n-3多不飽和脂肪酸在治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【
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】，特別涉及一種n-3多不飽和脂肪酸在治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以本實(shí)驗(yàn)室酶法制得純度達(dá)到80%的triEPA和triDHA為材料，研究其對小鼠模型NAFLD的預(yù)防與改善作用，為n-3PUFA預(yù)防和治療NAFLD、為開發(fā)利用深海魚油資源提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，對以營養(yǎng)手段預(yù)防和治療NAFLD，減輕其危害具有重要意義?！緦＠f明】n-3多不飽和脂肪酸在治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應(yīng)用【
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】[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【
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】，特別涉及一種n-3多不飽和脂肪酸在治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]NAFLD是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。非酒精性脂肪肝疾患在形態(tài)學(xué)上可分為4類，即單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化。在西方國家NAFLD的發(fā)病率約占平均人口的10%，而在肥胖者中則高達(dá)50%。近代隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，肥胖與糖尿病等各種“富貴病”發(fā)病率的增加，非酒精性脂肪性肝病患病率也飛速提高，現(xiàn)在已經(jīng)成為危害人類健康的三大肝病之一。大量研究表明，NAFLD不僅導(dǎo)致肝臟相關(guān)疾病和死亡，而且與動脈粥樣硬化性心血管疾病的高發(fā)密切相關(guān)。目前尚無NAFLD的特效藥物，臨床上主要是根據(jù)具體的病情采用個(gè)體化治療，主要是基礎(chǔ)治療、保肝藥物治療、原位肝移植治療的三階梯療法。而近年來的研究表明，n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)有可能作為治療NAFLD有效手段。但以往研究使用的是普通魚油即二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)及其他不飽和脂肪酸的混合物，其純度低，而體內(nèi)和體外研究表明EPA和DHA的作用功效是不同的，不能明確究竟是何種n-3PUFA在改善NAFLD中發(fā)揮作用，因此有必要使用DHA和EPA單獨(dú)干預(yù)來研究其預(yù)防和改善NAFLD作用?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種n-3多不飽和脂肪酸在治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應(yīng)用。[0004]本發(fā)明以EPA三甘油三酯(triEPA)和DHA三甘油三酯(triDHA)為材料，研究其對非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型小鼠的預(yù)防與改善作用。取雄性小鼠(小鼠品系)40只，按體重隨機(jī)分為對照組、triEPA補(bǔ)充組、triDHA補(bǔ)充組、模型組，每組10只小鼠。除對照組喂正常飼料外，其余各組都喂以高脂飼料，triEPA和triDHA補(bǔ)充組每天以1000mg/kgbw(bodyweight體重)的triEPA和triDHA乳化液灌胃，對照組和模型組每日以等量的5%阿拉伯膠溶液灌胃，飼養(yǎng)8w后處死小鼠，收集血液和肝臟標(biāo)本。采用HE染色法觀察肝臟的病變情況并測定血清谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和肝臟TG、TC。高脂飼料誘導(dǎo)引起小鼠肝臟脂肪性變，triEPA和triDHA補(bǔ)充高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠8w后，顯著降低了小鼠的肝重系數(shù)、血清ALT和AST活性，降低了肝臟TG和TC水平，顯著降低肝臟的脂變程度。試驗(yàn)結(jié)果證明，triEPA和triDHA對小鼠NAFLD有積極的預(yù)防和改善作用。[0005]作為優(yōu)選，所述的n-3多不飽和脂肪酸為EPA三甘油三酯(triEPA)或DHA三甘油三酯(triDHA)。