一種抗cd20單鏈抗體的植物種子表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗CD20單鏈抗體的植物種子表達(dá)系統(tǒng)，它是按VL-VH-Linker-hIgG1Fc順序，在基因的5’端有編碼大麥α-Amylase信號肽序列的核苷酸序列，設(shè)計并人工合成了抗CD20單鏈抗體基因，將基因插入植物種子特異表達(dá)載體p1301b中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植株；將帶有種子特異性啟動子，抗CD20單鏈抗體基因和終止子的表達(dá)框整合進(jìn)植物基因組中；篩選和培養(yǎng)出了帶有上述基因的植株，進(jìn)一步通過篩選和擴(kuò)繁得到了純合植株，該純合植株所產(chǎn)生的種子中含有所述的抗CD20單鏈抗體；重組蛋白定向表達(dá)在液泡內(nèi)；表達(dá)的抗CD20單鏈抗體具有生物學(xué)活性，對Daudi細(xì)胞的ADCC殺傷能力與Rituxan無顯著差異。
【專利說明】一種抗CD20單鏈抗體的植物種子表達(dá)系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及抗CD20單鏈抗體基因及利用植物種子特異性表達(dá)啟動子在植物種子中高效表達(dá)抗CD20單鏈抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)《2012中國腫瘤登記年報》顯示，目前我國每年新發(fā)癌癥病例約312萬，因癌癥死亡超過200萬。惡性腫瘤已經(jīng)成為我們城鄉(xiāng)居民的第一位死亡原因。非霍奇金氏淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma, NHL)是最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，其中絕大多數(shù)為B細(xì)胞淋巴瘤。CD20抗原是一種B細(xì)胞分化抗原，位于B細(xì)胞的表面，僅存在于成熟B細(xì)胞和B細(xì)胞前體中，在正常組織中不表達(dá)，而在95%以上的B細(xì)胞淋巴瘤中均有過量表達(dá)。這也使⑶20成為了治療B細(xì)胞淋巴瘤的一個理想靶點。Rituxan (Rituximab，美羅華)為美國羅氏公司產(chǎn)品，是一種人鼠嵌合抗體。Rituxan于1997年獲得FDA批準(zhǔn)上市，是第一個被批準(zhǔn)用于治療惡性腫瘤的單克隆抗體。目前用于治療低惡度、濾泡型B細(xì)胞淋巴瘤。
[0003]隨著對Rituxan治療其他一些 自身免疫性疾病研究的深入，Rituxan在臨床疾病治療方面的潛在價值將會被進(jìn)一步開發(fā)，社會對其的需求也越來越大。但是由哺乳動物細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)的Rituxan需要昂貴的設(shè)備和培養(yǎng)基，從而增加了其生產(chǎn)成本，導(dǎo)致其價格高昂(一療程的費用約20萬元人民幣左右)。
[0004]利用植物反應(yīng)器已經(jīng)成功的表達(dá)了多種具有生物活性和功能的藥用蛋白，其中包括單克隆抗體、疫苗抗原、治療用酶、血液蛋白、細(xì)胞因子、生長因子和生長激素等。而以植物作為生物反應(yīng)器則具有諸多的特點和優(yōu)點:(I)可根據(jù)重組蛋白的需求來選擇不同形式的表達(dá)體系，可分為整株表達(dá)和組織特異性表達(dá)，如種子、須根，以及懸浮細(xì)胞等；(2)大規(guī)模生產(chǎn)時具有較低的生產(chǎn)成本和靈活性；(3)植物具有與哺乳動物細(xì)胞相似的蛋白翻譯后修飾途徑，從而獲得有功能的活性蛋白；(4)較高的安全性，不攜帶動物病原體；(5)便于儲藏和運輸。
[0005]盡管豆類和谷類等種子植物相對于葉類作物產(chǎn)生較少的生物量，但卻為儲存提供了極佳的條件。葉類作物在采樣后，葉片需要冰凍或干燥以備運輸，或立即進(jìn)行處理；而成熟的種子卻可以在室溫下長時間存儲。在長期的進(jìn)化過程中，種子作為植物的貯藏器官，可以在很小的空間內(nèi)積累大量的蛋白質(zhì)，且種子中含有豐富的分子伴侶、適宜蛋白質(zhì)折疊的環(huán)境以及較少的蛋白激酶。此外，大多數(shù)的種子體積較小，這樣可以使表達(dá)的重組蛋白高度集中，雖然總生物產(chǎn)量并沒有葉片植物高，但卻有利于蛋白質(zhì)的下游提取和純化；而且植物種子表達(dá)重組蛋白，不會影響植物的生長。而通過將重組蛋白定向表達(dá)至液泡中存儲，不僅可以獲得完整的翻譯后修飾，還可以提高重組蛋白的表達(dá)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種融合基因，抗CD20單鏈抗體基因，以及利用植物種子表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗⑶20單鏈抗體基因，生產(chǎn)抗⑶20單鏈抗體。[0007]抗⑶20單鏈抗體基因，它包括:輕鏈可變區(qū)-重鏈可變區(qū)-連接肽-人免疫球蛋白G的Fe片段并且在其5’端加入了編碼大麥a -Amylase的信號肽序列；
