用于給禽類經(jīng)眼施用疫苗的包含殼聚糖的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過經(jīng)眼途徑給禽類物種施用的包含殼聚糖和疫苗的疫苗組合物，和包括使用殼聚糖以增加或增強禽類物種中細胞介導的免疫和疫苗在禽類組織中的存留的接種方法或程序。
【專利說明】用于給禽類經(jīng)眼施用疫苗的包含殼聚糖的組合物
[0001]本申請是申請日為2009年9月4日、申請?zhí)枮?00980138635.5的同名申請的分
案申請。
發(fā)明領域
[0002]本發(fā)明涉及通過經(jīng)眼途徑給禽類物種施用的包含殼聚糖(chitosan)和疫苗的疫苗組合物以及接種的方法或程序(其包括使用殼聚糖以增加或增強禽類物種中對疫苗的免疫應答)。
[0003]發(fā)明背景
[0004]疫苗是給受試者施用以通過誘導對特定微生物(例如細菌或病毒或寄生蟲)的主動免疫來增強對感染的抗性的抗原性材料的制劑。可將疫苗與佐劑共施用以增強免疫應答。佐劑的實例包括增強免疫系統(tǒng)對抗原的應答的化學和多肽免疫刺激劑。此類佐劑可包括例如氫氧化鋁、磷酸鋁、植物和動物油以及礦物油、細菌毒素、幾丁質(chitin)衍生物和殼聚糖等，可將佐劑以足以增強免疫應答的量與疫苗一起施用。[0005]通常通過胃腸外注射例如皮下或肌內注射施用疫苗和佐劑。特別地，對于治療上呼吸道的感染，還可進行至多種動物物種的鼻粘膜的直接施用。例如，歐洲專利EP865297B1描述了將來自病原體的蛋白質或多糖抗原和作為佐劑的殼聚糖鼻內共施用至小鼠。通過氣霧劑、滴劑或吹入法將此類鼻內組合物配制為微球體形式的干粉，并且通過另外的幾次連續(xù)鼻內施用允許增強IgA粘膜體液和IgG全身性免疫應答。
[0006] 申請人:現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在相同的接種程序中與禽類疫苗組合使用的殼聚糖具有極大地增強細胞介導的免疫應答同時維持已接種的鳥類的高體液和全身性免疫應答的潛力(當通過經(jīng)眼途徑施用時)。此外，已發(fā)現(xiàn)，殼聚糖作用于禽類結膜并且導致疫苗在禽類組織中的存留(persistence)顯著增加。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明涉及經(jīng)眼施用給禽類物種的疫苗組合物，其包含一種或多種疫苗和有效佐劑量的殼聚糖。本發(fā)明還涉及免疫禽類物種的方法，其包括給禽類物種經(jīng)眼施用疫苗組合物，以及一種或多種疫苗與殼聚糖的組合在制造用于經(jīng)眼施用以有效地免疫禽類物種抵抗感染性疾病的疫苗組合物中的用途。本發(fā)明還涉及禽類接種試劑盒，其包括疫苗組合物和用于所述疫苗組合物的經(jīng)眼施用的工具或裝置。
[0009]附圖概述
[0010]圖1:舉例說明接種的時間線。
[0011]圖2:舉例說明抗原回憶(antigen recall)方案。
[0012]圖3:顯示如在經(jīng)眼施用具有或不具有殼聚糖的CEVAC? VITAPEST L(CevaPhylaxia, Hungary)后2至5周測量的雞Y -干擾素的產(chǎn)量水平(光密度)。
[0013]圖4:顯示已通過經(jīng)眼途徑接受具有或不具有殼聚糖的CJEVAG?UNI L或
CEVAC? VITAPEST L的SPF雞的禽類組織中以卵感染劑量(EID5tl)表示的新城疫(ND)疫苗株的滴度。
[0014]圖5:顯示已通過經(jīng)眼途徑接受具有或不具有殼聚糖的CEVAG? UNI L(Ceva
Phylaxia, Hungary)或CEVAC? VITAPEST L的常規(guī)蛋雞的禽類組織中以卵感染劑量(EID50)表示的新城疫疫苗株的滴度。
[0015]圖6A和6B:顯示在用活新城疫疫苗(NDV)接種SPF雞(圖6A)和常規(guī)蛋雞(圖6B)后的免疫活性和特異性細胞介導的免疫。通過經(jīng)眼途徑，在一日齡時用單獨的GfifiiCf
VITAPEST L(黑色柱)或與殼聚糖組合的CTVACf VITAPEST L(灰色柱)接種鳥類。未接
種的動物以白色柱標示。用PMA/1no絲裂原(0.1 μ g/ml) gp-NDV回憶抗原(I μ g/ml)刺激脾細胞，在72小時的活化后收獲被刺激的細胞的上清液。通過ChIFN Y捕獲ELISA測定ChIFN Y的產(chǎn)量。結果相應于在各時間點上的光密度(0.D.)的平均值土標準差(n=5)。具有不同上標的平均值土標準差差異顯著(P〈0.05)。
