用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的治療肽的制作方法【專利摘要】用與MUC1上的結(jié)合位點特異性結(jié)合的多肽或者抗體能夠中斷MUC1和β-聯(lián)蛋白之間的相互作用。相互作用的中斷提供了抑制、減輕和/或者阻滯癌癥的侵入或轉(zhuǎn)移的有益作用。提供了融合多肽和抗體以獲得治療作用?！緦＠f明】用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的治療狀[0001]本申請是申請日為2006年4月17日、申請?zhí)枮?00680011038.2、題為“用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的治療肽”的專利申請的分案申請。[0002]本申請要求2005年4月15日提交的臨時專利申請第60/671，956號的權(quán)益，該專利申請的公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0003]本發(fā)明涉及癌癥治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及抑制、延緩和減輕轉(zhuǎn)移癌生長的方法。【
背景技術(shù)：
】[0004]乳腺上皮細胞從有序的、依賴激素和生長因子的組織發(fā)展到一種轉(zhuǎn)移性瘤的過程包括許多步驟。這個發(fā)展過程包括生長控制的喪失，逃避細胞凋亡和衰老，侵入間葉細胞和隨后在二級位點處的血管內(nèi)滲和外滲。侵入能力是該過程的關(guān)鍵步驟，侵入主要被黏合連接的正常功能抑制。黏合連接正常發(fā)揮功能依賴于一系列蛋白質(zhì)的相互作用，這些蛋白質(zhì)的相互作用連接周邊細胞(通過E-鈣粘著蛋白同型相互作用)和胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架(通過β-聯(lián)蛋白)。腫瘤抗原MUCl蛋白是一種通過隔離β-聯(lián)蛋白和E-鈣粘著蛋白促使黏合鏈接功能失調(diào)的蛋白。這個提議旨在理解MUCl/β-聯(lián)蛋白相互作用在細胞入侵中的功能重要性和識別中斷這些相互作用的機制，作為抑制細胞入侵和轉(zhuǎn)移的手段。[0005]在癌變進程中，黏合鏈接(物)的蛋白組分常常失調(diào)。許多癌癥患者的E-鈣粘著蛋白表達能力喪失并且細胞不再維持同型相互作用。另外，β_聯(lián)蛋白因其不但作為細胞黏附蛋白而且還作為原癌基因而具有特殊的重要性。β_聯(lián)蛋白之所以具有這些功能是因為它不但參與了E-鈣粘著蛋白介導(dǎo)的細胞粘附，而且還存在于分散的細胞質(zhì)和核庫中，它作為fct-介導(dǎo)的信號途徑中關(guān)鍵的參與者和作為核輔助因子發(fā)揮著功能(Orsulic等，1999)。在極化的上皮細胞中，聯(lián)蛋白是黏合鏈接物和肌動蛋白細胞骨架之間的重要的連接物。在這些正常的細胞條件下，任何多余的β_聯(lián)蛋白通過復(fù)雜的信號級聯(lián)途徑被降解，該信號級聯(lián)牽涉腫瘤抑制因子APC(腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatouspolyposiscoli))(Polakis，2000)。作為選擇，在轉(zhuǎn)化條件下，多余的β_聯(lián)蛋白常常在乳腺癌腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的細胞質(zhì)中積累(Schroeder等,2003),在那里它與同E-1丐粘著蛋白競爭β-聯(lián)蛋白結(jié)合位點的蛋白相互作用(Polakis,2000;Sommers,1996)。其中研究地最透徹的是β_聯(lián)蛋白與核內(nèi)的tcf/lef轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，這種相互作用導(dǎo)致了包括c-myc和細胞周期蛋白Dl在內(nèi)的多種基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄(He等，1998;Shtutman等，1999；Tetsu和McCormick,1999)。在包括乳腺癌在內(nèi)的其他轉(zhuǎn)化組織中，也發(fā)現(xiàn)了β_聯(lián)蛋白與包括erbB受體和腫瘤抗原MUCl在內(nèi)的跨膜蛋白的相互作用(Li等，1998Jamamoto等，1997)。[0006]除了在超過90%的人乳腺癌和轉(zhuǎn)移癌中過量表達(高10倍)外，MUCl是在泌乳期乳腺中大量表達的高度O-糖基化的蛋白(Hilkens等1995;Zotter等1988)。在正常的乳腺中，MUCl主要在乳腺上皮細胞的頂面表達；然而在乳腺癌中，MUCl被過表達，糖基化不足和頂端定位喪失(Hilkens等，1995)。MUCl的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域存在含SH2蛋白的潛在停泊位點，還含有多種假定的激酶識別位點，該結(jié)構(gòu)域不論在體內(nèi)或體外都被酪氨酸磷酸化的(Schroeder等，2001;Zrihan_Licht,1994#248XMUCl通過類似于在APC蛋白中發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)尾中的基序與GSK3i3和β-聯(lián)蛋白結(jié)合。MUCl與β-聯(lián)蛋白的結(jié)合降低了ZR-75-1乳腺癌細胞中β-聯(lián)蛋白與Ε-|丐粘著蛋白的結(jié)合(Li等，1998；Yamamoto等1997)。這可能潛在地破壞了上皮細胞中E-鈣粘著蛋白介導(dǎo)的細胞粘附，從而促進了細胞遷移(Li等，1998)。事實上，通過利用反義寡核苷酸而導(dǎo)致的人乳腺癌細胞系(ZR-75-1S和YMB-S)中的MUCl的減少，造成細胞粘附的E-鈣粘著蛋白依賴性增加(Kondo等，1998)。此外，對侵入性人乳腺癌樣品的分析表明，MUCl和β_聯(lián)蛋白的相互作用發(fā)生在原發(fā)性腫瘤中，但是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中發(fā)生的頻率更高(Schroeder等，2003)。