[0006]本發(fā)明以本實(shí)驗(yàn)室酶法制得純度達(dá)到80%的triEPA和triDHA為材料，研究其對小鼠模型NAFLD的預(yù)防與改善作用，為n-3PUFA預(yù)防和治療NAFLD、為開發(fā)利用深海魚油資源提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，對以營養(yǎng)手段預(yù)防和治療NAFLD，減輕其危害具有重要意義。【專利附圖】【附圖說明】[0007]圖1是n-3多不飽和脂肪酸對小鼠體重的影響圖；圖2是n-3多不飽和脂肪酸對小鼠飼料攝入量的影響圖；圖3是HE染色顯微鏡圖(400X)，其中a.對照組；b.triEPA補(bǔ)充組；c.triDHA補(bǔ)充組；d.模型組；圖4是n-3多不飽和脂肪酸對小鼠干重指數(shù)的影響圖，與模型組比較a:P<0.05,b:P<0.01；圖5是n-3多不飽和脂肪酸對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活力的影響圖，與模型組比較a:P<0.05，b:P<0.01；圖6是n-3多不飽和脂肪酸對小鼠血清TG和TC含量的影響圖，與模型組比較a:P<0.05，b:P<0.01；圖7是n-3多不飽和脂肪酸對小鼠肝臟TG和TC含量的影響圖，與模型組比較a:P<0.05，b:P<0.01ο【具體實(shí)施方式】[0008]下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。[0009]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。[0010]實(shí)施例:I材料與方法1.1材料飼料:基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)脂肪碳水化合物產(chǎn)熱比為25.2:11.9:62.9)由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。聞脂詞料(蛋白質(zhì)脂肪碳水化合物廣熱比為14.6:48.6:36.7)由基礎(chǔ)詞料摻入1%膽固醇，20%脂肪(C14:02%C16:033%C16:l2%C18:020%C18:l29%C18:212%C20:02%)，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院制得。[0011]n-3PUFA:triEPA和triDHA由本實(shí)驗(yàn)室通過酶法制備而成并以5%阿拉伯膠溶液制備為乳化液。具體過程可參看申請?zhí)?00810162265、名稱為“一種連續(xù)化酶促合成n-3PUFA甘油酯的方法”的發(fā)明專利。[0012]檢測試劑:梯度濃度脫水酒精；HE染色試液；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑(酶速率法)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶試劑(酶速率法)，甘油三酯(TG)檢測試劑(終點(diǎn)比色法)，總膽固醇(TC)檢測試劑(終點(diǎn)比色法)，以上4種生化試劑購自貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司。[0013]儀器設(shè)備:UNICOUV-2800紫外可見分光光度計(jì)，普通小鼠飼養(yǎng)籠及飲水器，Leica石蠟切片機(jī)RM2235，安亭低速離心機(jī)LXJ-1IB，貝克曼生化分析系統(tǒng)LX20，儀康光學(xué)顯微鏡TV-3100。[0014]實(shí)驗(yàn)動物:C57BL/6J雄性小鼠9-10w齡，體重在(25±2)g，SPF級，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(浙)2012-0176。[0015]1.2方法實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法:40只小鼠在飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)120h后，按體重隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為:正常對照組、triEPA補(bǔ)充組、triDHA補(bǔ)充組、高脂模型組，每個(gè)飼養(yǎng)籠5只小鼠，并編號。采用高脂飲食建立小鼠NAFLD模型。正常組喂基礎(chǔ)飼料，其他各組均喂高脂飼料。定期觀察并記錄小鼠日常狀況，每日定時(shí)稱量小鼠體重并分別灌胃0.5ml的5%阿拉伯膠溶液、triEPA(1000mg/kgd)、triDHA(1000mg/kgd)、5%阿拉伯膠溶液。[0016]樣品收集:飼養(yǎng)8w后的小鼠，禁食12h，稱量體重，采用眼球采血法采血，用帶有分離膠的采血管收集，采血后用頸椎脫白法處死，迅速解剖取出肝臟，肉眼觀察肝臟并記錄結(jié)果后，用生理鹽水清洗，用吸水紙吸干表面水分后稱重，放入10%的中性甲醛固定液中固定3d。[0017]指標(biāo)檢測:米集得的血液樣品在室溫下靜直Ih后，4000r/min，尚心5min，收集血清。采用SYNCHR0N生化分析系統(tǒng)檢測谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)酶活力、血清TG、TC水平。