所述的抗⑶20單鏈抗體基因，其堿基序列如SEQ ID N0.1所示；
一種植物表達(dá)載體質(zhì)粒，它是在植物表達(dá)載體中插入了上述的抗CD20單鏈抗體基因； 所述的植物表達(dá)載體為植物種子特異表達(dá)載體Pl301b ；
所述的植物種子特異表達(dá)載體Pl301b，是由下述方法構(gòu)建的:人工合成了β -phaseolin的啟動子和終止子序列，并在啟動子兩端分別添加Xho I和Nco I酶切位點，在終止子兩端分別添加Hind III和Kpn I酶切位點；并通過KpnI和Bst EII雙酶切的方法從pBASTA質(zhì)粒上獲得35S+Bar基因；同時利用Kpn I和Bst EII雙酶切pCambial301，連入35S+Bar原件,構(gòu)建中間載體pl301Bas。再通過酶切,連接反應(yīng)將β-phaseolin的啟動子和終止子原件連接至pl301Bas中；
抗CD20單鏈抗體，它是由下述方法生產(chǎn)的:
1、將上述的一種植物表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至根瘤農(nóng)桿菌EHA105中；
2、再將根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染至植物中；
3、培育所述的植物，采集種子；提取抗CD20單鏈抗體蛋白；
所述的植物為擬南芥、紅花、玉米或亞麻芥。
[0008]上述的抗CD20單鏈抗體在制備治療非霍奇金氏淋巴瘤及自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供了一種抗CD20單鏈抗體的植物種子表達(dá)系統(tǒng)，它是按VL-VH-Linker-hlgGlFc順序，在基因的5’端有編碼大麥a -Amylase信號肽序列的核苷酸序列，設(shè)計并人工合成了抗CD20單鏈抗體基因，將基因插入植物種子特異表達(dá)載體pl301b中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植株；將帶有種子特異性啟動子，抗CD20單鏈抗體基因和終止子的表達(dá)框整合進(jìn)植物基因組中；篩選和培養(yǎng)出了帶有上述基因的植株，進(jìn)一步通過篩選和擴(kuò)繁得到了純合植株，該純合植株所產(chǎn)生的種子中含有所述的抗CD20單鏈抗體；重組蛋白定向表達(dá)在液泡內(nèi)；且表達(dá)的抗⑶20單鏈抗體具有生物學(xué)活性，對Daudi細(xì)胞的ADCC殺傷能力與Rituxan無顯著差異。
[0010]采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)抗⑶20單鏈抗體具有如下優(yōu)點:
1、通過采用分泌型表達(dá)，重組蛋白可以獲得正確的折疊，組裝和修飾，并且定向儲藏在液泡內(nèi)，確保了重組藥用蛋白的生物學(xué)活性的獲得；
2、利用植物表達(dá)外源蛋白可以避免大腸桿菌內(nèi)毒素和動物病原體的污染；
3、通過利用種子特異性強(qiáng)啟動子，可有效提高重組蛋白的表達(dá)量；
4、利用植物種子表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗CD20單鏈抗體，可以有效降低生產(chǎn)成本，同時有利于抗⑶20單鏈抗體的產(chǎn)業(yè)化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是人工合成的植物密碼子偏好性的抗人CD20單鏈抗體基因的酶切鑒定圖；其中:1、DL2000, 2—4、質(zhì)粒，5、對照質(zhì)粒，6、DL15000 ;
圖2是植物種子表達(dá)載體pl301-Ri的構(gòu)建過程示意圖；
圖3是表達(dá)載體pl301-Ri的雙酶切鑒定圖；其中:1、DL2000，2、質(zhì)粒；圖4是表達(dá)載體pl301-Ri的結(jié)構(gòu)詳細(xì)示意圖；