研究已表明，MUCl/β-聯(lián)蛋白之間的相互作用依賴由c-src激酶(Li等，2001b)和蛋白激酶CS(PKCδ)(Ren等，2002)引起的MUCl的磷酸化。在該系統(tǒng)中，由c-src或者PKCδ引起的MUCl的磷酸化降低了其對GSK3β的親和力和增加了與β_聯(lián)蛋白的結(jié)合。[0007]Mucl在β-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的乳腺癌進程中的作用已經(jīng)在體內(nèi)腫瘤模型MMTV-Wnt-1中得到了遺傳學(xué)驗證。fct是一個分泌性的糖蛋白，它與跨膜卷曲的(frizzled)受體結(jié)合，從而觸發(fā)了信號級聯(lián)反應(yīng)，使得聯(lián)蛋白的降解機制失效(He等1998；Polakis,2000；Shtutman等，1999;Tetsu和McCormic，1999)。這導(dǎo)致在MMTV-Wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠的細胞質(zhì)中產(chǎn)生了顯著的更高水平的聯(lián)蛋白和隨機地形成單病灶乳腺腫瘤(Tsukamoto等，1988)。在MMTV-Wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化的上皮細胞的細胞質(zhì)和細胞膜中，MUCl和β_聯(lián)蛋白以一種腫瘤特異性的方式發(fā)生生物化學(xué)相互作用。為了確定MUCl在該模型癌變進程中是否具有功能重要性，將MMTV-Wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠與Mucl基因敲除小鼠進行雜交(Schroeder等，2003)。小鼠Mucl基因的敲除使得腫瘤的發(fā)作時間推遲幾乎50%。在同樣的研究中，發(fā)現(xiàn)含有MUC-1細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域蛋白片段的脈沖(pulsing)侵襲性乳腺癌細胞系侵襲能力增加。這些片段代表多個蛋白質(zhì)相互作用位點，其功能類似于轉(zhuǎn)染整個MUCl胞質(zhì)尾區(qū)。定位試驗表明這些肽跟蹤侵襲偽足(invadopodia)并與β-聯(lián)蛋白共存。這暗示MUCl和β-聯(lián)蛋白的結(jié)合促使β-聯(lián)蛋白遠離黏合連接取而代之定位在膜突起位點上。在該位點，β_聯(lián)蛋白與細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的能力促使這些蛋白重新分布和促進細胞侵襲。因此，當MUCl與β-聯(lián)蛋白形成復(fù)合體后，它可能作為支架蛋白將多個激酶與肌動蛋白細胞骨架在膜侵襲位點處集合在一起，從而促進β_聯(lián)蛋白與侵襲細胞邊界之間新的相互作用。該復(fù)合體的形成不但在非轉(zhuǎn)移疾病中促進從增生轉(zhuǎn)化為癌癥，而且也誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)移侵入所需的動態(tài)改變。[0008]近來的研究表明MUCl是一個癌基因。體內(nèi)和體外實驗都表明MUC1(特別是MUCl的胞質(zhì)尾)的過度表達會導(dǎo)致乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)化(Li等2003和Schroeder等提交給JBC)。當MUCl在轉(zhuǎn)基因小鼠(MMTV-MUC1)內(nèi)過度表達時，大約60%的多胎雌鼠發(fā)生乳腺腫瘤，其潛伏期長且高度可變(Schroeder等，2004)。形成原發(fā)性乳腺腫瘤的小鼠中的90%也會患上肺轉(zhuǎn)移瘤。MUCl和β-聯(lián)蛋白之間的免疫沉淀研究表明，這兩種蛋白之間的相互作用發(fā)生在腫瘤組織中而不是正常的乳腺中。該資料說明MUCl和β_聯(lián)蛋白之間的相互作用并局限在已經(jīng)公布的MMTV-Wnt-1模型中(Schroeder等，2003)，也發(fā)生在MUCl引發(fā)的乳腺腫瘤發(fā)生模型中。重要的是，MMTV-MUC1轉(zhuǎn)基因是轉(zhuǎn)移性的，這進一步潛在地暗示了在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中發(fā)生這種相互作用。最后，體外證據(jù)顯示，大鼠3Y1成纖維細胞用MUCl轉(zhuǎn)染，也不但導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化，而且導(dǎo)致MUCl和β-聯(lián)蛋白之間形成特定的復(fù)合體(Li等，2003)。[0009]在MUCl胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的聯(lián)蛋白結(jié)合位點被酪氨酸激酶c_src、EGFR和色氨酸/蘇氨酸激酶PKCδ的結(jié)合位點包圍，乳腺癌細胞系和腫瘤組織中的MUCl與這些激酶的相互作用增加。而且，src和PKCS誘導(dǎo)的MUCl磷酸化促進了MUCl和β-聯(lián)蛋白之間的結(jié)合(Li等，2001)。當提供給細胞模擬整個結(jié)構(gòu)域的肽時，MUCl和β_聯(lián)蛋白共同定位于共存于侵入性細胞系的侵襲偽足中，并且細胞侵入增加5-10倍(SchiOeder等，2003)。當提供給細胞只含有EGFR或GSK3β結(jié)合位點的較短的蛋白片段時，則沒有觀察到細胞侵入和β-聯(lián)蛋白定位的改變(Schroeder等，2003)。這些資料表明:全長的MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域充當支架蛋白，通過將β_聯(lián)蛋白和細胞激酶在偽足處集合在一起，促進侵入。[0010]開發(fā)有效地治療癌癥，特別是晚期癌癥和轉(zhuǎn)移性癌的治療是本領(lǐng)域長期的需要?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0011]根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方式，提供了融合肽。該融合肽具有如下結(jié)構(gòu):[0012]A-B-C或C-B-A。