一株霍氏腸桿菌及其在制備抗菌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株霍氏腸桿菌及其在制備抗菌藥物中的應用。霍氏腸桿菌（Enterobacter?hormaechei）5號，其保藏編號為CCTCC?No.M2013695。本發(fā)明的霍氏腸桿菌5號對多種菌具有拮抗作用，因此可以將本發(fā)明的霍氏腸桿菌5號用于制備防控溶藻弧菌或副溶血弧菌制劑中，該防控溶藻弧菌或副溶血弧菌制劑可作為替代化學藥品的有益微生物制劑，用于改善水質，清除水產品養(yǎng)殖系統(tǒng)中的溶藻弧菌或副溶血弧菌，從而預防溶藻弧菌或副溶血弧菌對水產養(yǎng)殖對象的危害，促進水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展；避免水產品攜帶溶藻弧菌或副溶血弧菌，保障人類健康安全。
【專利說明】一株霍氏腸桿菌及其在制備抗菌藥物中的應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于水產養(yǎng)殖領域，具體涉及一株抗菌活性成分穩(wěn)定性高，能作為多種菌的拮抗菌的霍氏腸桿菌及其在制備抗菌藥物中的應用。
【背景技術】:
[0002]溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus, V.alginolyticus)隸屬弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio)，該菌存在于海水、河口、海洋動物體中。溶藻弧菌對魚、蝦、貝等養(yǎng)殖動物都有較強的致病性，可引起養(yǎng)殖動物急性出血性敗血癥。這種疾病，也稱爆發(fā)性流行病、弧菌病、體表潰瘍等，能感染多種海水養(yǎng)殖品種，如大黃魚、鱸魚、牙鲆、點帶石斑魚、黑鯛、平鯛、軍曹魚、中國明對蝦、日本對蝦、斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦、文蛤、烏賊等，是我國流行較廣的一種水生動物條件致病菌。該菌為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢、莢膜，單獨存在或尾端相連成“C”或“S”形，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌，適宜溫度為17~350C，生長最適pH值范圍為6.0~9.0，近年來在我國海南、廣東、福建等省養(yǎng)殖魚類蝦類爆發(fā)性傳染病，多流行與夏季，很多報道系為該菌所致敗血癥，而且海水養(yǎng)殖病害防治比淡水困難。此外溶藻弧菌對人的致病性也有大量報道，可引起人食物中毒、耳炎等。溶藻弧菌是海水養(yǎng)殖品種暴發(fā)性傳染病的主要病 原菌之一。
[0003]該細菌的防治方法主要有:抗生素防治、中草藥防治、疫苗防控、益生菌生防。
[0004](I)抗生素防治?？股厥怯脕碇委熂毦詡魅静〉氖走x藥物，抗生素對病原菌具有顯著的抑制或殺滅作用，研究證實磺胺+TMP、環(huán)丙沙星、呋喃妥因等藥物對溶藻弧菌具有較強的抑菌效果。但是隨著抗生素的廣泛使用，近年來不同地區(qū)由于用藥種類和用法不同，產生了大量的耐藥菌株、水產品藥物殘留等威脅養(yǎng)殖業(yè)和人類健康，同時水產品耐藥又會加大劑量就陷入惡性循環(huán)。(2)中草藥防治。中草藥無抗藥性，無殘留，無環(huán)境污染，不會引發(fā)藥源性疾病且抑菌效果明顯，已經越來越引起人們的關注。研究普遍表明單方使用石榴皮、地榆、五味子、大黃、烏梅、公丁香、連翹、板藍根等中草藥具有很強的抑菌能力，在實際生產中，將具有抑菌作用的中草藥組合成復方，適當利用不同中草藥相互協(xié)同作用來防治溶藻弧菌引起的疾病，可以更好的發(fā)揮中草藥的抑菌作用。但是，配方不合理、濫用偏方、加工工藝落后、理論研究較少等問題，使很多養(yǎng)殖者盲目用藥。(3)疫苗防控。水產養(yǎng)殖上使用的疫苗主要分為兩類:一類是減毒疫苗，另一類是滅活疫苗。減毒疫苗含有減毒的活病原，能誘導特異性抗體，并與自然感染相似；滅活的疫苗是由死的病原或者病原的一些成分如細菌脂多糖或滅活的毒素組成的，能刺激動物免疫系統(tǒng)。其免疫方式有浸泡、口服、注射和噴霧等，注射方式效果最佳但費時費力且損傷蝦體，浸泡疫苗需要量大；疫苗的研制處于起步階段，減毒疫苗還缺乏安全性保障，制備麻煩，成本高等；還缺乏簡易、高效、經濟的接種途徑。(4)益生菌防控。隨著耐藥性問題的出現(xiàn)和環(huán)境的惡化使抗生素的使用受到越來越多的考驗，而益生菌憑借無毒高效的優(yōu)點，通過改善水質，在宿主體內分泌營養(yǎng)物質競爭或者有附著位點，增強宿主免疫力，提高抗病性，降低疾病的發(fā)病率，進而提高水產養(yǎng)殖產量和經濟效益，正受到越來越多的關注。目前，在水產病害控制上使用較多的益生菌為乳酸菌、弧菌屬、芽孢桿菌、光合細菌、酵母菌、假單胞菌屬等單一或多種有益菌組成的復合活性
微生物制劑，應用于魚、蝦、蟹、貝、軟體動物的養(yǎng)殖和餌料的培養(yǎng)中。

【發(fā)明內容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一株霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)5號,該菌株可以以拮抗菌的作用有效消除水產養(yǎng)殖系統(tǒng)中的溶藻弧菌，解決了現(xiàn)有技術中水產品攜帶溶藻弧菌的防疫問題。
[0006]本發(fā)明的霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei) 5號于2013年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCCN0.M2013695。
