用于預(yù)防或治療炎癥性腸病的組合物及其制備方法
【專利摘要】向貓給予含有二十二碳六烯酸（DHA）和任選含有選自二十碳五烯酸（EPA），花生四烯酸（ARA），亞油酸（LA）和α-亞油酸（ALA）的一種或多種脂肪酸的組合物以預(yù)防或治療貓炎癥性腸?。↖BD）。
【專利說(shuō)明】用于預(yù)防或治療炎癥性腸病的組合物及其制備方法
[0001]本申請(qǐng)是以下申請(qǐng)的分案申請(qǐng):申請(qǐng)日:2006年12月29日；申請(qǐng)?zhí)?200680049513.5 (PCT/US2006/062699);發(fā)明名稱:“用于預(yù)防或治療炎癥性腸病的組合物
及其制備方法”。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療炎癥性腸病的組合物及其制備方法，尤其是利用二十二碳六烯酸預(yù)防或治療貓炎癥性腸病的用途。
【背景技術(shù)】
[0003]“炎癥性腸病”或“ IBD ”是一類慢性特發(fā)性胃腸病，表現(xiàn)為炎癥浸潤(rùn)到胃腸道的固有層。IBD包括節(jié)段性肉芽腫性小腸結(jié)腸炎、淋巴漿細(xì)胞腸炎、嗜酸性胃腸結(jié)炎，淋巴細(xì)胞胃小腸結(jié)腸炎，膿腫性小腸結(jié)腸炎和組織細(xì)胞結(jié)腸炎。淋巴漿細(xì)胞形式的疾病可能是最常見(jiàn)的IBD類型。具體的IBD類型是基于固有層中發(fā)現(xiàn)的炎性浸潤(rùn)物的類型來(lái)鑒別的。根據(jù)嚴(yán)重程度和細(xì)胞類型，炎性浸潤(rùn)物的差異也很大，而淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞是最常見(jiàn)的細(xì)胞類型。炎性浸潤(rùn)物可能涉及到胃、小腸和結(jié)腸。例如，貓的胃和小腸通常最易受到影響。在許多情況下涉及到腸的多個(gè)部位，臨床體征可能是混合的，表現(xiàn)為黏膜損傷的分布較廣。IBD的嚴(yán)重程度可從溫和的臨床征象變化到致命的蛋 白丟失性腸病。
[0004]IBD的臨床表現(xiàn)由黏膜炎性浸潤(rùn)物決定。黏膜炎癥可破壞正常的吸收過(guò)程，這樣的破壞會(huì)導(dǎo)致吸收障礙和滲透性腹瀉。腸道通透性的改變可導(dǎo)致液體、蛋白質(zhì)和血液漏失到腸腔中。吸收不良的脂肪、碳水化合物和膽汁酸導(dǎo)致分泌性腹瀉。炎性介質(zhì)同樣可通過(guò)杯形細(xì)胞直接引發(fā)腸分泌和粘液的產(chǎn)生。黏膜炎性浸潤(rùn)物可改變腸和結(jié)腸動(dòng)力模式，其機(jī)制可歸因?yàn)榍傲邢偎睾桶兹?duì)平滑肌的影響。胃和小腸的炎癥會(huì)刺激引發(fā)嘔吐的受體。例如，在貓中，IBD最常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象是慢性嘔吐，腹瀉和體重降低。
[0005]IBD發(fā)展的基本途徑與超敏性有關(guān)。兩個(gè)相關(guān)的理論試圖解釋超敏性反應(yīng)的潛在原因。第一種理論推測(cè)患有IBD的貓會(huì)產(chǎn)生腸黏膜屏障的缺陷。黏膜完整性的缺失會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增加以及對(duì)通?？赡褪艿倪^(guò)敏源產(chǎn)生超敏性反應(yīng)增大。第二種理論推測(cè)IBD是由對(duì)腔內(nèi)抗原的異常免疫反應(yīng)引起的。兩種可能的途徑都使炎癥介質(zhì)的釋放到達(dá)最大。這些炎癥介質(zhì)可進(jìn)一步損傷腸黏膜表面，并產(chǎn)生炎癥的循環(huán)以及屏障功能的缺失。