[0013]A是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain),其增強粘附的大分子轉(zhuǎn)運通過細胞膜。B是0-5個氨基酸殘基的間隔子(spacer)。C是由6_15個氨基酸殘基組成的多肽，其包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQIDNO:1)的全部或部分序列，C的部分序列包括GGSSLS(SEQIDN0:2)。[0014]根據(jù)本發(fā)明另一個實施方式，提供了融合肽，其結(jié)構(gòu)為:[0015]A-B-C或C-B-A。[0016]A是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，其增強粘附的大分子轉(zhuǎn)運通過細胞膜。B是0-5個氨基酸殘基的間隔子。C是6-15個氨基酸殘基的多肽。C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQIDNO:1)的全部或部分序列，C的部分序列包括GGSSLS(SEQIDNO:2)。而且，所述的6_15個氨基酸殘基至少有一個被保守地替換，這樣不帶電荷的極性氨基酸替換不帶電荷的極性氨基酸殘基，或者非極性的氨基酸替換非極性的氨基酸殘基，或者酸性氨基酸替換酸性氨基酸殘基。[0017]根據(jù)本發(fā)明另一個實施方式，提供了融合肽，其具有如下結(jié)構(gòu):[0018]A-B-C或C-B-A。[0019]A是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，它增強粘附的大分子轉(zhuǎn)運通過細胞膜。B是0-5個氨基酸殘基的間隔子。C是6-15個氨基酸殘基的多肽。C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQIDNO:1)的全部或部分序列，C的部分序列包括GGSSLS(SEQIDNO:2)。而且，所述的6_15個氨基酸殘基中的一個殘基被A殘基代替。[0020]本發(fā)明另一方面提供了一種治療癌細胞的方法。將癌細胞與上述融合肽接觸。癌細胞的侵入性因此被減輕或被阻滯。[0021]本發(fā)明另一方面提供了一種治療癌癥患者的方法。給患者施用上述的融合肽，癌的侵入因此被減輕或被阻滯。[0022]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，提供了一種治療癌癥患者的方法。給患者施用能夠與PYEKVSAGNGGSSLS(SEQIDNO:1)結(jié)合的抗體，癌的侵入因此被減輕或被阻滯。[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生用于治療癌癥患者的多肽的方法。將攜帶編碼上述多肽的載體的細胞培養(yǎng)在允許細胞表達所述多肽的條件下。然后從細胞或細胞培養(yǎng)基中收獲多肽。[0024]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療癌癥患者的方法。患者將編碼上述多肽的載體施用于癌癥患者。多肽因此被表達，癌癥的侵入因此被減輕或被阻滯。[0025]通過閱讀說明書，這些和其它實施方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯然的，其為本領(lǐng)域提供了治療癌癥特別是轉(zhuǎn)移性癌的新工具?！緦＠綀D】【附圖說明】[0026]圖1.肽M2(MUCl-β-聯(lián)蛋白結(jié)合域)抑制MDA_MB_468乳腺癌細胞的侵襲。將膠原凝膠基質(zhì)倒在8μm孔徑的Transwell插入物(transwellinsert)(改進的Boyden室)底部，然后倒置入20%的FBS中。細胞用100ng/ml的肽溫育(含有Bioporter試劑，以允許細胞攝取)，然后將細胞加入到Tanswell的上部。允許細胞(不含血清)侵入凝膠，將膠去掉，并對侵入細胞計數(shù)。[0027]圖2.根據(jù)MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域設(shè)計的肽。上面的序列(SEQIDNO:13)顯示了MUCl導(dǎo)向的肽，當被脈沖(pulse)入侵襲性乳腺癌細胞系時,其促進侵襲(Schroeder等,2003)。激酶PKCδO，GSK3βO、src和EGFRO磷酸化的殘基加亮顯示(Ren等，2002)。已知與β_聯(lián)蛋白相互作用的序列用下劃線表示。列出了設(shè)計用于抑制MUCl/β-聯(lián)蛋白相互作用的模擬肽(Μ2、Μ2Ρ、Μ2Ε和ME；SEQIDNO:7、7、8和14)，其中磷酸化的殘基(M2P，-P)和酪氨酸替代為谷氨酸也被示出(M2E和ME)。[0028]圖3A-C.在MMVT-pyMT轉(zhuǎn)基因小鼠中，Mucl和β-聯(lián)蛋白以腫瘤特異性的方式發(fā)生相互作用。將MMVT-pyMT轉(zhuǎn)基因小鼠的正常乳腺和乳腺腫瘤均質(zhì)化，將蛋白裂解物進行免疫沉淀獲得β-聯(lián)蛋白和進行免疫印跡獲得Mucl(圖3Α)。圖3Β和3C顯示了這些組織中聯(lián)蛋白和Mucl的總水平。[0029]圖4.在侵入試驗中，與對照TAT肽相比，用MEBTAT處理MDA-MB-231細胞導(dǎo)致細胞侵入降低5倍。[0030]發(fā)明祥述[0031]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)致癌性MUCl和聯(lián)蛋白不但促進癌癥侵入，而且通過阻斷它們之間的相互作用(使用MUCl模擬肽[ΜΕΒ])，我們能夠抑制癌的侵入和轉(zhuǎn)移。[0032]本發(fā)明的融合蛋白可以使用任何蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。這些蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括以前已經(jīng)被鑒定并已應(yīng)用于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何結(jié)構(gòu)域。參見例如Dietz和Bahr,MolecularandCellularNeuroscience,27(2004)85-131中廣泛的表1。這樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)域中的一些在SEQIDN0:3、4、5和6中示出，但本發(fā)明并不局限于應(yīng)用這些轉(zhuǎn)導(dǎo)域。