一種具有不同剛度三維骨組織工程支架材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有不同剛度三維骨組織工程支架材料及其制備方法。首先將膠原與羥基磷灰石進(jìn)行不同比例的混合，形成不同濃度梯度的膠原/羥基磷灰石混合乳液，再將制作好的脫細(xì)胞化骨浸入不同濃度的混合液中，灌流，輕輕振蕩，在支架表面形成均勻的膠原/羥基磷灰石涂層，最后經(jīng)過冷凍干燥和交聯(lián)處理得到具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料。該發(fā)明可在不改變?nèi)S支架微結(jié)構(gòu)的情況下在支架表面形成不同剛度的基質(zhì)，支架材料具有良好的生物相容性，利于不同干細(xì)胞的增殖與分化，而且原料成本較低，易于制作。
【專利說明】一種具有不同剛度三維骨組織工程支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種骨組織工程支架材料及其制備方法，特別是一種具有不同剛度的脫細(xì)胞化骨-膠原/羥基磷灰石三維支架材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】[0002]為了獲得具有良好組織性、功能性的組織，組織工程支架材料應(yīng)該盡可能的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)特征。成功的支架材料應(yīng)該可以模擬體內(nèi)自然的力學(xué)特征并經(jīng)得起體內(nèi)的應(yīng)力環(huán)境。支架材料的力學(xué)特征對影響細(xì)胞行為以及控制外部力學(xué)信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)具有重要的作用。細(xì)胞可以感知并對它們所接觸到的基底做出響應(yīng)，不同的基質(zhì)剛度在二維條件下可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分別分化成為不同的細(xì)胞類型，包括神經(jīng)細(xì)胞、肌原細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞等(Engler AJ, Sen S，Sweeney HL, Discher DE.Matrix elasticitydirects stem cell lineage specification.Cell.2006; 126:677-689.)。三維培養(yǎng)可以更好的模擬細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)微環(huán)境，但目前有關(guān)基質(zhì)剛度對干細(xì)胞分化的研究主要集中在二維條件下。有文獻(xiàn)報(bào)道利用膠原(Hadjipanayi E, Mudera V, Brown RA.Brown.Guidingcell migration in3D:a collagen matrix with graded directional stiffness.Cell Motil Cytoskeleton.2009; 66:121-128.)、聚乳酸(poly-lactic acid, PLLA) / 聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic co glycolic acid, PLGA) (Levy-Mishali M, ZoldanJ,Levenberg S.Effect of scaffold stiffness on myoblast differentiation.TissueEng Part A.2009; 15:935-944.)等來研究具有不同剛度的支架材料對干細(xì)胞分化的影響。在骨組織工程支架材料領(lǐng)域，已有文獻(xiàn)報(bào)道利用水凝膠形成合適剛度的準(zhǔn)三維支架，可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞朝成骨方向分化(Naito H, Dohi Y, Zimmermann WH, Tojo T, TakasawaS，Eschenhagen T,Taniguchi S.The effect of mesenchymal stem cell osteoblasticdifferentiation on the mechanical properties of engineered bone-like tissue.Tissue Eng Part A.2011; 17:2321-2329.);利用聚醚氨酯(polyether urethanes)形成的具有不同剛度和幾何形狀的準(zhǔn)三維支架可以影響MC3T3-E1細(xì)胞的組織形成面積(Kommareddy KP, Lange C，Rumpler M, Dunlop Jff, Manjubala I, Cui J, Kratz K, LendleinA, Fratzl P.Two stages in three-dimensional in vitro growth of tissue generatedby osteoblastlike cells.Biointerphases.2010;5:45-52.)