[0018]肝臟TG、TC含量檢測稱取約0.2g的肝臟組織以氯仿:甲醇(2:1)萃取的方法提取[1]，萃取得到的總脂用含50mg/L2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的氯仿定容于IOml容量瓶中。取上述萃取液0.5ml，采用Sidney等的方法測定肝臟TG含量[2]。取上述萃取液0.4ml，采用Ness等的方法測定肝臟膽固醇含量[3]。[0019]病理學(xué)檢查:(1)肉眼觀察新鮮肝臟，(2)肝臟HE染色:固定后的肝臟取一小片經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明化后制成蠟塊，切片后采用HE染色法染色，鏡檢并拍照，結(jié)果見圖3。[0020]統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)差表/Jnο[0021]2結(jié)果2.1體重和攝食量如圖1所示，在整個(gè)8w的實(shí)驗(yàn)期間，各組間小鼠體重間沒有顯著差異。在每周食量方面，如圖2所示，第Iw到第8w，各組小鼠的食量均有所上升，對照組增長最快，模型組增長最慢。模型組飼料攝入量明顯較其他各組低，而體重增長與其他各組無異。[0022]2.2病理學(xué)檢查肉眼觀察:對照組肝臟顏色呈鮮紅色，而模型組小鼠肝臟顏色呈黃褐色，明顯較對照組腫大，且表面帶有油膩感。triEPA補(bǔ)充組、triDHA補(bǔ)充組小鼠肝臟腫大程度則較模型組有較大減輕，顏色較紅。[0023]圖3是HE染色顯微鏡圖(400X)，其中a.對照組；b.triEPA補(bǔ)充組；c.triDHA補(bǔ)充組；d.模型組。HE染色:模型組的病變程度較為嚴(yán)重，肝臟內(nèi)細(xì)胞大小不一并且出現(xiàn)局部壞死，肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)被酒精和二甲苯溶解脫去后形成多數(shù)的空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，邊界與結(jié)構(gòu)不明顯，肝索結(jié)構(gòu)凌亂，肝血竇由于受肝胞漿內(nèi)大脂滴擠壓變窄而不明顯。與模型組比，triEPA補(bǔ)充組、triDHA補(bǔ)充組的肝臟病變程度較輕，肝索結(jié)構(gòu)基本正常呈放射狀，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少數(shù)空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝血竇較明顯，而對照組未出現(xiàn)異常現(xiàn)象。[0024]2.3n-3PUFA對小鼠肝重指數(shù)的影響如圖4所示，模型組小鼠肝重指數(shù)極顯著高于對照組小鼠UKQ.01)。與模型組相比，經(jīng)過8w，triEPA和triDHA補(bǔ)充后小鼠肝重指數(shù)顯著降低0°〈0.05)，triEPA補(bǔ)充組、triDHA補(bǔ)充組和對照組小鼠肝重指數(shù)無顯著差異。[0025]2.4n-3PUFA對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響模型組小鼠的ALT值和AST值極顯著高于對照組(/X0.01)，見圖5。與模型組小鼠相t匕，經(jīng)過8w，triEPA和triDHA補(bǔ)充后，triEPA和triDHA補(bǔ)充組小鼠ALT活性和AST活性顯著降低0°〈0.01)0°〈0.05)。[0026]2.5n-3多不飽和脂肪酸對小鼠血清TG、TC的影響如圖6所示，模型組血清TG和TC含量均顯著高于組0°〈0.01，IKQ.05)，而triEPA、triDHA補(bǔ)充組小鼠與模型組小鼠的血清TG和TC未出現(xiàn)顯著性差異。[0027]2.6n-3PUFA對小鼠肝脂含量的影響如圖7所示，模型組小鼠肝臟TG和TC含量均顯著高于triEPA補(bǔ)充組、triDHA補(bǔ)充組和對照組小鼠。與模型組小鼠相比，經(jīng)過8w，triEPA和triDHA補(bǔ)充顯著降低了小鼠肝臟TG和TC的含量O°〈0.05)，數(shù)據(jù)顯示triEPA和triDHA補(bǔ)充小鼠肝臟TG分別下降了38.4%和42.1%，TC含量分別下降了36.0%和40.8%。triEPA補(bǔ)充組和triDHA補(bǔ)充組肝臟TC和TG含量不存在顯著差異。[0028]3討論NAFLD已成為危害人類健康的三大肝病之一，目前尚無NAFLD特效藥物。目前，研究表明n-3PUFA對NAFLD有積極地改善作用，但這些研究往往采用的是n_3PUFA的游離型或者乙酯型，不同化學(xué)型式對在人體中吸收的情況也有明顯的差異。例如普通魚油或濃縮的魚油產(chǎn)品一般為乙酯型，而乙酯型的吸收率僅為21%，游離型的EPA和DHA雖然吸收率為95%，但容易氧化，很不穩(wěn)定，且由于對消化道有刺激作用，而甘油三酯型符合人體吸收的油脂形式，其人體吸收率明顯高于乙酯型魚油，吸收可以達(dá)到60%左右，性質(zhì)相對穩(wěn)定。研究結(jié)果表明空白組和模型組的血液ALT、AST，肝臟TG、TC指標(biāo)均存在顯著性差異，并且模型組肝臟HE染色結(jié)果明顯呈現(xiàn)病態(tài)，說明小鼠非酒精性脂肪肝的建模是成功的。