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)域有利于細胞攝取粘附肽。[0033]本發(fā)明的間隔子是用于融合蛋白的另外的氨基酸殘基，通常為了幫助合成或制造。它們可以基本上無毒，一般長度為0-5個氨基酸殘基。接頭可以是單一殘基或混合殘基。這些殘基可以是隨機的，或者是來自其它蛋白質(zhì)的序列，或者為了特定的理由而設(shè)計。[0034]盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MUCl的一些部分能促進癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，但令人驚奇的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它的某些長度的部分和組成實際上抑制侵襲和轉(zhuǎn)移。如前所示，MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域肽如SEQIDNO:14增加乳腺癌細胞的侵襲(Schroeder，2003)。令人驚奇的是，這些肽較短的部分實際上具有相反的作用。這些肽包括選自SEQIDNO:1中的6-15個連續(xù)的氨基酸殘基，并包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列。肽精確序列的微調(diào)(微小的偏差)可以用于優(yōu)化活性，例如通過替換肽的一個，兩個或者三個氨基酸殘基進行保守的改變或者用丙氨酸替換。保守改變是指相似的氨基酸殘基之間相互替換，如用不帶電荷的極性氨基酸替換不帶電荷的極性氨基酸，或者用非極性氨基酸替換非極性氨基酸，或者用酸性氨基酸替換酸性氨基酸。G或S殘基可以用G、S、T、C、Y、N和Q替換。L殘基可以用A、V、1、P、F、W和M替換?！?、￥和？殘基可以用么、￥、1^、1、？、？、1和1殘基替換。Y或N殘基可以用G、S、T、C、Y、N和Q殘基代替。E殘基可以用D殘基代替。殘基K可以用殘基R或者H代替。丙氨酸可以替代任何殘基，除非這種替代破壞侵襲和轉(zhuǎn)移抑制活性。這些被替代的肽可以利用實施例中提到的侵襲試驗容易地進行檢測。[0035]在體外或體內(nèi)，癌細胞可以與本發(fā)明的融合肽接觸，或供應(yīng)以本發(fā)明的融合肽。本發(fā)明的融合肽可以作為肽直接供給癌細胞，或者可以通過供給細胞以核酸載體而被內(nèi)源性產(chǎn)生，所述核酸載體在細胞內(nèi)表達和產(chǎn)生融合肽。對于體內(nèi)用藥，可以采用本領(lǐng)域已知的任何輸送技術(shù),包括但不局限于直接瘤內(nèi)注射、肌肉注射、血管內(nèi)注射、皮下注射和腹腔內(nèi)注射等。體外輸送可以例如簡單地通過在培養(yǎng)基中補充融合肽的方法完成。[0036]根據(jù)本發(fā)明，可以治療的癌和癌細胞包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、腎癌和肝癌。用藥后觀察到的效果是侵襲和轉(zhuǎn)移的降低的程度或延緩的速度。實施例闡述了用于測量這些過程的合適的分析方法。也可以利用本領(lǐng)域已知的其它分析方法。[0037]根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以設(shè)計和修改合成融合肽。這可以包括共價修飾如封閉法(加帽，capping)或者聚乙二醇化，或者與微膠束或脂質(zhì)體結(jié)合。這些修飾和設(shè)計可以增加體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而使得較高百分數(shù)量的輸入劑量到達目標癌癥。本發(fā)明的融合肽也可以結(jié)合其它治療措施使用。治療可采取同時用藥或連續(xù)用藥。治療癌癥的其它合適的治療方法包括化學(xué)治療藥劑給藥或輸注，抗腫瘤抗體、抗受體抗體，放射治療，放射性標記的藥物和手術(shù)。給患者使用兩種作用形式不同的治療手段可能增加療效。[0038]通過提供給癌細胞或癌癥患者各種抗體，可以獲得對MUCl與β-聯(lián)蛋白結(jié)合的相似的抑制效果。抗體可以是任何形式的抗體，單克隆抗體或者多克隆抗體，單鏈抗體或者多鏈抗體?？贵w可以在宿主乳腺，細胞培養(yǎng)物或者重組細胞中產(chǎn)生?？贵w結(jié)合到包含在SEQIDNO:1中的表位上。用SEQIDNO:1的肽作為免疫原，例如或者用本發(fā)明的融合肽作為免疫原，或者用其它融合肽作為免疫原，能夠產(chǎn)生抗體。[0039]用于傳遞編碼本發(fā)明的融合肽的核酸的載體可以是本領(lǐng)域中已知的任何載體。腺病毒載體和腺相關(guān)載體已為我們所熟知并且被廣泛應(yīng)用。另外也可以應(yīng)用非病毒載體如納米顆粒，脂質(zhì)體和膠束。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用于一些實施方式中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)自己的目的選擇合適的載體。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇載體和宿主細胞系統(tǒng)，用于在培養(yǎng)中重組制備本發(fā)明的融合蛋白。[0040]以上公開內(nèi)容概括性地描述了本發(fā)明。所有在此公開的參考文獻明確并入本文作為參考。通過參考下文的具體實施例，可以獲得更全面的理解，提供的這些實施例僅僅是示意性的目的，并不為了限制本發(fā)明的范圍。[0041]實施例1—方法[0042]肽的設(shè)計:我們設(shè)計了MUCl胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的肽，它包含已經(jīng)公開的β-聯(lián)蛋白的結(jié)合位點(Li等，1998；Li等，2001a；Li等，2001b)。由于MUCl的酪氨酸被EGFR和c-src磷酸化，我們設(shè)計了酪氨酸殘基磷酸化的新生25-聚體肽，以及將確定MUCl與β-聯(lián)蛋白之間的相互作用對酪氨酸磷酸化的需求。而且，我們還設(shè)計了酪氨酸殘基突變?yōu)楣劝彼釟埢亩嚯?，以確定這是否會進一步抑制細胞侵入。這些肽都將由加利福尼亞州桑尼維爾(Sunnyvale,CA)的美國肽公司(AmericanPeptideCompany)合成。