。Huebsch 等(HuebschN,Arany PR, Mao AS,Shvartsman D,Ali OA, Bencherif SA, Rivera-Feliciano J, MooneyDJ.Harnessing traction-mediated manipulation of cell/matrix interface tocontrol stem-cell fate.Nat Mater.2010; 9:518-26.)的研究表明，不同三維環(huán)境剛度可以改變間充質(zhì)干細(xì)胞的譜系分化，而間充質(zhì)干細(xì)胞在11~30kPa的三維剛度下可以分化為成骨細(xì)胞，尤其是在22kPa時往成骨方向分化效果最好。然而，目前還未見三維骨組織工程支架材料可在保持微結(jié)構(gòu)和孔隙率基本不變的同時形成不同剛度基質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在三維條件下構(gòu)建具有不同剛度的骨組織工程支架材料，目的是在不改變?nèi)S支架微結(jié)構(gòu)的情況下在支架表面形成不同剛度的基質(zhì)。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的具有不同剛度三維骨組織工程支架材料由脫細(xì)胞化骨和膠原/羥基磷灰石構(gòu)成；其特征在于，利用脫細(xì)胞化骨保持支架材料的三維微結(jié)構(gòu)，利用不同配比膠原/羥基磷灰石包被處理脫細(xì)胞化骨，形成具有不同基質(zhì)剛度的三維骨組織工程支架材料，以利于誘導(dǎo)干細(xì)胞的特定譜系分化。
[0005]本發(fā)明中，脫細(xì)胞化骨可采用常規(guī)的方法制備，簡而言之為，取新鮮豬股骨頭的松質(zhì)骨，用4°C的0.9%鹽水浸泡送至清潔條件下，清除樣品上的殘余肌肉和組織，根據(jù)臨床骨缺損情況制成直徑為2~20mm、高為2~20mm的圓柱體或者長X寬X高為2~20mmX 2~20mmX2~20mm的立方體等形狀樣品,沖洗,然后浸泡在蒸懼水中4°C過夜。用1%的TritonX-100處理樣品48h。用甲醇對樣品進(jìn)行脫脂24h。DNA酶/RNA酶37°C溫育樣品2h后，用PBS清洗并持續(xù)晃動。將支架浸入無水乙醇中4h，以除去支架上的細(xì)胞殘余物。用大量的去離子水清洗支架2h，干燥支架，獲得脫細(xì)胞化骨，保存在4°C環(huán)境下。
[0006]脫細(xì)胞化骨具有三維微孔結(jié)構(gòu)，孔直徑可控制在300~800 μ m,孔隙率可以達(dá)到80%~95%，并具有良好的聯(lián)通性。將不同濃度配比的膠原和羥基磷灰石混合物通過灌流的方式對上述脫細(xì)胞化骨內(nèi)部進(jìn)行處理，得到具有不同梯度剛度的三維骨組織工程支架材料。
[0007]本發(fā)明還提供所述的具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料的制備方法，具體步驟如下:
[0008]I)制備脫細(xì)胞骨三維支架；
[0009]2)配制不同濃度比例的膠原/羥基磷灰石溶液，將步驟I)得到的支架材料浸入所配制溶液中進(jìn)行灌流，輕輕振蕩，保證溶液在材料表面形成均勻的涂層；
[0010]3)冷凍、干燥步驟2)得到的經(jīng)不同配比膠原/羥基磷灰石包被處理的脫細(xì)胞骨三維支架；
[0011]4)將步驟3)得到的經(jīng)不同配比膠原/羥基磷灰石包被處理的脫細(xì)胞骨三維支架通過 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亞氨(N-(3_dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)和 N-羥基丁二酸亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)進(jìn)行交聯(lián)后，通過0.lmol/L Na2HPO4*12H20將其浸泡清洗lh，然后用去離子水對其清洗，之后將其冷凍干燥得到具有不同剛度三維骨組織工程支架材料；
[0012]5)將步驟4)得到的具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料通過6tlCo (2M rad)放射消毒后，將其無菌密封后干燥保存。
[0013]優(yōu)選地，步驟I)所述的脫細(xì)胞骨三維支架制備方法，是取新鮮豬股骨頭的松質(zhì)骨，用4°C的0.9%鹽水浸泡送至清潔條件下，清除樣品上的殘余肌肉和組織，根據(jù)臨床骨缺損情況制成所需形狀樣品，沖洗，然后浸泡在蒸餾水中4°C過夜。用1%的Triton X-100處理樣品48h。用甲醇對樣品進(jìn)行脫脂24h。DNA酶/RNA酶37°C溫育樣品2h后，用PBS清洗并持續(xù)晃動。將支架浸入無水乙醇中4h，以除去支架上的細(xì)胞殘余物。用大量的去離子水清洗支架2h，干燥支架，獲得脫細(xì)胞化骨，保存在4°C環(huán)境下。
