經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用，其特征是：該經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療和制備肝纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的M1型巨噬細(xì)胞本身高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）分子，回輸后募集自體巨噬細(xì)胞進(jìn)入肝臟并分泌大量MMPs，二者協(xié)同作用，加速膠原纖維的降解，減輕肝纖維化。M1型巨噬細(xì)胞對(duì)肝纖維化有較好的治療作用，為臨床治療肝纖維化-肝硬化提供了新的有效方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于肝纖維化治療領(lǐng)域，涉及巨噬細(xì)胞極化、細(xì)胞治療領(lǐng)域。具體涉及一種經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝纖維化由各種持續(xù)的慢性肝損傷導(dǎo)致，其漸進(jìn)性發(fā)展最終可形成肝硬化，甚至誘發(fā)肝癌，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。針對(duì)晚期肝硬化的有效治療手段十分有限，但有效的治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化，甚至恢復(fù)肝臟正常的結(jié)構(gòu)和功能。因此，探索有效的肝纖維化治療方法具有重要的意義。針對(duì)肝纖維化的細(xì)胞治療具有重要的臨床應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者研究細(xì)胞移植對(duì)肝纖維化的治療作用，所采用的細(xì)胞多為骨髓細(xì)胞、造血系統(tǒng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。自體細(xì)胞移植具有無(wú)免疫排斥、獲取方便和來(lái)源充足等優(yōu)點(diǎn)，已成為最具前景的肝纖維化治療方法之一。研究表明在肝損傷后骨髓來(lái)源的干細(xì)胞能募集到肝臟，分化成為肝細(xì)胞等，對(duì)肝纖維化-肝硬化有一定的治療作用。采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行自體回輸，能夠有效緩解病人肝硬化癥狀，延長(zhǎng)生存時(shí)間，具有較好的治療效果。然而骨髓細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞，其中的哪些細(xì)胞成分對(duì)肝纖維化起到治療效果存在爭(zhēng)議。James等利用單一細(xì)胞成分——巨噬細(xì)胞治療肝纖維化，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞治療明顯降低小鼠肝纖維化水平，改善小鼠的肝臟功能，為肝纖維化的治療提供了新的思路。
[0003]巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞。在肝纖維化的發(fā)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮著雙刃劍的作用。一方面，活化的巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致肝星形細(xì)胞激活并合成分泌大量膠原纖維；另一方面，巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)(MMPs)，降解膠原纖維，誘發(fā)肝星形細(xì)胞凋亡，使肝纖維化消融緩解。提示纖維化過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的功能復(fù)雜多樣，具有一定的異質(zhì)性。大量研究表明，活化的巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典激活的Ml型巨噬細(xì)胞和選擇性激活的M2型巨噬細(xì)胞。二者對(duì)肝纖維化的作用不同，分別具有抗纖維化和促進(jìn)纖維化的作用。
[0004]鑒于巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和不同極化類(lèi)型的巨噬細(xì)胞對(duì)肝纖維化的不同作用，體外極化誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞有望成為對(duì)肝纖維化具有更好療效的細(xì)胞類(lèi)型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用，為臨床治療肝纖維化-肝硬化提供了新的有效方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用，其特征是:該經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療和制備肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0007]所述的經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞是由細(xì)胞因子LPS和IFN-Y聯(lián)合刺激誘導(dǎo)而成。
[0008]所述的經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞即:M1型巨噬細(xì)胞，是由100 ng/mL LPS和20 ng/mLIFN-y誘導(dǎo)24小時(shí)得到。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:M1型巨噬細(xì)胞本身高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)分子，回輸后募集自體巨噬細(xì)胞進(jìn)入肝臟并分泌大量MMPs，二者協(xié)同作用，加速膠原纖維的降解，減輕肝纖維化。Ml型巨噬細(xì)胞對(duì)肝纖維化有較好的治療作用，為臨床治療肝纖維化-肝硬化提供了新的有效方法。
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例及實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1 A是光鏡下分化成熟的巨噬細(xì)胞的形態(tài)觀察(左10X，右20X)；
圖1 B是FACS檢測(cè)培養(yǎng)第7天的細(xì)胞；
圖2是實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化；
圖3A(a)是天狼星紅染色(10X )，圖3A(b)膠原沉積面積統(tǒng)計(jì)；
圖3B是肝臟組織中Hyp含量的統(tǒng)計(jì)；
圖3C(a)是a -SMA的免疫組化染色(40X )，圖3 C(b)是其統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
圖3D是回輸4周后小鼠血清白蛋白(Alb)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
圖4A是不同極化類(lèi)型巨噬細(xì)胞MMPs分子mRNA表達(dá)水平；其中，a為MMP-2，b為MMP-9，c 為 MMP-13 ；
圖4B是不同極化類(lèi)型巨噬細(xì)胞中趨化因子mRNA的表達(dá)水平；
圖4C是肝臟組織切片F(xiàn)4/80染色(40 X )及細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中，圖4C(a)是肝臟組織切片F(xiàn)4/80染色(40 X )，4C (b)是細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