產(chǎn)生的肽的純度水平為85%(HPLC純化，質(zhì)譜檢測)，為了便于鑒定，C端進行了生物素化。[0043]妝的處理和停襲分析:將孔徑8μm的Transwellinsert(Corning公司)倒置并涂上90μI的I型膠原(鼠尾，BDScientific)膠混合物(2.2%碳酸氫二納，10XM199培養(yǎng)基)，凝固30分鐘。然后將Transwell孔倒放入含有20%胎牛血清的DMEM中再水合。肽用BioPORTER試劑(Sigma，St.LouisMO)溫育5分鐘以促進細胞的攝取，渦旋，然后放進不含血清的細胞培養(yǎng)液中(檢測如下濃度:10ng/ml，100ng/ml和ug/ml),并放在Tranwell的上室。然后將細胞溫育2，4，或者24小時。去除培養(yǎng)液，膠用4%的多聚甲醛固定30分鐘后轉(zhuǎn)移到PBS(pH7.4)中。然后或者用bizbenzamide染色膠原凝膠40分鐘，并對侵襲入膠內(nèi)的所有細胞進行計數(shù)；或者用于免疫熒光分析。將肽處理的細胞侵襲與PBS/bioporter處理的對照或者無關(guān)肽處理的細胞侵襲進行比較。[0044]免疫沉淀和western印跡:使肽脈沖后的細胞侵襲進入倒入4孔的微量培養(yǎng)皿中的膠原凝膠中。侵襲后，裂解細胞，降解膠原(用膠原酶處理)和進行BCA分析(Pierce)。采用之前所述的方法(Schroeder等，2003)對蛋白裂解物進行免疫沉淀，以檢測內(nèi)源MUCl和β_聯(lián)蛋白的共沉淀水平，肽和β_聯(lián)蛋白的共沉淀水平，E-鈣粘著蛋白和β-聯(lián)蛋白的共沉淀水平。簡單的說，裂解物或者通過SDS-PAGE分離并直接轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon)上，或者先進行免疫沉淀然后再通過SDS-PAGE分離。免疫印跡和免疫沉淀所用的抗體從以下來源獲得:抗-Mucl(SantaCruzBiochemical),抗-β-聯(lián)蛋白(Η-102,用于免疫沉淀；C-18,用于免疫印跡；二者均來自SantaCruzBiochemical)。[0045]免疫熒光:對正在侵襲通過膠原凝膠的細胞進行原位免疫熒光標記(在膠原凝膠中)。對于膠原凝膠上的免疫熒光，在室溫下，用含有0.5%TritonX-100的IOmMPipe(pH6.8)，50mMNaCl,300mM蔗糖和3mMMgCl2的對凝膠進行透化處理5分鐘。然后用含有3%BSA(Sigma)和0.05%Tween20的1:1的PBS:增強洗滌緩沖液(EnhancingWashBuffer)(Innovex)的溶液封閉凝膠。一抗4°C溫育過夜,在1:1的PBSEnhancingWashBuffer中洗滌凝膠6小時。二抗4°C溫育過夜，在室溫下再次洗滌6小時。然后將凝膠安放在載玻片上，蓋上蓋玻片，并用Zeiss激光掃描共焦顯微鏡分析。所用的抗體有:抗生物素(鏈親和素-Alexa594,1:500,MoleculatProbes),抗-MucK1:100,SantaCruz),抗紐蛋白(V9131,1:400,Sigma化學(xué)公司)，抗β-聯(lián)蛋白(Η-102,1:100,SantaCruzBiochemical),抗成束蛋白(FCNO1,1:50,Neomarkers)和抗-鬼筆環(huán)妝(phalloidin)_Alexa546(1:100,MoleculatProbes)。二抗可以是MolecularProbes的Alexa488或566。[0046]靶向肽組織:為了驗證肽穿過質(zhì)膜的能力，在合成過程中將肽連接倒FITC標簽。將肽與HIV蛋白TAT(反式激活的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域結(jié)合，這使得肽能夠以胞吞和能量非依賴性方式穿過細胞膜(Torchilin等，2001b)。肽的序列為:NH2-FITC-GGG-YARAAARQARA-MUCI肽-C00H。用我們的體外系統(tǒng)對肽進行檢驗，然后進行靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)注射。為了減少肽在全身輸送過程中降解，用修飾的PEG將肽綴合到小的膠束或脂質(zhì)體上(Torchilin等,2001a；Valero等，1999),或者對肽進行末端修飾如C-端酰胺化或N-端乙酰化。注意在以前的研究中，把TAT的PTD結(jié)構(gòu)域作為β-半乳糖苷酶的肽標簽，伴隨肽被轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠體內(nèi)大部分(如果不是全部的話)組織中，獲得全身體輸送(Schwarze等，1999)。[0047]實驗動物:為了獲得我們的研究所需的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)的動物數(shù)量，我們每組處理采用20只動物，其包括野生型，轉(zhuǎn)基因動物的三個優(yōu)化劑量處理組。我們建立了額外的研究組，分別在6周齡，8周齡和10周齡時開始治療，以對處于早期、中期和晚期腫瘤的轉(zhuǎn)基因動物模型進行治療。結(jié)果使用了180只轉(zhuǎn)基因動物和80只野生型動物。我們分析了腹腔內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射兩種方式，以確定哪一種產(chǎn)生最好的輸送結(jié)果。[0048]組織學(xué):實驗動物每周觸診三次以監(jiān)測腫瘤的生長情況。當腫瘤負荷達到體重的5%或動物生長到16周齡時(大約50%的動物已經(jīng)形成肺轉(zhuǎn)移瘤的時間點)，處死動物。取下乳腺，腫瘤和肺組織，并在Methacarn中固定或者制備蛋白裂解物進行分析。固定的肺在解剖顯微鏡下分析以確定轉(zhuǎn)移性損害。我們以前在MMTV-pyMT模型中分析了該方法，并與肺部的連續(xù)切片和蘇木精與曙紅染色鑒定轉(zhuǎn)移腫瘤的方法進行比較(數(shù)據(jù)沒有顯示)。我們發(fā)現(xiàn)，在鑒定該轉(zhuǎn)基因模型的肺轉(zhuǎn)移腫瘤中，兩種方法之間有100%的一致性。[0049]免疫熒光:根據(jù)前述的方法(SchiOeder等，2001)分析了組織切片。