[0014] 優(yōu)選地，步驟I)所述的脫細(xì)胞骨三維支架制備成直徑為2~20mm、高為2~20mm的圓柱體或者長X寬X高為2~20mmX2~20mmX2~20mm的立方體等形狀樣品。[0015]優(yōu)選地，步驟2)所述的膠原/羥基磷灰石溶液中羥基磷灰石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5wt%~70wt%,膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)所需要剛度在0.lwt%~2.0wt%間變化。
[0016]優(yōu)選地，步驟2)所述的膠原/羥基磷灰石溶液混合方法為:將上述計(jì)算好質(zhì)量分?jǐn)?shù)的羥基磷灰石粉末緩慢加入已經(jīng)完全溶解的計(jì)算好質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膠原溶液中，不斷攪拌，使膠原與羥基磷灰石粉末混合均勻。
[0017]綜上所述，本發(fā)明的具有不同剛度三維骨組織工程支架材料通過脫細(xì)胞骨支架保證材料的三維結(jié)構(gòu)不變，利用不同配比的膠原/羥基磷灰石在支架表面形成不同剛度三維支架材料。與現(xiàn)有的三維骨組織工程支架材料相比，本發(fā)明的三維骨組織工程支架材料克服了大多數(shù)骨組織工程支架材料在改變基質(zhì)剛度的同時也改變了微結(jié)構(gòu)的缺陷，這也是本發(fā)明提出的關(guān)鍵。本發(fā)明提供的三維骨組織工程支架材料具有良好的生物相容性，可保證骨支架的天然微結(jié)構(gòu)和成分，并具有良好的聯(lián)通性，有利于細(xì)胞的粘附與生長，利于營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入以及細(xì)胞代謝廢物的及時排出。利用膠原/羥基磷灰石形成的不同剛度，利于不同干細(xì)胞的增殖與分化，可以促進(jìn)新的骨的生成。用于制備三維骨組織工程支架材料的脫細(xì)胞骨可選擇不同動物不同部分的骨作為材料，只要滿足所要修復(fù)骨的要求即可。為簡潔期間，本發(fā)明主要以豬股骨頭的松質(zhì)骨為例加以闡述，其他動物和部分骨也可以采用相同的原理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1示出了分別由本發(fā)明提供的一種具有不同剛度三維骨組織工程支架材料制備方法中使用的不同濃度配比的膠原和羥基磷灰石所制備的支架的壓縮楊氏模量。
[0019]圖2是本發(fā)明提供的一種具有不同剛度三維骨組織工程支架材料制備方法中脫細(xì)胞化骨支架被0.7wt%膠原/22wt%羥基磷灰石混合溶液表襯前后的孔徑分布圖。
[0020]圖3是本發(fā)明提供的一種具有不同剛度三維骨組織工程支架材料制備方法中脫細(xì)胞化骨支架被0.7wt%膠原/22wt%羥基磷灰石混合溶液表襯前后的壁厚分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022]將取自新鮮豬股骨頭的松質(zhì)骨用4°C的0.9%鹽水浸泡送至清潔條件，清除樣品上的殘余肌肉和組織，根據(jù)臨床骨缺損情況制成直徑為2~20mm、高為2~20mm的圓柱體或者2~20mm X 2~20mm X 2~20mm的立方體等形狀樣品，沖洗，然后浸泡在蒸餾水中4°C過夜。用l%Triton X-100處理樣品48h。用甲醇對樣品進(jìn)行脫脂24h。DNA酶/RNA酶37°C溫育樣品2h后，用PBS對其清洗并持續(xù)晃動。將支架浸入無水乙醇中4h，來除去支架上的細(xì)胞殘余物。用大量的去離子水清洗支架2h，干燥支架，獲得脫細(xì)胞化骨，保存在4°C環(huán)境下。脫細(xì)胞化骨孔直徑可控制在300~800 μ m,孔隙率可控制在80%~95%。
[0023]將計(jì)算好質(zhì)量分?jǐn)?shù)的羥基磷灰石粉末緩慢加入已經(jīng)完全溶解的計(jì)算好質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膠原溶液中，不斷攪拌，使膠原與羥基磷灰石粉末混合均勻。膠原/羥基磷灰石溶液中羥基磷灰石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5wt%~70wt%，膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)所需要剛度在0.lwt%~
2.0wt%間變化。 例如膠原含量為0.5wt%,羥基磷灰石為22wt%的一組，先稱取膠原50mg，用IOmL0.01mol/L的HCl溶解完全溶解，然后稱取羥基磷灰石粉末2.2g,緩緩加入已經(jīng)溶解的膠原溶液中，4 0C下持續(xù)攪拌過夜使膠原溶液與羥基磷灰石混合均勻。