[0016]圖7A和7B:顯示在用活ND疫苗接種SPF雞(圖7A)和常規(guī)蛋雞(圖7B)后眼淚(lachrymal)抗體介導的免疫。在一日齡時通過經(jīng)眼途徑用單獨的(黑色柱)或與殼聚糖
組合的(灰色柱)GEVAG? VITAPEST L接種鳥類。未接種的動物以白色柱標示。數(shù)據(jù)表
示在接種后指定的時間上通過ELISA測定的吸光度值(0.D.)的平均值土標準差(n=5)。將淚液樣品以1:4(對于IgA/G)和1:32(對于IgM)稀釋。具有不同上標的時間點上的平均值土標準差差異顯著(P〈0.05)。N.D.=由于在NDV特異性IgA和IgG測量后剩余有限量的樣品而未測定的。
[0017]圖8A和8B:顯示在用活ND疫苗接種SPF雞(圖8A)和常規(guī)蛋雞(圖8B)后膽汁抗體介導的免疫。在一日齡時，通過經(jīng)眼途徑，用單獨的(黑色柱)或與殼聚糖組合的(灰
色柱)CEVAC? VITAPEST L接種鳥類。未接種的動物以白色柱標示。數(shù)據(jù)表示在接種后
指定的時間上通過ELISA測定的吸光度值(0.D.)的平均值土標準差(n=5)。將膽汁樣品以1:50稀釋。具有不同上標的時間點上的平均值土標準差差異顯著(P〈0.05)。
[0018]圖9A和9B:顯示在用活ND疫苗接種SPF雞(圖9A)和常規(guī)蛋雞(圖9B)后十二指腸抗體介導的免疫。在一日齡時，用單獨的(黑色柱)或與殼聚糖組合的(灰色柱)CEVAC? VITAPEST L接種鳥類。未接種的動物以白色柱標示。數(shù)據(jù)表示在接種后指
定的時間上通過ELISA測定的吸光度值(0.D.)的平均值土標準差(n=5)。在離體的十二指腸組織培養(yǎng)物的未稀釋的上清液中測量Ig應答。具有不同上標的時間點上的平均值土標準差差異顯著(P〈0.05)。
[0019]發(fā)明詳述
[0020]本發(fā)明提供了用于給禽類物種經(jīng)眼施用的疫苗組合物，該組合物包含一種或多種疫苗和有效佐劑量的殼聚糖。如上所述，已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)眼共施用后，殼聚糖和疫苗極大地增強了禽類物種的細胞介導的免疫應答并且導致疫苗在已接種的禽類的特定組織中的更長的存留。本發(fā)明的疫苗組合物從而對于提高禽類物種抗禽類疾病的長期保護作用特別有效。
[0021 ] 本領域技術人員完全理解術語“有效佐劑量”，其包括能夠刺激抗經(jīng)眼施用的抗原的免疫應答的殼聚糖的量，即，增加經(jīng)眼施用的疫苗組合物的免疫應答(例如，如根據(jù)由脾細胞產(chǎn)生的Y-干擾素的水平和禽類組織中疫苗的存留測量的)的量。在殼聚糖存在的情況下觀察到產(chǎn)生的Y-干擾素水平和疫苗組織存留時間的顯著增加。例如，細胞應答的增加還可通過細胞增殖試驗(通過在抗原回憶刺激后3H胸苷至分裂細胞內的摻入測量的)，通過測量CTL細胞對放射標記的靶細胞的細胞毒性活性(在一段時間內放射性同位素的釋放的測定)或通過巨噬細胞遷移試驗來證明。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，疫苗可以是任何禽類病原性或非病原性微生物，例如病毒、細菌、任何其他寄生蟲、或抗原。此類疫苗可以是活的減毒微生物或被殺死的滅活微生物(完整的微生物或微生物的亞單位)、滅活的嵌合或重組微生物,被破壞的微生物、突變的微生物、有缺陷的微生物或其組合。疫苗還可以是包括微生物結構例如病毒、細菌或寄生蟲的表位或抗原性部分的抗原，例如來自病原體的抗原性蛋白、重組蛋白，優(yōu)選病毒抗原例如病毒衣殼蛋白、細胞壁蛋白、肽或者細菌或寄生蟲結構的部分例如多糖、脂多糖和糖蛋白的制劑。疫苗還可以是DNA或重組DNA，所述DNA在DNA的引入后在細胞內產(chǎn)生來自病原體的抗原?？梢砸约兓蛭醇兓男问教峁┛乖?br> [0023]當疫苗是活的減毒(復制性)微生物例如病毒、細菌或其他禽類病原體時，減毒的病原體保持非致病性質，并且能夠復制。減毒可來自天然或人工減毒方法。人工減毒通常使用各種技術包括在活的動物或多種天然培養(yǎng)基(包括器官、細胞、含胚的卵等)中傳代來獲得。人工減毒還可通過感染的器官的干燥、培養(yǎng)物的陳化、對低溫或特定培養(yǎng)條件的適應、遺傳缺失等來獲得。
[0024]疫苗還可以是被殺死的滅活的微生物。通常通過化學或物理方法獲得用于接種的滅活病毒的制劑?？赏ㄟ^用例如酶、甲醛、丙內酯、乙撐亞胺或其衍生物處理病毒來實現(xiàn)化學滅活。然后可中和或穩(wěn)定所獲得的滅活病毒?？赏ㄟ^將病毒經(jīng)歷高能輻射例如UV光、X射線或Y射線來進行物理滅活。