圖5是轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的SDS-PAGE電泳圖；其中:1、非轉(zhuǎn)基因擬南芥，2—4、轉(zhuǎn)基因擬南芥；
圖6是抗人⑶20單鏈抗體在擬南芥種子中表達(dá)的Western Blot檢測圖；其中:1—6、轉(zhuǎn)基因擬南芥，7、非轉(zhuǎn)基因擬南芥；
圖7是抗人CD20單鏈抗體的生物學(xué)活性檢測圖。
【具體實施方式】
[0012]實施例1中間載體pl301b的獲得
根據(jù)TC.Hall和McBride, Summerfelt等人文章公布的核苷酸序列，人工合成了β -phaseolin的啟動子和終止子序列，并在啟動子兩端分別添加Xho I和Nco I酶切位點，在終止子兩端分別添加Hind III和Kpn I酶切位點；并通過KpnI和Bst EII雙酶切的方法從pBASTA質(zhì)粒上獲得35S+Bar基因；同時利用Kpn I和Bst EII雙酶切pCambial301，連入35S+Bar原件,構(gòu)建中間載體pl301Bas。再通過酶切,連接反應(yīng)將β-phaseolin的啟動子和終止子原件連接至pl301Bas中，構(gòu)建成中間載體pl301b。
[0013]實施例2抗CD20單鏈抗體，即VL-VH-Linker-hlgGlFc的人工合成
委托江蘇金唯智生物科技有限公司人工合成了植物偏好性密碼子的基因序列，即編碼大麥a -Amylase信號肽 序列的核苷酸序列,單克隆抗體C2B8的輕鏈可變區(qū),連接肽,單克隆抗體C2B8的重鏈可變區(qū)，人IgGl的Hinge及CH2和CH3序列。此外，在合成序列的兩端分別添加Nco I和Hind III酶切位點。其堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]實施例3抗⑶20單鏈抗體種子表達(dá)載體的構(gòu)建
用Nco I和Hind III分別雙酶切pi30Ib和含有上述單鏈抗體基因的質(zhì)粒pUC57_Ri，將得到的約12000bp和1500bp的片段進(jìn)行連接，得到抗⑶20單鏈抗體的植物表達(dá)載體pAmy-scFv—Fc。
[0015]實施例4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化與篩選 1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
利用凍融法將上述表達(dá)載體pAmy-scFv-Fc轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將7ul質(zhì)粒加入IOOul農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻，冰浴30分鐘；置于液氮中速凍2分鐘，然后迅速置于37°C水浴鍋中溫育5分鐘。加入ImL無抗生素的YEP，28°C條件下ISOrpm復(fù)蘇2小時；復(fù)蘇后取300ul菌液均勻涂布在含有卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的平板上，28°C倒置培養(yǎng)2天。挑選單獨的菌落接種于含有卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)；
取2ul菌液作為菌液PCR檢測的模板，反應(yīng)條件為:94°C 5分鐘，(94°C 30秒，56°C 30秒，720C I分鐘)共30個循環(huán)，720C 10分鐘，4°C 5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取20ul產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0016]2、擬南芥的轉(zhuǎn)化和篩選
通過浸染花序法(Floral-Dip)轉(zhuǎn)化擬南芥。
[0017]將上述含有目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌于28 °C培養(yǎng)過夜，至0D600 ^ 2.00，4000rpm離心10分鐘收集菌體；利用新鮮配制的重懸液(5%蔗糖，Selwet-77 300uL/L)將菌液濃度調(diào)節(jié)為0D600~0.8。取生長一個月左右，生長狀況良好的植株，去除已經(jīng)發(fā)育的莢后，利用浸染液浸染地上部分30s，去除多余浸染液后用保鮮膜包裹，避光放置48小時，后置于正常條件下生長，直至種子成熟。