用于組織免疫突光的抗體有:抗-Mucl(SantaCruzBiochemical)和抗β-聯(lián)蛋白(H-102,1:500，SantaCruzBiochemical和A11010_Alexa546,1:500,MolecularProbes)。對組織片段進行石臘包埋，切片和確定熒光標記的肽存在與否。[0050]免疫沉淀:采用前述的方法(Schroeder等,2003)制備蛋白裂解物。我們分析了不同的處理組，以確定肽的處理是否降低了β-聯(lián)蛋白和MUCl形成生化復(fù)合物的能力。[0051]統(tǒng)計分析:我們利用了亞利桑那州癌癥中心的生物統(tǒng)計學(xué)核心(ArizonaCancerCenter’sBiometryCore)來確定產(chǎn)生顯著性統(tǒng)計結(jié)果所需要的動物數(shù)量。[0052]實施例2—MUCl的表達對乳腺癌侵襲的作用[0053]為了探討MUCl的表達對乳腺癌侵襲的功能意義，我們用MUCl模擬肽溫育侵襲性乳腺癌細胞系，所述MUCl模擬肽針對β-聯(lián)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域而設(shè)計。然后監(jiān)測肽處理對侵入通過濾膜并進入膠原凝膠中的影響。[0054]在MDA-MB-468細胞中，我們用這些β_聯(lián)蛋白結(jié)合位點(M2)肽進行初步試驗。用MUCl/β-聯(lián)蛋白(M2)肽處理導(dǎo)致這些細胞侵入膠原凝膠的能力被抑制大約8倍(圖1)。4小時后我們發(fā)現(xiàn)只有不到15個M2肽處理的細胞侵入膠原凝膠中，與之相比，在PBS對照中大約125個細胞侵入膠原凝膠中。用非特異性肽(M3)處理得到與PBS處理的對照相似的結(jié)果。[0055]通過這些初步試驗,對MUCl結(jié)合域的分析,使得我們能夠創(chuàng)建蛋白質(zhì)相互作用的模型。為了MUCl有效地結(jié)合到β_聯(lián)蛋白并促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化和侵襲，它必須首先同c-crc,PLCδ和EGFR激酶相互作用(結(jié)合域見圖2)(Li等，2001b)。M2肽含有MUCl的β-聯(lián)蛋白的結(jié)合位點，但是不含有用于同前面所述的任何激酶相互作用的位點。假如M2肽能夠與內(nèi)源β-聯(lián)蛋白相互作用，它就能潛在地阻止內(nèi)源MUCl與β-聯(lián)蛋白發(fā)生相互作用。因此，肽M2可能作為一個顯性的負蛋白發(fā)揮功能，其與β_聯(lián)蛋白結(jié)合，但這阻止了它與完整的MUCl以侵襲-促進模式進行相互作用。我們還產(chǎn)生了一些新生的和磷酸化的肽，試圖優(yōu)化這種侵襲抑制(圖2)。我們的設(shè)計策略集中在使Mucl和β-聯(lián)蛋白之間的相互作用域最小化，同時調(diào)整酪氨酸激酶殘基，試圖確定酪氨酸磷酸化在蛋白結(jié)合過程中的功能意義。[0056]實施例3—小鼠模型中的MUCl和β-聯(lián)蛋白的相互作用[0057]在轉(zhuǎn)移乳腺癌自發(fā)模型中MUCl和β-聯(lián)蛋白發(fā)生相互作用。盡管很多模型已經(jīng)顯示Mucl和β-聯(lián)蛋白的相互作用是腫瘤特異性的(MMTV-Wnt-1，MMTV-MUCI和乳腺癌細胞系)，但由于各種原因(包括與人類疾病的相關(guān)性，腫瘤的發(fā)生和潛伏)，它們不是最好的臨床前模型。因此我們找到了另外的老鼠模型，其可能作為測試我們的肽治療的合適的模型。乳腺癌模型MMTV-pyMT(鼠乳腺癌病毒啟動子驅(qū)動的多瘤MiddleT抗原)是一個轉(zhuǎn)基因小鼠，它形成乳腺癌，并且在超過70%的所分析的動物中轉(zhuǎn)移成肺癌(Guy等，1992a)。這是一個很好的研究乳腺癌進展的模型，因為它是a)轉(zhuǎn)移的，b)由pyMT癌基因驅(qū)動的，該癌基因與大量的包括MUCl在內(nèi)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，c)在12-15周齡時形成腫瘤，這使得它成為一個藥物實驗的好模型，d)在組織學(xué)上是一個高變和漸進性疾病(Maglione等，2001)。我們考察了該模型中MUCl和β-聯(lián)蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們以腫瘤特異性的方式相互作用(圖3)。盡管Mucl和β_聯(lián)蛋白在正常的乳腺和乳腺腫瘤中都被表達(圖3，下面的兩個圖)，但是在正常的乳腺中通過免疫沉淀觀察不到這兩個蛋白有顯著的生化相互作用。然而，在腫瘤中觀察到Mucl和β-聯(lián)蛋白之間顯著的相互作用(圖3，顯示的數(shù)據(jù)來源于不同小鼠的兩個腫瘤，我們在其它7個腫瘤中重復(fù)了該結(jié)果)。這些數(shù)據(jù)說明這兩個蛋白之間的相互作用是腫瘤特異性的，從而使之成為用于我們基于肽的治療的理想模型。我們打算將該轉(zhuǎn)基因鼠應(yīng)用于我們的抑制性MUCl模擬肽的臨床前實驗中。[0058]實施例4一TAT綴合的MUC1-模擬肽[0059]我們設(shè)計了TAT綴合的MUCl-模擬肽，因為它能夠抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468侵襲性乳腺癌細胞系的侵襲。設(shè)計的肽攜帶TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域，以便進入細胞。設(shè)計、產(chǎn)生和測試了下面這些肽:[0060]MTATl(TAT-SSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNP；SEQIDNO:12)這個肽代表MUCl胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，已知該結(jié)構(gòu)域能與包括β_聯(lián)蛋白在內(nèi)的多種肽發(fā)生相互作用。該肽用作陽性對照。[0061]TAT這是TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域，它能夠促進細胞攝取綴合的肽。該肽用作陰性對照。[0062]MBTAT(TAT-SAGNGGSSLS；SEQIDN0:9)該肽代表β-聯(lián)蛋白/MUCl相互作用位點，還有4個額外的殘基包圍著該最小相互作用位點。