[0025]還可從商業(yè)來源購買此類減毒或滅活的微生物例如病毒、細菌或其他禽類寄生蟲。
[0026]疫苗可以是同源(例如保護雞的雞病毒)或異源(例如保護雞的火雞病毒)類型?？蛇x擇地，疫苗制劑可包含活性抗原(live antigen)與特異性抗體的組合(稱為免疫復合疫苗)。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，疫苗或抗原可來源于導致由G.D.Butcher、J.P.Jacob和F.B.Mather (PS47,Veterinary Medicine-Large Animal Clinical SciencesDepartment, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food andAgricultural Sciences, University of Florida;Mayl999)描述的常見禽類疾病(例如禽痘(Avian Pox)、新城疫、感染性支氣管炎、鵪鶉支氣管炎、淋巴系白細胞增生、馬立克氏病(Marek’s Disease)、感染性法氏囊病、感染性喉氣管炎、產(chǎn)蛋下降綜合征、Reovirosis、感染性腱鞘炎、禽類腦脊髓炎、腫頭綜合征、火雞鼻氣管炎或禽流感)的病毒、來源于導致支原體病(mycoplasmosis)、巴斯德菌病、沙門氏菌病、博代菌病等的細菌和/或來源于導致球蟲病、彎曲菌病的其他禽類寄生蟲。用于本發(fā)明的疫苗組合物的優(yōu)選疫苗包括完整的減毒活病毒株。
[0028]優(yōu)選，疫苗來源于新城疫病毒(NDV)或來源于導致馬立克氏病的病毒，即馬立克氏病病毒(MDV)或火雞皰疹病毒(HVT)。同樣地，還可使用重組HVT (rHVT)和重組MDV (rMDV)。可通過將至少一個異源核酸序列(即，相應于與天然存在于HVT或MDV中的基因的核酸序列不同一的基因或其部分的DNA)整合入病毒基因組對此類重組病毒進行遺傳修飾?？蛇x擇地，可通過將同源核酸序列(即，相應于與天然存在于HVT或MDV中的基因同一的基因或其部分的DNA)整合入病毒基因組來對rHVT或rMDV進行遺傳修飾。
[0029]殼聚糖是幾丁質的衍生物并且相應于由隨機分布的β -(1-4)-連接的D-葡糖胺(脫乙酰化單位)和N-乙?；?D-葡糖胺(乙?；瘑挝?組成的線性多糖。在商業(yè)上通過幾丁質(其為甲殼類動物的外骨骼中的結構元件)的脫乙?；饔卯a(chǎn)生殼聚糖。脫乙?；某潭瓤捎肗MR光譜分析來測定。例如，商業(yè)殼聚糖的脫乙?；潭仍?0-100%的范圍內。
[0030]用于本發(fā)明的疫苗組合物的殼聚糖可通過脫乙?；链笥?0%的程度，優(yōu)選50%至90%，更優(yōu)選70%至95%的脫乙?；瘉韽膸锥≠|產(chǎn)生。此類脫乙?；瘹ぞ厶强稍谏虡I(yè)名稱〃Sea Cure+〃 殼聚糖谷氨酸鹽下從 Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norway 商購獲得。殼聚糖的分子量可以在IOkD至500kD之間，優(yōu)選在50kD至300kD之間和更優(yōu)選在IOOkD至300kD之間。[0031 ] 根據(jù)本發(fā)明，殼聚糖可以以單羧甲基殼聚糖(Mono Carboxy MethylatedChitosan, MMC)(也稱為羧甲基殼聚糖(CMC))的形式或以殼聚糖鹽酸鹽(HCl殼聚糖)的形式用作有效佐劑。HCl殼聚糖在本領域內是公知的并且例如由Kraeber Gmbh&C0.銷售。
[0032]例如，用于疫苗組合物的HCl殼聚糖的濃度可在0.1%至5%的范圍內，優(yōu)選約0.5%或約1%。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可用于抗感染性禽類疾病的禽類物種的有效免疫。事實上，如上所述，已發(fā)現(xiàn)在經(jīng)眼施用后，此類疫苗組合物極大地增強禽類的細胞介導的免疫應答以及疫苗在許多禽類組織中的存留。實際上，在接種后一周，在禽類組織包括結膜、肺、脾、氣管、消化道例如十二指腸、胰腺和盲腸集合淋巴樣組織(caecal tonsil)中觀察到疫苗在禽類組織中的存留。此外，在接種后，特別是在結膜、肺、十二指腸、胰腺和盲腸集合淋巴樣組織中，這樣的存留維持5周。
[0034]可用本發(fā)明的疫苗組合物經(jīng)眼施用的禽類物種包括例如雞、火雞、鵝、鴨、雉雞、鵪鵓或鴻子以及更常見地飼養(yǎng)的或馴養(yǎng)的家禽(poultry)或鳥禽(fowl)。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了本文中定義的疫苗組合物在接種禽類以抗禽類感染的方法中的用途，所述方法包括給禽類受試者經(jīng)眼施用包含疫苗和有效佐劑量的殼聚糖的疫苗組合物。