[0006]必需脂肪酸在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面具有特殊的作用。例如，Ω-3 二十碳五烯酸(ΕΡΑ)，Ω-6花生四烯酸和Y-亞麻酸是合成類二十烷的前體物質(zhì)，類二十烷是作為局部激素和炎癥介質(zhì)起作用的免疫控制分子。由花生四烯酸(ARA)合成的類二十烷與二十碳五烯酸和Y-亞麻酸產(chǎn)生的類二十烷相比具有促炎性，并且當(dāng)產(chǎn)生過(guò)量時(shí)可產(chǎn)生病理狀態(tài)。巨噬細(xì)胞是類二十烷的重要來(lái)源，并調(diào)節(jié)炎性和免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的膜磷脂中主要的多不飽和脂肪酸是ARA。服用Y-亞麻酸或EPA可使二十碳五烯酸和Y -亞麻酸替代巨噬細(xì)胞膜中的ARA，這樣替代的結(jié)果使來(lái)源于ARA的類二十烷量減少，而來(lái)源于EPA和Y -亞麻酸的類二十烷量增多，因此可降低對(duì)炎癥發(fā)作的免疫應(yīng)答。[0007]目前IBD的確診是基于對(duì)內(nèi)窺鏡和外科手術(shù)方法采集的腸黏膜或全層的腸活檢標(biāo)本進(jìn)行的組織病理學(xué)檢查。因此，需要另一種比獲得活撿標(biāo)本創(chuàng)傷小的診斷貓IBD的方法。還需要用于預(yù)防和治療貓IBD的新方法和組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療貓IBD的方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供適用于預(yù)防或治療貓IBD的組合物。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供確診貓是否患上IBD的方法。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供套盒形式的制品，該套盒含有食物、化合物、組分和裝置的組合，用于預(yù)防或治療貓科動(dòng)物的IBD。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供關(guān)于本發(fā)明的方法、組合物、制品和益處的信息傳達(dá)手段。
[0013]利用新的預(yù)防和/或治療易感染IBD或患上IBD的貓的方法實(shí)現(xiàn)了上述的一個(gè)或多個(gè)發(fā)明目的，該方法包 括給貓服用治療有效量的二十二碳六烯酸(DHA)。還提供了用于診斷IBD的方法和用于預(yù)防和/或治療IBD的包含有食物、化合物、組分和裝置的組合的套盒。
[0014]本發(fā)明的另外的目的、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)是顯而易見(jiàn)的?！揪唧w實(shí)施方式】
[0015]一方面，本發(fā)明提供了用于治療患有IBD的貓的方法。治療IBD包括改善、抑制和/或根除IBD。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用診斷檢驗(yàn)(如全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清生化、血清甲狀腺素水平、免疫缺陷病毒檢驗(yàn)、貓白血病病毒檢驗(yàn)、尿分析、寄生蟲(chóng)和細(xì)菌的糞便檢驗(yàn))，飲食檢驗(yàn)，腹部放射照片和/或超聲，和/或黏膜或全層腸活檢標(biāo)本檢驗(yàn))能夠診斷IBD(并且能將IBD與其他胃腸道疾病區(qū)分)。另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防貓感染IBD的方法。預(yù)防IBD包括降低IBD的危險(xiǎn)性，延緩IBD的發(fā)作，和/或使貓免于發(fā)生IBD。該方法包括給貓服用治療有效量的二十二碳六烯酸(DHA)，治療有效量就是當(dāng)貓患上IBD時(shí)能夠治療IBD，或者當(dāng)貓易感染IBD時(shí)能夠預(yù)防IBD，或者能夠降低易感染或患上IBD的貓的⑶4+淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平的量。給藥就是通過(guò)適合的給藥途徑(如口服、局部應(yīng)用、腸外應(yīng)用)將合適劑型的DHA或其它化合物給貓施用。DHA可以純DHA或DHA衍生物(如酯或鹽)的形式或者以含DHA和/或DHA衍生物的組合物的形式給藥。此處涉及的DHA和其它脂肪酸包括了這些化合物的衍生物。含有DHA的組合物還可以包含一種或多種常規(guī)的藥學(xué)上可接受的賦形劑(如助劑、載體和/或媒介物)。在一些實(shí)施例中，含有DHA的組合物可含有食品組合物。