[0063]MByTAT(TAT-GGSSLS:SEQIDNO:2)該肽代表已經(jīng)報道的最小β_聯(lián)蛋白/MUCl相互作用位點。[0064]MEBTAT(TAT-PYEKVSAGNGGSSLS;SEQIDNO:1)該肽為含有額外的EGFR相互作用位點的MBTAT肽。[0065]在我們的分析中，MTATl增加18倍的侵襲能力，而MBTAT則抑制侵襲能力8倍。這些數(shù)據(jù)表明全長的MUCl模擬肽能夠促進細胞侵襲，在本質(zhì)上模擬了內(nèi)源MUCl的作用。相反，較短的MBTAT肽可能通過抑制內(nèi)源MUCl和β-聯(lián)蛋白相互作用的能力阻斷侵襲。MEBTAT阻斷MDA-MB-231乳腺癌細胞侵襲的達6倍，我們正在探討這是否是由于阻斷了MUCl和β-聯(lián)蛋白之間，MUCl和EGFR之間或者MUCl與β-聯(lián)蛋白和EGFR之間的相互作用的緣故。因為以前的公開資料表明MUCl和β_聯(lián)蛋白之間的這種相互作用在乳腺癌的擴散中是重要的，我們提出利用肽MBTAT和METAT對動物進行治療。[0066]我們利用MBTAT和MEBTAT(熒光標記)來處理轉(zhuǎn)基因小鼠。使用MMTV-pyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。[0067]實施例5[0068]用肽處理MDA-MB-231細胞顯示出β-聯(lián)蛋白的不同定位。TAT對照肽處理導(dǎo)致分散的定位。MEBTAT肽處理導(dǎo)致β_聯(lián)蛋白定位于病灶性粘附和偽足處。[0069]實施例6-嚴重聯(lián)合免疫缺陷(scid)異種移植模型試驗[0070]試驗1.將MDA-MB-231細胞系(在基質(zhì)膠中)注射到24只鼠的乳腺脂肪墊中。然后將這些鼠分成3組，每天注射一次MWF，注射兩周。[0071]組IA用10μg/g體重的肽MEBTAT處理[0072]組IB用20μg/g體重的肽MEBTAT處理[0073]組IC用20μg/g體重的肽TAT處理[0074]在兩周末，在組IA中1/7的動物中出現(xiàn)了27%的腫瘤消退，組IB中1/7的動物中出現(xiàn)了7%的腫瘤消退，而組IC中沒有動物(0/7)出現(xiàn)腫瘤消退。分析了所有的處理組的腫瘤體積，結(jié)果顯示=MEBTAT處理的鼠同TAT處理的鼠比較，前者的腫瘤體積減少20%。[0075]最后一次用藥3天后把所有的腫瘤手術(shù)切除，再觀察老鼠10天。所有3個組的腫瘤都重新生長，并且生長速率沒有顯著差異。通過監(jiān)測動物隨時間推移的存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個組的存活率存在顯著差異。存活分析發(fā)現(xiàn)，IA組小鼠100%的存活時間為38天，IB組小鼠100%的存活時間為43天，然而IC組小鼠100%的存活時間只有32天。這與注射了20μg/g體重的肽MEBTAT的動物100%的總體存活時間要比注射TAT的動物增加25%相一致。重要的是,在任何動物中都沒有肽處理的可檢測到毒性。[0076]試驗I1:將MDA-MB-231細胞系(在基質(zhì)膠中)注射到16只小鼠的乳腺脂肪墊中。然后將這些小鼠分成兩組，每天注射一次MTWThF，注射兩周。[0077]組IIA用20μg/g體重的肽MEBTAT(靜脈內(nèi))處理[0078]組IIB用20μg/g體重的肽TAT(靜脈內(nèi))處理[0079]在兩周末，觀察到在組IIA中3/8的小鼠出現(xiàn)了腫瘤消退(腫瘤體積分別減少7%，9%和21%)，組IIB中的小鼠沒有出現(xiàn)腫瘤消退(0/8)。處死所有的動物并分析腫瘤轉(zhuǎn)移。組IIA動物的不同組織可見的轉(zhuǎn)移分別為:肺0/8，隔膜4/8，肝1/8。組IIB動物的不同組織可見的轉(zhuǎn)移分別為:肺0/8，隔膜4/8，肝3/8。(注意:在該實驗中，由于處死時間過早，沒有期望出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移)。沒有發(fā)現(xiàn)處理對動物的可見毒害。這些數(shù)據(jù)說明肽MEBTAT處理可導(dǎo)致腫瘤生長減慢和腫瘤遠距離轉(zhuǎn)移減少。[0080]這些數(shù)據(jù)表明肽MEBTAT對乳腺癌具有抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的作用，更重要的是它沒有毒性。[0081]實施例7—丙氨酸掃描突變體(alanine-scanningmutant)的侵襲分析[0082]用丙氨酸替換MEB序列[PYEKVSAGNGGSSLS；SEQIDNO:1]的氨基酸，一次替換一個氨基酸。(注意由于母鏈中已有一個丙氨酸，所以只有14個氨基酸突變體)。也要注意該實驗做了一次，每個數(shù)據(jù)點有4個重復(fù)。[0083]采用96孔板形式進行了新的分析。盡管對侵襲的抑制沒有在24孔板形式中觀察的那樣顯著，但我們?nèi)匀挥^察到用MEBTAT處理對侵襲的抑制比用TAT或者PBS處理高3倍。改變#9氨基酸(N)或者#14氨基酸(L)對MEBTAT抑制侵襲的能力沒有明顯的影響。而改變?nèi)魏问Ｏ碌陌被嵬耆怂鲇绊?，這說明了TYEKV(EGFR/src結(jié)合位點)和SAGNGGSSLS(β-聯(lián)蛋白結(jié)合位點)具有關(guān)鍵的作用。連接MEB和TAT的P(在殘基#1上)也是重要的。脯氨酸可能為該肽到達MUCl結(jié)合位點提供了重要的入口。[0084]用MEBTAT(M)，TAT(T)，PBS(P)，或者MEBTAT的丙氨酸掃描突變體處理MDA-MB-231細胞I小時。細胞用鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein-AM)處理并使其侵襲穿過8μm的Transwell進入I型膠原凝膠中18小時。侵襲釆用分光光度計進行分析。[0085]參考文獻[0086]所有引用的參考文獻的公開內(nèi)容都明確并入本文。[0087]Alpaugh,M.L.，Tomlinson，J.S.，Kasraeian,S.，andBarsky,S.H.(2002).CooperativeroleofE-cadherinandsialyl-LewisX/A-deficientMUClinthepassivedisseminationoftumoremboliininflammatorybreastcarcinoma.0ncogene21，3631-3643.[0088]Andersen，J.F.