圖4D是回輸Id后小鼠肝臟組織MMPs的表達(dá)；其中，a為MMP-2，b為MMP-9，c為MMP-13 ；
圖4E是回輸后I周內(nèi)尿液中Hyp含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0012]1、小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及極化誘導(dǎo)
選取健康成年雄性C57/B6小鼠，完整取出股骨和脛骨。用I XPBS沖長(zhǎng)骨骨髓腔，獲得細(xì)胞，反復(fù)輕柔吹打，以紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。得到單細(xì)胞懸液，均勻種入IOcm皿中，用含10%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜(16h為宜)，以除去貼壁速度較快的基質(zhì)細(xì)胞如纖維細(xì)胞等。次日，收集未貼壁細(xì)胞，均勻種植于培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入GM-CSF，使其終濃度為40ng/ml，刺激骨髓細(xì)胞向單核巨噬細(xì)胞分化。于培養(yǎng)第4天半量換液，并補(bǔ)充GM-CSF。于培養(yǎng)7天后即可成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞。光鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)(如圖1A)，并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞(圖1B)。圖1為培養(yǎng)成熟的巨噬細(xì)胞光鏡表型和流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果。其中圖1A示細(xì)胞形態(tài)符合巨噬細(xì)胞表型，圖1B示培養(yǎng)第7天巨大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志。
[0013]細(xì)胞因子LPS聯(lián)合IFN-Y刺激巨噬細(xì)胞向Ml型極化，而IL_4刺激巨噬細(xì)胞向M2型極化。骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，直接向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入LPS和IFN-Y使終濃度分別為100 ng/mL和20 ng/mL ;或者加入IL-4使終濃度為20 ng/mL，進(jìn)行極化誘導(dǎo)刺激24 h，即可得到Ml或M2型巨噬細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩類(lèi)細(xì)胞中極化相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)以鑒定所得細(xì)胞，結(jié)果如圖2。圖2為不同極化類(lèi)型的巨噬細(xì)胞表型的鑒定，如圖示，經(jīng)LPS+IFN- Y刺激后的巨噬細(xì)胞iNOS、IL-12、TNF- a mRNA水平明顯升高，而Arg_l、Yml和MR分子表達(dá)水平降低，符合Ml型巨噬細(xì)胞特征(即本發(fā)明的經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞)。
[0014]2、肝纖維化小鼠模型
選擇8周齡的健康雄性C57/B6小鼠進(jìn)行造模。從小鼠的左下腹部進(jìn)針，腹腔內(nèi)注射100 UL四氯化碳溶液(含15 yLCCljP85 μ L橄欖油，并充分混勻)，對(duì)照組小鼠每只注射IOOyL橄欖油。注射后，用棉球按住針孔以防漏出，并輕柔按摩腹部片刻，使藥物均勻分布。每周腹腔注射2次，持續(xù)4周，細(xì)胞治療后繼續(xù)注射4周。
[0015]3、巨噬細(xì)胞回輸治療
將已經(jīng)極化誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞(MO、Ml、M2)和等量IXPBS從小鼠尾靜脈回輸。其中，各組細(xì)胞懸液濃度均為I X IO7個(gè)/mL PBS，每只小鼠給予100 μ L細(xì)胞懸液。于巨噬細(xì)胞回輸2d后，各組繼續(xù)給予腹腔CCl4注射4周。并于第16次給藥2d后，獲取小鼠組織、血液標(biāo)本進(jìn)行治療效果的評(píng)估。
[0016]效果評(píng)估內(nèi)容:
I)肝臟組織天狼星紅染色評(píng)估肝臟膠原沉積。圖3為Ml型巨噬細(xì)胞回輸后肝纖維化的水平評(píng)估。圖3Α為天狼星紅染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果，如圖3Α示Ml型巨噬細(xì)胞回輸組小鼠僅在肝小葉周邊出現(xiàn)較少的纖維膠原沉積，小葉內(nèi)很少有紅染的纖維組織出現(xiàn)，纖維化程度最輕。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果示Ml組膠原沉積面積最小。
[0017]2)肝臟組織羥脯氨酸(Hyp)測(cè)定評(píng)估肝臟膠原含量。圖3Β為小鼠肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量測(cè)定統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Ml回輸組小鼠肝臟中Hyp含量顯著低于其它3組。
[0018]3)肝臟組織α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(α -SM)免疫化學(xué)染色評(píng)估肝臟活化星形細(xì)胞數(shù)量。圖3C為a -SMA免疫組化及統(tǒng)計(jì)結(jié)果，如圖3C示Ml組活化的HSCs數(shù)量少于其它3組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，Ml型巨噬細(xì)胞回輸后，HSCs激活和增殖減少或者活化HSCs的凋亡增加，合成和分泌膠原纖維的細(xì)胞減少。
[0019]4)血清白蛋白測(cè)定評(píng)估肝功能。如圖3D示Ml組小鼠血清白蛋白水平高于PBS、MO、M2組。提示，Ml型巨噬細(xì)胞回輸后，不僅有纖維化的減輕，肝細(xì)胞的再生增加或者肝細(xì)胞的凋亡壞死減少，從而使的肝功能好轉(zhuǎn)。
【權(quán)利要求】
1.經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用，其特征是:該經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療和制備肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用，其特征是:所述的經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞是由細(xì)胞因子LPS和IFN-Y聯(lián)合刺激誘導(dǎo)而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞在治療肝纖維化的應(yīng)用，其特征是:所述的經(jīng)典激活的 巨噬細(xì)胞即:M1型巨噬細(xì)胞，是由100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-Y誘導(dǎo)24小時(shí)得到。
【文檔編號(hào)】A61K35/28GK103977029SQ201410144390
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】秦鴻雁, 馬鵬飛, 竇科峰, 韓驊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)