[0036]根據(jù)本發(fā)明，可通過滴眼劑、噴霧劑或氣霧劑分開地或同時施用有效量的殼聚糖和疫苗?？蛇x擇地，可相繼地給禽類物種施用殼聚糖和疫苗，可在疫苗之前或疫苗之后施用殼聚糖。
[0037]本發(fā)明還涉及有效量的殼聚糖和疫苗用于制備疫苗組合物的用途，所述疫苗組合物用于增加抗禽類病原體的禽類免疫應答，其中通過滴眼劑、噴霧劑或氣霧劑施用殼聚糖和疫苗，以及其中禽類的細胞介導的應答和禽類組織中病原體的存留增加。如上所述，疫苗可以是禽類寄生蟲、病毒或細菌。更明確地，疫苗可以是活的減毒微生物、被殺死的滅活微生物，或完整的減毒或滅活微生物、其亞單位或其組合。同樣地，根據(jù)本發(fā)明，還可分開或同時給禽類物種施用殼聚糖和疫苗。當相繼地施用殼聚糖和病原體時，則可在疫苗之前或在疫苗之后施用殼聚糖。
[0038]此外，根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供了通過給禽類物種經(jīng)眼施用在上文中定義的包含疫苗和有效佐劑量的殼聚糖的疫苗組合物將本文中定義的疫苗組合物用于增強保護性細胞介導的免疫應答和疫苗在禽類組織中的存留的方法的用途。
[0039]本發(fā)明還涉及免疫禽類物種的方法，其包括將如上所述的疫苗組合物施用至禽類物種的眼內的步驟。本發(fā)明還涉及通過將一種或多種疫苗與有效量的殼聚糖的組合施用至禽類物種的眼內來增加禽類物種中細胞介導的免疫和疫苗在禽類組織中的存留的方法。可分開、相繼或同時施用疫苗和殼聚糖。
[0040]此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過噴霧、氣霧劑或滴眼劑進行經(jīng)眼施用。優(yōu)選，在母源抗體逐漸減少后進行這樣的經(jīng)眼施用。
[0041]最優(yōu)選，進一步進行接種的加強以刺激禽類的免疫應答，所述禽類已經(jīng)歷卵內接種或在數(shù)天齡時經(jīng)歷接種，從而誘導更高的免疫應答的刺激?？膳c第一次免疫相繼或同時對I日齡或4周齡的禽類進行這樣的接種加強。
[0042]可將根據(jù)本發(fā)明的眼用疫苗組合物配制為液體或干粉，以作為氣霧劑、噴霧劑或滴眼劑施用。因此，可通過直接噴霧至鳥的頭上來給禽類施用疫苗組合物?？蛇x擇地，如對于人一樣，可將一滴或多滴疫苗組合物直接置于每一個體鳥的眼內。將根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選組合物配制為液體形式的滴眼劑。
[0043]作為氣霧劑、滴眼劑或噴霧劑施用的組合物可包含一種或多種類型的通常包含在此類組合物中的賦形劑，例如防腐劑、粘度調節(jié)劑、張力調節(jié)劑、淚液阻斷劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、載體、佐劑等，以制備經(jīng)眼施用的制劑。為了確保殼聚糖在水性介質中保持可溶，以及確?？乖皇芴岬腜H不利地影響，用于經(jīng)眼施用的溶液優(yōu)選具有范圍在5.5至6.5內的pH。載體可以是本領域技術人員公知的許多水性緩沖劑的任一種，例如磷酸鹽緩沖劑?？墒褂昧硗獾淖魟４祟愖魟┰诒绢I域內是公知的并且可包括油乳劑、鋁鹽或凝膠例如氫氧化鋁或磷酸鋁、皂苷、維生素、來自細菌壁的提取物、基于聚丙烯酸的聚合物例如卡波普、非離子型嵌段聚合物、脂肪酸胺類例如阿夫立定(avridin)和DDA、基于葡聚糖(dextran)的聚合物例如硫酸葡聚糖和DEAE葡聚糖、生物可降解的微膠囊、脂質體、病毒免疫刺激物例如MDP、LPS和葡聚糖類(glucans)。
[0044]本發(fā)明還提供了包括用于分配包含疫苗和有效量的殼聚糖的眼用疫苗組合物的工具的產(chǎn)品或禽類接種試劑盒。更明確地，禽類接種試劑盒包括適合用于將疫苗組合物直接分配至禽類的眼中的分配裝置。此類分配裝置可以例如采取氣霧劑、噴霧劑或滴眼劑遞送系統(tǒng)的形式，并且可進行安排以只分配單個劑量或多個劑量至禽類的眼中。禽類接種試劑盒可包括各自包含有效量的殼聚糖和疫苗的分開的容器。根據(jù)本發(fā)明的禽類接種試劑盒還可包括具有關于藥物組合物的施用和劑量的信息的技術說明書。
[0045]可以以有效地刺激細胞介導的免疫應答和增加疫苗例如疫苗病毒株在禽類物種中的存留的量施用疫苗。例如，可以一個或多個劑量給禽類施用疫苗，每一劑量包含例如IO5 至 108EID5。。
