7、9、11分別為pl79N562及P179N562Q, pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y 和 pPICZaA/SMD1168 未經(jīng) 10(TC加熱 5min，2、4、6、8、10、12 分別為 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D，pl79N562P，pl79N562Y和 pPICZaA/SMD1168 經(jīng) 100°C加熱 5min ；
[0029]圖 5 為間接 ELISA 檢測 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D, pl79N562P 和P179N562Y重組蛋白抗原免疫BALB/c小鼠后血清中抗HEV特異性IgG抗體水平，各免疫血清的稀釋度均為1:104 ;
[0030]圖6A 和圖 6B 為體外一步法 RT-PCR 檢測 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D,P179N562P和pl79N562Y重組蛋白免疫血清的中和能力；
[0031]圖6A 中 1-8，9-16，17-24 分別為 pl79N562, pl79N562Q, pl79N562D 免疫血清從1:10到1:1280稀釋度；
[0032]圖6B 中 1-8，9-16 為 pl79N562P, pl79N562Y 免疫血清從 1:10 到 1:1280 稀釋度，17為已知具有中和能力的血清1:10稀釋度，18為免疫前小鼠血清1:10稀釋度。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明所使用的DEPC水購于南京凱基生物；EcoR 1、Xba I酶購于美國Fermentas公司；高保真酶、dNTP購于美國Roche公司；Sac 1、T4DNA Ligase購于大連寶生物工程有限公司；pET_28a(+)/pl79重組質(zhì)粒、DH5 α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pPICZaA質(zhì)粒、SMD1168菌株、Zeocin、山梨醇購買于美國Invitrogen公司；甲醇購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；衣霉素購買于法國MP公司；酵母抽提物、胰蛋白胨購于英國COXOID公司；硫酸銨購買于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；HRP—羊抗小鼠IgG、HRP—羊抗人IgG購于美國KPL公司；弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司；試驗(yàn)用BALB/c小鼠購買于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。
[0034]實(shí)施例1HEV病毒株結(jié)構(gòu)蛋白0RF2第562位氨基酸保守性分析
[0035]利用生物信息學(xué)軟件Lasergene對Genbank201株包含HEV結(jié)構(gòu)蛋白0RF2562aa的氛基酸序列進(jìn)行同源性比對，只有6株(GenBank accession numbers:AB189070,AB425831, AB593690, AB698071, AB740232 和 JQ026407)在 562aa 由 562DTT 代替了 562NTT。說明HEV病毒株結(jié)構(gòu)蛋白0RF2562aa的潛在的糖基化基序N-X-T具有高度的保守性。
[0036]實(shí)施例2第562位氨基酸人工定點(diǎn)突變的實(shí)施方法
[0037]1、突變體的選擇
[0038]表1根據(jù)氨基酸的分子量、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和類型將562aa突變?yōu)橐韵滤念惏被?br> [0039]
【權(quán)利要求】
1.一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白0RF2的第439~617位氨基酸中第562位氨基酸的定點(diǎn)突變體，分別為P179N562Q，pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y，其特征在于，所述氨基酸序列分別如 SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6, SEQ ID N0.8 所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定點(diǎn)突變體，其特征在于，所述P179N562Q，pl79N562D,pl79N562P，pl79N562Y 的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.5,SEQID N0.7 所述。
3.—種重組質(zhì)粒，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的定點(diǎn)突變體的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒分別為pPICZaA/P179N562Q, pPICZ a A/pl79N562D, pPICZ a A/pl79N562P 和 pPICZ a A/pl79N562Y。
5.一種基因工程菌株，其特征在于，它包含有權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株為巴斯德畢赤酵母菌株。
7.一種戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)卩0?擴(kuò)增獲得？179陽62、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y的目的基因； 2)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPICZa A/pl79N562，pPICZ a A/pl79N562Q, pPICZ a A/pl79N562D,pPICZaA/pl79N562P 和 pPICZaA/pl79N562Y ； 3)將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母菌株獲得重組工程菌； 4)將重組工程菌利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并通過硫酸銨鹽析法純化獲得目的蛋白。
8.權(quán)利要求7所述的制備方法制備的戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
9.權(quán)利要求8所述的戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白在制備戊型肝炎疫苗方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/14GK103897044SQ201410132322
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】孟繼鴻, 徐明杰 申請人:東南大學(xué)