[0016]本發(fā)明是基于一意外的發(fā)現(xiàn)，即，不是EPA或其它類似的脂肪酸，而是DHA可用于預(yù)防或治療貓的IBD，并且DHA對(duì)其它動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生相反的效果。雖然EPA和相關(guān)的脂肪酸單獨(dú)或結(jié)合使用時(shí)不能預(yù)防或治療IBD，但它們可用于補(bǔ)充DHA，以預(yù)防或治療IBD。于是，治療有效量的DHA單獨(dú)使用或與EPA和相關(guān)脂肪酸聯(lián)合使用產(chǎn)生了預(yù)料不到的有效預(yù)防或治療貓的IBD的效果。
[0017]正如此處所描述的那樣，當(dāng)給予治療有效量的DHA時(shí)，DHA有效降低了包括易感染或患上IBD的貓?jiān)趦?nèi)的貓的⑶4+淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平。[0018]一些實(shí)施方式中，該方法包括每天對(duì)貓給藥約6到165mgDHA/kg體重，一些實(shí)施方式中是約12到65 mgDHA/kg體重，另一些實(shí)施例中是約12到32 mgDHA/kg體重。DHA的日劑量可以一次性給藥，也可以分兩次或多次給藥。
[0019]一些實(shí)施方式中，DHA給藥包括向貓喂食DHA，也即，喂食DHA或含有DHA(包括DHA的衍生物)的組合物。
[0020]在不同的實(shí)施方式中，喂食給貓的含DHA的組合物包含食品組合物。一些實(shí)施方式中，該食品組合物符合AAFCO規(guī)定的繁殖或維持的最低營(yíng)養(yǎng)水平需求，參見(jiàn)2005年AAFCO的官方出版物，第137-140頁(yè)。一些實(shí)施方式中，食品組合物包含干性食品。其它一些實(shí)施方式中，食品組合物包含半濕性食品。另外一些實(shí)施方式中，食品組合物包含濕性食品。此處提到的“干性”、“濕性”、“半濕性”的用語(yǔ)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。食品組合物可以是一種補(bǔ)充劑、治療品、零食或者是部分或全部可食用的玩具。在一些實(shí)施方式中，食品組合物包含一種或多種食品的混合物或一種低過(guò)敏性食品組合物。
[0021]在一些實(shí)施方式中，選取的貓是伴侶貓。伴侶貓可以是作為寵物的貓，也可以是廣泛馴養(yǎng)的貓，例如不論是否是作為寵物對(duì)待的貓(家貓)。一些實(shí)施方式中，貓可以是正在長(zhǎng)大的貓，正在長(zhǎng)大的貓是還未達(dá)到成年大小的貓，例如，典型的正在長(zhǎng)大的貓是那種不到一年齡的貓。一些實(shí)施方式中，貓是成年的貓，成年的貓是完成幼年成長(zhǎng)和發(fā)育后的任意年齡的貓，包括年長(zhǎng)的貓和衰老的貓，例如，典型的成年貓是從一年左右直至其余生的貓。年長(zhǎng)的貓是那種具有與年齡有關(guān)的患病風(fēng)險(xiǎn)的貓，不論貓是否表現(xiàn)出明顯變老的身體或行為體征，例如，典型的年長(zhǎng)的貓是那種七年到十一年大的貓。衰老的貓是那種能看出年老跡象的貓，例如，典型的衰老的貓是十二年左右和超過(guò)十二年的貓。
[0022]除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所有百分比均是在干物質(zhì)基礎(chǔ)上的重量百分比?！盎诟晌镔|(zhì)”意思為組合物中組分的濃度是在去除組合物中所有水分后測(cè)定的。
[0023]在一些實(shí)施方式 中，給予貓的組合物包括約0.05%到約1%的DHA。一些實(shí)施方式中，組合物包括約0.1%到約0.4%的DHA。在另一些實(shí)施方式中，組合物包括約0.1%到約0.2%的DHA。在另一些實(shí)施方式中，組合物包括約0.05%到約0.2%的DHA。在另一些實(shí)施方式中，組合物包括約0.05%到約0.15%的DHA。在另一些實(shí)施方式中，組合物包括從約
0.05%或約 0.1%到約 0.15%、約 0.2%或約 0.4%的 DHA。