[0007]本發(fā)明的霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)5號對多種菌具有拮抗作用，因此可以將本發(fā)明的霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei )5號用于制備抗菌藥物中，如防控枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌或紫色色桿菌制劑，特別是防控水產弧菌制劑中，如防控溶藻弧菌或副溶血弧菌制劑。適用于魚、蝦等水產動物，可用于防治溶藻弧菌引起的疾病。
[0008]本發(fā)明的霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)5號對多種菌具有拮抗作用，因此可以將本發(fā)明的霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei) 5號用于制備防控溶藻弧菌或副溶血弧菌制劑中，該防控溶藻弧菌或副溶血弧菌制劑可作為替代化學藥品的有益微生物制劑，用于改善水質，清除水產品養(yǎng)殖系統(tǒng)中的溶藻弧菌或副溶血弧菌，從而預防溶藻弧菌或副溶血弧菌對水產養(yǎng)殖對象的危害，促進水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展；避免水產品攜帶溶藻弧菌或副溶血弧菌，保障人類 健康安全。
[0009]本發(fā)明的霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei) 5號于2013年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCCN0.M2013695。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0010]圖1是抑菌圈的照片；
[0011]圖2是鹵蟲保護實驗圖，其中實驗組ZJO表示只添加溶藻弧菌、實驗組5#表示只加溶藻弧菌拮抗菌發(fā)酵劑，實驗組ZJ0+5#表示加溶藻弧菌和溶藻弧菌拮抗菌發(fā)酵劑。
【具體實施方式】:
[0012]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調整，本注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0013]實施例1:霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei) 5號的篩選和鑒定
[0014](I)溶藻弧菌拮抗菌尋找、篩選
[0015](A)原料
[0016]溶藻弧菌
[0017]待篩的拮抗菌株:從西沙海域、龍蝦腸道、海參腸道等分離得到311株菌。
[0018]所用培養(yǎng)基試劑:LB培養(yǎng)基，從試劑公司采購。[0019]LB培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L。
[0020](B)溶藻弧菌液的制備:通過無菌操作，接種環(huán)將溶藻弧菌接種到LB培養(yǎng)基中，30 0C 200rpm過夜培養(yǎng)。
[0021](C)溶藻弧菌拮抗菌分離篩選
[0022](I)細菌分離
[0023]通過無菌操作，將在西沙采樣的龍蝦腸道等用PBS研磨并稀釋成10倍梯度，各取IOOul涂布于LA，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h-48h，反復劃線2_3次，直至得到單菌落，并且記錄培養(yǎng)皿中菌落的大小、形狀、顏色、光澤等培養(yǎng)特征，共分離得到311株細菌，作為待篩拮抗菌，300C 200rpm培養(yǎng)24_48h，作為待測的細菌純培養(yǎng)液。
[0024](2)拮抗菌的篩選
[0025]通過無菌操作，將過夜培養(yǎng)的溶藻弧菌稀釋10倍，取IOOul涂布于LA平板，之后用打孔器在培養(yǎng)基上均勻打直徑為9mm的孔，然后分別吸取待測的拮抗菌發(fā)酵液各lOOul，加入孔中，培養(yǎng)皿于30°C培養(yǎng)24-48h，觀察培養(yǎng)基打孔周圍抑菌圈的大小，初步篩選得到對溶藻弧菌有抑制效果的菌株。
[0026]通過在LA培養(yǎng)基上打孔抑菌實驗，從311株細菌中找到一株對溶藻弧菌有抑制作用的拮抗菌株。代號為菌株5號，其培養(yǎng)特征與對溶藻弧菌的抑制效果見表1和圖1，在圖1中，最左邊一個為陰性對照，中間和右邊(箭頭所指)均為霍氏腸桿菌5號的抑菌效果圖，中間添加的量較少，抑制作用小，圈較小。
[0027]表1:菌株5號的培養(yǎng)特征及其對溶藻弧菌的抑制
[0028]
【權利要求】
1.霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei) 5 號，其保藏編號為 CCTCC N0.M2013695o
2.權利要求1所述的霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)5號在制備抗菌藥物中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的抗菌藥物為防控枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌或紫色色桿菌制劑。
4.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的抗菌藥物為防控水產弧菌制劑。
5.根據(jù)權利要求4 所述的應用，其特征在于，所述的防控水產弧菌制劑為防控溶藻弧囷或副溶血弧囷制劑。
【文檔編號】A61P31/04GK103966123SQ201410159412
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】陳償, 韋露, 胡超群 申請人:中國科學院南海海洋研究所