，Ding，X.D.，Balfour，C.，Shokhireva，T.K.，Champagne，D.E.，Walker,F.A.，andMontfort，W.R.(2000).Kineticsandequilibriainligandbindingby[0089]nitrophorins1-4:evidenceforstabilizationofanitricoxide-ferrihemecomplexthroughaIigand—inducedconformationaltrap.Biochenmistry39，10118-10131.[0090]Bowie,J.U.，Reidhaar-Olson，J.F.，Lim，W.A.，andSauer,R.T.(1990).Decipheringthemessageinproteinsequences:tolcrancetoaminoacidsubstitutions.Science247，1306-1310.[0091]Brooks,H.，Lebleu，B.，andVives,E.(2005).Tatpeptide-mediatedcellulardelivery:backtobasics.AdvDrugDelivRev57，559-577.[0092]Dawson,D.W.，Volpert,0.V.，Pearce,S.F.，Schneider,A.J.，Silverstein,R.L，Henkin，J.，andBouck，N.P.(1999).ThreedistinctD-aminoacidsubstitutionsconferpotentantiangiogenicactivityonaninactivepeptidederivedfromathrombospondin-1typeIrepeat.MolPharmacol55，332—338.[0093]Dietz,G.P.，andBahr,M.(2004).Deliveryofbioaotivemoleculesintothecell:theTrojanhorseapproach.MolCellNeurosci27，85—131.[0094]Gottlieb,K.A.,andVillarreal,L.P.(2001).NaturalbiologyofpolyomavirusmiddleTantigen.MicrobiolMolBiolRev65，288—318；secondandthirdpages，tableofcontents.Guy,C.T.，Cardiff，R.D.，andMuller，W.J.(1992a).1nductionofmammarytumorsbyexpressionofpolyomavirusmiddleToncogene:atransgenicmousemodelformetastaticdisease.MolCellBiol12，954-961.[0095]Guy,C.T.，Webster,M.A.，Schaller,M.，Parsons,T.J.，Cardiff,R.D.，andMuller，W.J.(1992b).Expressionoftheneuprotooncogeneinthemammaryepitheliumoftransgenicmiceinducesmetastaticdisease.ProcNatlAcadSciUSA89，10578-10582.[0096]Ha,Ν.C.，Tonozuka，Τ.，Stamos，J.L.，Choi,H.J.，andWeis,W.1.(2004).Mechanismofphosphorylat1n-dependentbindingofAPCtobeta—cateninanditsroleinbeta-catenindegradat1n.MolCell15，511-521.[0097]He,T.C.,Sparks,A.B.，Rago，C.，Hermeking，H.，Zawel，L，daCosta,L.T.,Morin,P.J.，Vogelstein，B.,andKinzler，K.W.(1998).1dentificat1nofc_MYCastargetoftheAPCpathway.Science281，1509-1512.[0098]Hilkens，J.，Vos,H.L，Wesseling,J.，Boer,M.，Storm,J.，vanderValk，S.，Calafat，J.，andPatriarca，C.(1995).1sepisialin/MUClinvolvedinbreastcancerprogress1n?CancerLett90，27-33.[0099]Ho，A.,Schwarze,S.R.，Mermelstein，S.J.，Waksman,G.,andDowdy,S.F.(2001).Syntheticproteintransduct1ndomains!enhancedtransduct1npotentialinvitroandinviv0.CancerRes61，474-477.[0100]Hong，F(xiàn).D.,andClayman，G.L(2000).1solat1nofapeptidefortargeteddrugdeliveryintohumanheadandnecksolidrumors.CancerRes60，6551-6556.[0101]Huber,A.H.,Stewart,D.B.，Laurerts，D.V.,Nelson,W.J.,andWeis,W.1.(2001).Thecadherincytoplasmicdomainisunstructuredintheabsenceofbeta-catenin.Apossiblemechanismforregulatingcadherinturnover.JB1lChem276，12301-12309.[0102]Huber,A.H.，andWeis,W.1.(2001).Thestructureofthebeta-catenin/E-cadherincomplexandthemolecularbasisofdiverseligandrecognit1nbybeta-catenin.Cell105，391-402.[0103]Jimenez,B.，Volpert,0.V.，Crawford,S.E.，F(xiàn)ebbra1,M.，Silverstein,R.L，andBouck,N.(2000).Signalsleadingtoapoptosis-dependentinhi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