[0046]現(xiàn)有活疫苗由于通過母源抗體(MDA)的傳遞(通過卵黃轉移，隨后被再吸吸并且存在于小雞血清中)而提供的抗病原體的一些保護作用在新孵化的禽類中的存在而通常受到限制。此類MDA可通過中和活疫苗而干擾接種。因此，對接種的免疫應答在常規(guī)雞中可被延遲和/或限制，如之前在全身性水平上觀察到的。
[0047]因而，優(yōu)選在MDA已減弱后施用根據(jù)本發(fā)明的疫苗，從而允許在禽類可能暴露于NDV的毒株之前誘導良好的免疫應答。最優(yōu)選，根據(jù)MDA的減弱，在2或3周齡時進行加強接種。
[0048]如在下面的實施例中更詳細地顯示的，對4組I天齡的SPF雞(無明確病原體)或常規(guī)蛋雞進行接種實驗(圖1)。使用滴眼劑通過經(jīng)眼途徑給所有組的雞施用疫苗組合物。稱為“陰性雞”的組不接受任何疫苗。用一個劑量的GEVAG? uni L或用一個劑量的
CEVAC? VITAPEST L (兩者都相應于活減毒新城疫病毒)接種第二和第三組。殼聚糖還被
用作佐劑。僅陰性和GEVAif VITAPEST L使用或不使用佐劑進行接種，以確認殼聚糖對細
胞介導的免疫和疫苗病毒在禽類組織中的存留的令人驚訝的作用。從第I至第5周每一周收集樣品。評估和確認局部(BALT)免疫。
[0049]特別地，本 申請人:已證明，抗原回憶激活是特別有效的。事實上，接種后(p.v.)2至5周收集已接種的雞的脾細胞并且將其與新城疫病毒蛋白接觸以評估Y-干擾素(ChIFN Y )的產(chǎn)量水平。使用ELISA試劑盒通過光密度(0.D.)進行雞Y-干擾素的測量。ChIFN Y的產(chǎn)量水平表示已接種的禽類中脾細胞的刺激水平，從而表示細胞介導的免疫的水平(圖2)。
[0050]此外，已在下文實施例3中證明根據(jù)本發(fā)明的禽類經(jīng)眼接種導致令人驚訝地高的對細胞介導的免疫的效 應。不受任何限制，已例如證明在經(jīng)眼施用后殼聚糖對抗新城疫病毒的特異性細胞介導的免疫的陽性效應。已顯示GEVACf VITAPEST L組和使用殼聚糖的
CEVAC? VITAPEST L組中ChIFNy的產(chǎn)量結果(圖3)。已顯示在SPF雞接種后第二至第
五周，使用殼聚糖的VITAPEST LmMWtt CEVAC? vitapest l組更高的細胞介導的免疫水平。該差異在第2周在統(tǒng)計學上是顯著的。
[0051]此外，已證明以殼聚糖為佐劑的疫苗的經(jīng)眼施用誘導了疫苗病毒株在雞組織中(在SPF雞和常規(guī)蛋雞中)的更長的存留(圖4)。如下文實施例2中所顯示的，已通過對在雞的經(jīng)眼接種后第I周和第5周收集的不同器官(即結膜、肺、氣管、十二指腸、胰腺、盲腸集合淋巴樣組織和脾)進行實時PCR實驗，評估了在SPF雞的經(jīng)眼接種后新城疫病毒的存在。
[0052]已首先在SPF雞的此類不同器官中評估了疫苗株病毒復制。在SPF雞的接種后第一周，已在結膜、肺和脾中觀察到相同水平的CMfAGe uni L疫苗病毒和GIMG?VITAPEST L疫苗病毒的病毒復制。CSYMfUNI L疫苗病毒基本上在氣管中復制，與CEVAC? VITAPEST L具有統(tǒng)計學上顯著的差異。CBVAC? vitapest l疫苗病毒基本上在消化道例如十二指腸、胰腺和盲腸集合淋巴樣組織中復制，與GEYAC? UNI L具有統(tǒng)計學上顯著的差異。在雞的經(jīng)眼接種后第5周，兩種疫苗病毒株都在結膜中復制但在GEfACfUNI L組中只有一只雞是陽性的。CEVAC? VITAPEST L疫苗病毒但非GBVMf UNI L同樣地在其他器官中復制。
[0053]類似地，本 申請人:證明了疫苗病毒株在常規(guī)蛋雞中的存留。特別地，已顯示在雞的
經(jīng)眼接種后第一周，在GEVAG? uni L組中復制的水平更高。當殼聚糖用作佐劑時，在更多
器官中和在更長的時間內分離到病毒。在雞的經(jīng)眼接種后第5周，只在一些已接種的常規(guī)蛋雞的結膜中分離到兩種疫苗病毒株(圖5)。
[0054]最后，本 申請人:已在下文的實施例4中證明，與通常在哺乳動物中觀察到的相反，在家禽中由不同疫苗誘導的體液免疫未得到增強，從而當通過經(jīng)眼途徑給禽類施用時，顯示了具有殼聚糖的疫苗組合物的特別出眾的效應。
[0055]通過下列實施例舉例說明(但不以任何方式限制)本發(fā)明。
實施例
[0056]實施例1:材料和方法
[0057]實施例1.1:雞