[0024]將不同濃度配比的膠原和羥基磷灰石混合物通過灌流的方式對上述三維脫細(xì)胞化骨內(nèi)部進(jìn)行處理，使膠原和羥基磷灰石混合物在支架表面均勻覆蓋。將包被處理好的支架材料首先在-20°C條件下冷凍24h，然后在-55°C、15Pa條件下進(jìn)行冷凍干燥24h。然后將冷凍干燥好的膠原/羥基磷灰石三維支架材料用溶解于無水乙醇的EDC和NHS進(jìn)行交聯(lián)24h，再用0.lmol/L的Na2HPO4.12H20溶液浸泡清洗支架lh，最后用去離子水清洗多次后，在-55°C、15Pa條件下進(jìn)行冷凍干燥24h，得到具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料，然后通過6tlCo (2M rad)放射消毒，之后將其無菌密封后干燥保存，備用。
[0025]為驗(yàn)證所使用方法的可行性，制備了膠原含量為分別為0.35wt%、0.5wt%和0.7wt%，羥基磷灰石為22wt%等的多組膠原/羥基磷灰石支架。下面將以膠原含量為分別為0.35wt%、0.5被％和0.7wt%,羥基磷灰石為22wt%的三組膠原/羥基磷灰石支架為例進(jìn)行說明，如圖1所示，利用美國Bose公司ELF3330力學(xué)測試儀器得到它們的平均壓縮楊氏模量為6.74±1.16kPa、8.82±2.12kPa和23.61 ±8.06kPa。實(shí)驗(yàn)測得脫細(xì)胞化骨支架在利用
0.7wt%膠原/22wt%羥基磷灰石混合溶液表襯前后孔徑、孔隙率、孔徑分布和壁厚分布均沒有顯著性差異。圖2和圖3分別為脫細(xì)胞化骨支架在0.7wt%膠原/22被％羥基磷灰石混合溶液表襯前后的孔徑和壁厚分布圖。
[0026]本發(fā)明提供的三維骨組織工程支架材料通過脫細(xì)胞骨實(shí)現(xiàn)天然骨微結(jié)構(gòu)和成分，利用不同配比膠原/羥基磷灰石包被處理脫細(xì)胞骨，在不改變支架微結(jié)構(gòu)的情況下形成不同剛度的三維多孔支架材料。正是由于這些綜合因素，使得本發(fā)明提供的三維骨組織工程支架材料良好的生物相容性，利于不同干細(xì)胞的增殖與分化，可以促進(jìn)新的骨的生成。制備方法簡單且成本低 ，相比以往的三維骨組織工程支架材料有明顯的優(yōu)勢。
【權(quán)利要求】
1.一種具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料，由脫細(xì)胞化骨和膠原/羥基磷灰石構(gòu)成，其特征在于:所述脫細(xì)胞化骨由豬股骨頭中孔直徑為300~800 μ m、孔隙率為80%~95%的松質(zhì)骨制成，該脫細(xì)胞化骨內(nèi)部通過不同濃度配比的膠原/羥基磷灰石溶液灌流處理，所述的膠原/羥基磷灰石溶液由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5wt%~70wt%的羥基磷灰石和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.lwt%~2.0wt%的膠原混合而成。
2.如權(quán)利要求1所述的一種具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料，其特征在于:所述脫細(xì)胞化骨可根據(jù)臨床骨缺損情況制成直徑為2~20mm、高為2~20mm的圓柱體或者長X寬X高為2~20mmX2~20mmX2~20mm的立方體。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料的方法，包括下述步驟: 1)制備脫細(xì)胞骨三維支架； 2)配制不同濃度比例的膠原/羥基磷灰石溶液，將步驟I)得到的支架材料浸入所配制溶液中進(jìn)行灌流，輕輕振蕩，保證溶液在材料表面形成均勻的涂層； 3)冷凍、干燥步驟2)得到的經(jīng)不同配比膠原/羥基磷灰石包被處理的脫細(xì)胞骨三維支架； 4)將步驟3)得到的經(jīng)不同配比膠原/羥基磷灰石包被處理的脫細(xì)胞骨三維支架通過1-乙基-3-3- 二甲基氨基丙基-碳化二亞氨和N-羥基丁二酰亞胺進(jìn)行交聯(lián)后，通過0.lmol/L Na2HPO4.12H20將其浸泡清洗lh，然后用去離子水對其清洗，之后將其冷凍干燥得到具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料； 5)將步驟4)得到的具有不同剛度的三維骨組織工程支架材料通過6tlCo放射消毒，將其無菌密封后干燥保存。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟2)所述的不同濃度比例的膠原/羥基磷灰石溶液配置方法為，將計(jì)算好質(zhì)量分?jǐn)?shù)的羥基磷灰石粉末緩慢加入已經(jīng)完全溶解的計(jì)算好質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膠原溶液中，不斷攪拌，使膠原與羥基磷灰石粉末混合均勻。
【文檔編號】A61L27/24GK103893824SQ201410153286
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】呂永鋼, 陳國寶, 鄒楊 申請人:重慶大學(xué)