[0018]Tl代種子完全成熟后收集陰干，將消毒后的種子均勻播種于含有草銨膦10mg/L的MS培養(yǎng)基上，置于4°C純化48小時后移至光照培養(yǎng)箱中，在22°C，16光/8暗的條件下生長一周；選取抗性幼苗移入土中繼續(xù)培養(yǎng)。待幼苗長大后利用葉片提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證后收集陽性植株的種子用于進(jìn)一步的分析。
[0019]實施例5轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測
以上述獲得的不同單株的基因組DNA為模板，分別利用位于單鏈基因兩端的引物進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)條件為:94°C 5分鐘，(940C 30秒，56°C 30秒，72°C I分鐘)共30個循環(huán)，72°C 10分鐘，4°C 5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取20ul產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，得到預(yù)期的約1500bp的條帶。
[0020]實施例6擬南芥種子總蛋白的提取
查取50粒擬南芥種子置于離心管中，用50ulTris-HCl (pH 8.0)進(jìn)行研磨，研磨充分后加如10ul5X蛋白loadi ng buffer,于沸水中煮10分鐘，于12000g離心30分鐘。取15ul上清進(jìn)行電泳。結(jié)果見圖5，第一道為非轉(zhuǎn)基因擬南芥種子總蛋白，第二道至四道為轉(zhuǎn)基因擬南芥種子總蛋白，剪頭所示為重組蛋白。
[0021]實施例7擬南芥種子中重組蛋白的Western Blot檢測。
[0022]1、種子總蛋白的SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜
種子總蛋白用10%不連續(xù)Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠在Bio-rad公司的垂直電泳裝置中進(jìn)行分離，條件為60V電泳45分鐘后改為100V至溴酚藍(lán)拋出凝膠。電泳結(jié)束后利用Bio-rad公司的蛋白電泳轉(zhuǎn)移設(shè)備，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45umPVDF膜上，條件為100V電泳I小時。
[0023]2、膜的雜交
轉(zhuǎn)移好的膜先用含有5%BSA的TBST封閉液封閉2小時，抗體選用HRP藕聯(lián)的抗人IgG (H+L),以 1:1500 稀釋后孵育，經(jīng)清洗后使用 Pierce 的 Super Signal west picoChemiluminescent Substrate進(jìn)行顯色。Western Blot結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中有抗人⑶20單鏈抗體的表達(dá)，產(chǎn)物大小約為53kD，與預(yù)期一致。Western Blot分析結(jié)果見圖6。
[0024]實施例7重組片段抗體的純化 1、種子總可溶性蛋白的提取
稱取500mg轉(zhuǎn)基因擬南芥種子,液氮研磨充分后,加入50ml己燒鏇潤震蕩10分鐘,后離心5000g，30分鐘，棄去上清后真空低溫干燥。將干燥后的粉末再次液氮研磨，己烷提取，棄上清，真空低溫干燥。用50mM磷酸緩沖溶液(pH7.4) 45mL重懸沉淀，冰浴30分鐘。
[0025]將冰浴好的提取液20000g離心30分鐘，小心吸取上清至一干凈離心管中，先經(jīng)
0.45 μ m抽濾，再利用0.22 μ m濾膜抽濾后獲得蛋白提取液。
[0026]2、Protein A親和層析純化重組片段抗體
將預(yù)裝柱HiTrap rProtein A FF (GE)連接至AKTA純化系統(tǒng)，以50mM磷酸緩沖溶液進(jìn)行平衡后，將0.22 μ m抽濾后的蛋白提取液上柱，經(jīng)50mM磷酸緩沖溶液洗去雜蛋白，后利用0.1M檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫重組片段抗體。(注:收集管中預(yù)先加入100μ LpH9.0的IMTris-HCl緩沖液，每管收集Iml洗脫液)
實施例8擬南芥表達(dá)的抗人CD20單鏈抗體的生物學(xué)活性檢測
1、外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離