[0058]分別從由Lohmann Valo (Cuxhaven, Germany)和 Wijverkenshatchery (Halle, Belgium)提供的卵孵化出SPF白色來亨雞和常規(guī)蛋雞(SSL: sex salelinked)。從28周齡的種雞群(breeder flock)獲得常規(guī)蛋雞的卵，所述種雞群接受下列ND接種方案:在4和8周齡時用NOBILIS Clone30 (Intervet)接種，然后在16周齡時用NOBILIS Newcavac (滅活的疫苗，Intervet)加強。在孵化后，將全部雞保持在生物安全水平 3(BSL_3)隔離器中，在 Veterinary and Agrochemical Research Institute 的Biosafety and Bioethics Committees的授權和監(jiān)督下按照國家和歐洲細則進行動物實驗。
[0059]實施例1.2:疫苗、佐劑和攻擊株
[0060]由CEVA-PHYLAXIA Veterinary Biologicals Co Ltd (Hungary)提供 CEVAC?
VITAPEST L減毒疫苗和殼聚糖(殼聚糖鹽酸鹽)佐劑。疫苗基于無癥狀PHY.LMV.42株(Meszaros J.Aerosol-vaccination against Newcastle disease.Deut TierarztlWochl991;98:117-164;Meszaros J, Szemeredi M, Tamasi G.1mmunization of day-oldchickens against Newcastle disease.Acta Vet Hungl992; 40:121-127)，其屬于基因型 I (Czegledi A, Ujvari D, Somogyi E, Wehmann E, Werner 0,Lomniczi B.Third genomesize category of avian paramyxovirus serotypel(Newcastle disease virus)andevolutionary implications.Virus Res2006; 120:36-48)。在憐酸緩沖鹽溶液(PBS 緩沖液)中重構疫苗批次以在50 μ I中獲得I個劑量，其相應于~IO6EID5tl/劑量。殼聚糖鹽酸鹽是由兩個單位的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺組成的未分支二元雜多糖的氯化物。其通過通常導致70%至95%的脫乙?；潭鹊膸锥≠|的部分脫乙?；@得。以0.5%(w/v)的終濃度將殼聚糖溶解在PBS緩沖液中，將其用于重構并且稀釋疫苗至終濃度° 在 Mexico(Calderon NL, Galindo-Muniz F，Ortiz M, Lomniczi B, FehervariΤ, Paasch LH.Thrombocytopenia in Newcastle Disease:haematological evaluationand histological study of bone marrow.Acta Vet Hung2005; 53 (4): 507-513)分離用于攻擊的Chimalhuacan NDV株，其屬于II類基因型V。其是具有1.89的ICPI的速發(fā)型親內臟株。IO5EID5tl的該株的眼鼻或直接經(jīng)眼接種在于3至6周齡內被攻擊的SPF雞和商業(yè)母源免疫肉雞中在3至6天內誘導100%的死亡率(個人觀察)。
[0061 ] 實施例1.3:絲裂原和NDV抗原
[0062]絲裂原佛波醇12-豆蘧酸酯13-乙酸酯(PMA)和離子霉素(1no)購自Sigma(Belgium)0 如之前所述(Lambrecht B,Gonze M, Meulemans G, van den BergT.Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection ofchicken interferon-gamma in response to mitogen and recall Newcastle diseaseviral antigen stimulation.Avian Path2004; 33:343-350)從 NDV La Sota株制備 NDV 回憶抗原，命名為NDV糖蛋白(gp-NDV)。
[0063]實施例1.4:疫苗株的組織分布和復制的測量
[0064]從下眼瞼的結膜(其顯示對NDV更易感)(Nakamura K，Ohta Y，Abe Y，ImaiK，Yamada M.Pathogenesis of conjunctivitis caused by Newcastle disease virusesin specific-pathogen-free chickens.Avian Path2004; 33 (3): 371-376)、氣管、肺、脾、胰腺、十二指腸和盲腸集合淋巴樣組織收集組織樣品，并且將其保持冷凍直到處理。CEVAC? VITAPEST L疫苗株的組織分布和復制通過特異于CBVMf VITAPEST L