[0029]3.1n-3PUFA與脂質(zhì)代謝n-3PUFA能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)、促進(jìn)脂肪分解及抑制脂肪生成。一方面，n-3PUFA對細(xì)胞膜脂有極強(qiáng)的親和性，在與細(xì)胞膜結(jié)合后，改變細(xì)胞膜組成；在一定程度上，n-3PUFA上調(diào)一些與促進(jìn)脂解相關(guān)的信號蛋白，如腫瘤壞死因子-α和淀粉樣蛋白Α，提高腎上腺素和去甲腎上腺素等脂解激素的含量，促進(jìn)脂肪動員，減少肝臟脂肪的堆積，有利于β氧化或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。另一方面n-3PUFA調(diào)節(jié)SREBP-1、NF-Y等生脂基因轉(zhuǎn)錄因子，抑制肝臟脂肪的合成。此外n-3PUFA可以抑制極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)的合成及結(jié)合受體的活性，而增加高密度脂蛋白(HDL)的水平及結(jié)合受體的活性，進(jìn)而加速膽固醇被運(yùn)入肝臟被代謝清除。本研究顯示，給予triEPA和triDHA的小鼠的肝臟脂質(zhì)含量均較模型組顯著降低，因此triEPA和triDHA減少肝臟脂質(zhì)的堆積，從而減輕后續(xù)的氧化應(yīng)激等生理反應(yīng)，抑制非酒精性脂肪肝病情的發(fā)展。[0030]3.2血清轉(zhuǎn)氨酶與肝細(xì)胞損傷血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST是肝細(xì)胞損傷時(shí)最敏感的指標(biāo)，AST大部分存在于肝細(xì)胞的線粒體中，而ALT則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，只有在肝細(xì)胞受到損傷時(shí)才大量會被釋放到血液中。本研究中，triEPA補(bǔ)充組和triDHA補(bǔ)充組小鼠血清ALT和AST值均比模型組有顯著下降，與HE染色所得結(jié)果一致，說明triEPA和triDHA能有效降低肝臟細(xì)胞內(nèi)脂肪過度堆積所引起的細(xì)胞損害。[0031]3.3EPA和DHA作用效果比較triEPA和triDHA補(bǔ)充后，兩組小鼠之間ALT、AST、TG、TC和TG、TC含量和病理學(xué)檢查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有顯著差異，有可能兩者對非酒精性脂肪肝能起到相似的改善作用，因此對非酒精性脂肪肝的干預(yù)可以采用DHA和EPA的混合物來進(jìn)行。[0032]綜上，高脂飼料誘導(dǎo)引起小鼠肝臟脂肪性變，其肝重系數(shù)、TG和TC顯著增加，肝臟組織病理學(xué)檢查呈現(xiàn)病態(tài)。而以triEPA和triDHA補(bǔ)充高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠8w后，顯著降低了小鼠的肝重系數(shù)、ALT和AST活性，降低了肝臟TG、TC水平，肝臟的脂變程度顯著降低，這些研究結(jié)果表明triEPA和triDHA對小鼠非酒精性脂肪肝有積極的預(yù)防和改善作用。[0033]以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。[0034]參考文獻(xiàn):[1]FlochJjLeesMjSloaneStanleyGH.AsimplemethodfortheisolationandPurificationoftotallipidsformanimaltissues[J].JBiolChem，1957:497-509.[2]GottfriedSPjRosenbergB.1mprovedmanualspectrophotometrieprocedurefordeterminationofserumtriglycerides[J].ClinChem，1973，19:1077-1078.[3]NessAT，PastewkaJVjPeacockAC.EvaluationofaRecentlyReportedStableLiebermaml-BurehardReagentandItsUsefortheDirectDeterminationofSerumTotalCholesterol[J].ClinChimActa,1964，10:229-237.【權(quán)利要求】1.n-3多不飽和脂肪酸在治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的n-3多不飽和脂肪酸為EPA三甘油三酯(triEPA)或DHA三甘油三酯(triDHA)?！疚臋n編號】A61K31/232GK103989666SQ201410143696【公開日】2014年8月20日申請日期:2014年4月11日優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日【發(fā)明者】陳小娥,方旭波,袁高峰,董堅(jiān)申請人:浙江海洋學(xué)院