無菌采集靜脈血，注入含有肝素20U/ml的離心管中，輕輕混勻，加入等體積的PBS溶液；每管加入6ml平衡至室溫的淋巴細(xì)胞分離液，傾斜離心管，沿管壁緩慢加入抗凝外周血6ml/管；20°C，800g離心30分鐘，自然降速；用吸管輕輕插入毛玻璃樣層，緩慢吸出外周血單個核細(xì)胞，放入另一 15ml離心管中；PBS稀釋后加入無酚紅RPM1-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為6x107ml，加入160U/ml的IL-2預(yù)激活，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中備用。
[0027]2、細(xì)胞與抗體的作用
以Daudi為靶細(xì)胞，分別取對數(shù)期細(xì)胞，用無酚紅的RPM1-1640重懸細(xì)胞至3X105/ml備用；設(shè)定培養(yǎng)基實驗孔、背景孔、效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞自發(fā)釋放值孔和效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞最大釋放值孔，每種情況都設(shè)3個平行孔；將重組scFv-Fc和Rituxan稀釋至濃度分別為100 μ g/mL、20 μ g/mL、4 μ g/mL、0.8 μ g/mL 和 0.16 U g/mL ;根據(jù) CytoTox 96? (Progema,USA)非同位素法細(xì)胞殺傷檢測試劑盒的說明在490nm進(jìn)行吸光值的測定?？谷薈D20單鏈抗體具有生物學(xué)活性，對Daudi細(xì)胞的ADCC殺傷能力與Rituxan無顯著差異。見圖7。
【權(quán)利要求】
1.抗CD20單鏈抗體基因，它包括:輕鏈可變區(qū)-重鏈可變區(qū)-連接肽-人免疫球蛋白G的Fe片段，并且在其5’端加入了編碼大麥a -Amylase的信號肽序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單鏈抗體基因，其特征在于:它的堿基序列如SEQIDN0.1所示。
3.一種植物表達(dá)載體質(zhì)粒，它是在植物表達(dá)載體中插入了權(quán)利要求1所述的抗CD20單鏈抗體基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物表達(dá)載體質(zhì)粒，其特征在于:所述的植物表達(dá)載體為植物種子特異表達(dá)載體Pl301b。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種植物表達(dá)載體質(zhì)粒，其特征在于:所述的植物種子特異表達(dá)載體pl301b,是由下述方法構(gòu)建的:人工合成了 β-phaseolin的啟動子和終止子序列，并在啟動子兩端分別添加Xho I和Nco I酶切位點，在終止子兩端分別添加Hind III和Kpn I酶切位點；并通過KpnI和Bst EII雙酶切的方法從pBASTA質(zhì)粒上獲得35S+Bar基因；同時利用Kpn I和Bst EII雙酶切pCambial301，連入35S+Bar原件，構(gòu)建中間載體pl301Bas， 再通過酶切，連接反應(yīng)將β -phaseolin的啟動子和終止子原件連接至pl301Bas中。
6.抗CD20單鏈抗體，它是由下述方法生產(chǎn)的: 1)將上述的一種植物表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至根瘤農(nóng)桿菌EHA105中； 2)再將根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染至植物中； 3)培育所述的植物，采集種子，提取抗CD20單鏈抗體蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單鏈抗體，其特征在于:所述的植物為擬南芥、紅花、玉米或亞麻芥。
8.權(quán)利要求6所述的抗CD20單鏈抗體在制備治療非霍奇金氏淋巴瘤及自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/395GK103981191SQ201410142022
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】姜潮, 李校堃, 王德仲, 李海燕, 劉秀明, 姚娜, 金立波 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)