的 QRRT-PCR 測定，所述 QRRT-PCR 允許檢測 IO2EID50/ 反應(104.18EID50/20mg 組織)。結果表示為每20mg組織的疫苗株滴度。如Van Borm S等人，A universal avianendogenous real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction controland its application to avian influenza diagnosis and quantification.AvianDis2007; 51:213-220所描述的，使用禽類α -肌動蛋白作為持家基因確認RNA提取方法和樣品的質量。
[0065]實施例1.5:免疫活性和NDV特異性細胞介導的免疫的測量
[0066]分別通過脾淋巴細胞的有絲分裂和NDV抗原活化調查免疫活性和NDV特異性細胞介導的免疫。簡而言之，無菌地從雞中取出脾，分離脾細胞，用絲裂原(0.1 μ g/ml PM/1no)活化脾細胞作為脾細胞的離體可活化度的陽性對照，或用NDV回憶抗原(gp-NDV)(I μ g/ml)活化脾細胞。細胞應答表示為光密度(0.D.)值并且等于或大于0.1的0.D被認為是顯著活化的證據(jù)。
[0067]實施例1.6:NDV特異性體液和局部抗體介導的免疫的測量
[0068]通過血細胞凝集抑制(HI)試驗和通過NDV特異性IgG、IgA和IgMELISA估計NDV特異性體液免疫。通過ELISA測量淚液、肺、膽汁和十二指腸中局部抗體介導的對NDV的免疫。
[0069]實施例1.7:攻擊性NDV株的口咽和泄殖腔排泄的測量
[0070]將口咽和泄殖腔棉簽浸沒在補充有抗生素(10000IU/ml青霉素、2mg/ml鏈霉素、lmg/ml慶大霉素和650 μ g/ml卡那霉素)的Iml腦心灌注取樣緩沖液(37g溶解于I升蒸懼水)(Becton Dickinson Benelux, Belgium)中。將棉簽于-80°C下保存直到進一步分析。為了利用定量實時逆轉錄-聚合酶鏈式反應(QRRT-PCR)進行分析，按照制造商的方案使用 MagMAX96AI/ND viral RNA Ambion 試劑盒(Applied Biosystems, Lennik, Belgium)在KingFisher磁性顆粒處理器(Thermo Scientific)上從50 μ I浸沒的棉簽提取RNA。將純化的RNA洗脫在50 μ I洗脫緩沖液中。[0071]通過具有小改動的如上所述的定量實時逆轉錄-聚合酶鏈式反應(QRRT-PCR)測定Chimalhuacan NDV攻擊株的基質基因拷貝的數(shù)量。簡而言之，在初始逆轉錄步驟和熱啟動Taq-激活步驟后，在Applied Biosystems7500實時PCR循環(huán)儀上進行50個循環(huán)(在95°C下進行15秒，在54°C下進行34秒，在72°C下進行10秒)。弓丨物(M+4100和M-4220)和MGB-Taqman 探針(M+4169FAM-TAMRA)作用于基質基因并且由 Eurogentec (LiSge, Belgium)合成。通過與由Chimalhuacan NDV株的總病毒RNA組成的標準曲線相對照測定每一個樣品的病毒滴度。在每一輪實驗中包括該標準曲線?；跇藴是€的結果，特異于ChimalhuacanNDV株的NDV QRRT-PCR的靈敏度閾值(R2=0.998，效率=94.17%)被測定為IO1EID5tl/反應。其意指QRRT-PCR反應完全可以比得上高于IO2 7EID5ciAil拭樣并且定量比較是可行的。結果表示為每ml拭樣的攻擊株的滴度。
[0072]此外，如Van Borm S 等人，A universal avian endogenous real-time reversetranscriptase-polymerase chain reaction control and its application to avianinfluenza diagnosis and quantification.Avian Dis2007; 51:213-220 中所述，使用禽類α -肌動蛋白驗證了樣品和RNA提取方法的質量。
[0073]實施例1.8:實驗設計
[0074]對SPF雞進行兩個相似的實驗(實驗I和II)。在I日齡時，將105只SPF雞在BSL-3隔離器中分成3組，每組35只。在同一天，分別使用單個劑量的用或未用0.5%殼聚糖作為佐劑的GEVAG? VITAPEST L疫苗通過眼鼻途徑接種兩個組。通過直接的經(jīng)眼施用
進行相似的實驗(數(shù)據(jù)未顯示)。第三組保持未接種并且用作陰性對照組。接種后(P.V.)2天，人道地殺死雞以獲得血液、膽汁和十二指腸。從p.V.1至5周，以一周的間隔收集淚液，并且從相同的動物采集血液、脾、膽汁和十二指腸樣品。在第I和第5周，在一個實驗中另外地獲取結膜、氣管、肺、胰腺和盲腸集合淋巴樣組織。在第3和第5周，在通過寧必妥(CEVASante Animale)注射無痛致死后從每一組的另外的雞收集肺清洗物。在每一個時間點上使用5只雞/組。在實驗II中，在p.V.第2、3、4和5周獲取淚液、血液、脾、膽汁和十二指腸的樣品。
[0075]還在常規(guī)蛋雞中進行2個另外的實驗(實驗III和IV)。在I日齡時，將90只常規(guī)蛋雞在BSL-3隔離器中分配至3個組，每一組30只雞。在同一天，如之前所述接種兩個組；第三組保持未接種并且用作陰性對照組。除了只在P.V.第5周收集肺清洗物外，實驗III的實驗設置與實驗I相似。在實驗IV中，在p.V.第2、3、4和5周獲取淚液、血液、脾、膽汁和十二指腸的樣品。在5周齡時,通過眼鼻途徑用105EID5(l/200 μ I的ChimalhuacanNDV株攻擊每一組的10只雞。逐個地鑒定雞。在攻擊后，每日就臨床癥狀(頭的水腫、萎靡不振、虛脫和神經(jīng)體征)和死亡率監(jiān)控雞。在攻擊后(p.ch.)第2、4、7和10天獲取口咽和泄殖腔拭樣。在P.ch.第11天，無痛致死存活的雞并且收集血液樣品。從5只雞/組獲取脾和十二指腸。
[0076]實施例1.9:統(tǒng)計分析
[0077]如之前所述使用Minitabl3和STATA10軟件(用于Windows2000的統(tǒng)計程序)進行統(tǒng)計分析，并且當p〈0.05時差異被認為是顯著的。
[0078]實施例2:疫苗株的組織分布和復制
[0079]全部器官樣品對于α-肌動蛋白內源擴增對照顯示陽性擴增信號(Ct〈40)，從而確認了它們的優(yōu)良品質和RNA純度。
[0080]在P.V.第I周在已接種的SPF雞的全部器官樣品中檢測到VITAPEST L
病毒(表1)。在P.V.第5周,只在一些雞的結膜、肺、脾、十二指腸、胰腺和盲腸集合淋巴樣組織中檢測到疫苗株。當使用殼聚糖時，更頻繁地檢測到疫苗株；然而，在病毒滴度之間無統(tǒng)計學上的差異。在接種I日齡的常規(guī)蛋雞后I周，GEVAG? VITAPEST L疫苗株存在于結
膜、氣管和十二指腸的幾個樣品中(表1)。當疫苗使用殼聚糖作為佐劑時，還在一些肺、脾和盲腸集合淋巴樣組織樣品中檢測到疫苗株。盡管如此，在已接種的常規(guī)蛋雞中，檢測頻率和滴度比在接種的SPF雞中發(fā)現(xiàn)的更低。在P.V.第5周，在結膜中仍然可檢測到疫苗病毒的復制。
[0081]轟1:在用具有或不具有殼聚糖佐劑的CXfiG? VITAPEST L疫苗接種I日齡SPF
雞和常規(guī)蛋雞后的疫 苗病毒的檢測(分別地，實驗I和III)。 [0082]
【權利要求】
1.包含活的減毒新城疫病毒和殼聚糖的組合物用于制備疫苗組合物的用途，所述疫苗組合物用于通過滴眼劑、噴霧劑或氣霧劑經(jīng)眼施用給禽類，從而免疫或接種所述禽類。
2.權利要求1的用途，其中分開或同時施用所述殼聚糖和所述活的減毒新城疫病毒。
3.權利要求1或2的用途，其中通過滴眼劑、噴霧劑或氣霧劑相繼地給禽類物種施用所述殼聚糖和所述活的減毒新城疫病毒，所述殼聚糖在所述活的減毒新城疫病毒之前或之后施用。
4.權利要求1的用途，其中所述疫苗組合物用于免疫或接種選自下列的禽類物種:飼養(yǎng)的或馴養(yǎng)的家禽或鳥禽，包括雞、火雞、鵝、鴨、雉雞、鵪鶉或鴿子。
5.權利要求1的用途，其中所述疫苗組合物用于增加禽類物種中細胞介導的免疫和所述病毒在禽類組織中的存留。
6.殼聚糖和活的減毒新城疫病毒用于制備疫苗組合物的用途，所述疫苗組合物通過經(jīng)由滴眼劑、噴霧劑或氣霧劑的經(jīng)眼施用，而免疫或接種禽類。
7.權利要求6的用途，其中分開地或同時地給禽類施用殼聚糖和所述活的減毒新城疫病毒。
【文檔編號】A61K39/17GK103893758SQ201410156297
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2009年9月4日 優(yōu)先權日:2008年9月5日
【發(fā)明者】Y·伽丁, V·帕萊, S·科姆特 申請人:詩華動物保健股份有限公司