[0024]在某些實(shí)施方式中，給予貓的組合物進(jìn)一步包含至少一種脂肪酸，可選自二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(ARA)、亞油酸(LA)和α —亞油酸(ALA)。在某些實(shí)施方式中，組合物中存在的各種脂肪酸的含量為約0.05%到1%。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約
0.1 %到約0.5%或者0.1 %到約0.3%的脂肪酸。在一種實(shí)施方式中，用于給予貓的組合物進(jìn)一步包含約0.1%到約0.5%的EPA。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.1 %到約0.3%的EPA。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05%到0.3%的EPA。進(jìn)一步地在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.15%到0.3%的EPA。在某些實(shí)施方式中，組合物包含從約0.05%到約0.3%的EPA。某些實(shí)施方式中，組合物包含約0.05%、約0.1%或約0.15%到約0.2%、約 0.3%、約 0.4%或約 0.5%的 EPA。
[0025]在一些實(shí)施方式中，給予貓的組合物包含約0.05%到約1%的DHA和約0.05%到約I %的EPA，且組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為I到2。在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1.2到1.8。在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1.2到1.5。在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1.3到1.6。進(jìn)一步地在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例從約為
1、1.2 或 1.3 到約為 1.5,1.6、1.8 或 2。
[0026]在一些實(shí)施方式中，預(yù)防和治療方法進(jìn)一步包括向貓給予一種抗炎癥性腸病(抗IBD)劑，該抗IBD劑與DHA聯(lián)合使用或者與DHA和選自EPA、ARA、LA和ALA的至少一種脂肪酸的組合物聯(lián)合使用?？笽BD劑是一種用于預(yù)防或治療IBD的化合物，或其衍生物(例如，該化合物的鹽、溶劑化物或水合物)，或者是一種包含此類化合物和/或衍生物的組合物?！奥?lián)合使用”是指抗IBD劑或與DHA合并向貓給藥，或與DHA分別地通過(guò)相同或不同的給藥途徑，在與DHA大約相同的時(shí)間或定期地，以相同或不同的頻率向貓給藥。“大約同一時(shí)間”是指可在向貓給藥DHA時(shí)給藥抗IBD劑，也可以是向貓給藥DHA后的72小時(shí)內(nèi)給藥抗IBD劑?！岸ㄆ诘亍蓖ǔＪ侵负珼HA的組合物按照適合的方式喂食給貓，而抗IBD劑則按照適合該藥物給藥的用藥方案施用。因而，“聯(lián)合使用”明確地包含了在長(zhǎng)得多的一段時(shí)間內(nèi)(例如，終身)向貓給予DHA時(shí)，可以在指定的時(shí)間段向貓給藥抗IBD劑。如果不只一種藥劑用于向貓給藥，那么每種藥物的劑型和給藥途徑可能會(huì)不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，當(dāng)向貓喂食單一的含DHA的組合物時(shí)或以不同的時(shí)間間隔向貓喂食不同的含DHA的組合物時(shí)，可向貓給予一種或多種抗IBD劑。
[0027]適合的抗IBD劑包括例如皮質(zhì)類固醇(如潑尼松、潑尼松龍)，免疫抑制劑(如硫唑嘌呤)和抗生素(如甲硝唑、阿莫西林、泰樂(lè)霉素)?？笽BD劑可以例如無(wú)機(jī)或有機(jī)酸鹽的形式給藥。化合物的鹽由于鹽的一種或多種物理性質(zhì)而可能有利，例如在不同的溫度和濕度下提高藥學(xué)穩(wěn)定性，或者在水或油中具有理想的溶解性，這取決于具體的化合物。這種鹽優(yōu)選為藥學(xué)上可接受的鹽。
[0028]優(yōu)選的抗IBD劑(可單劑量或分劑量給藥)每日總劑量是從約0.0Olmg/kg體重到約100mg/kg體重,更優(yōu)選的是從約0.01mg/kg體重到約30mg/kg體重,進(jìn)一步優(yōu)選的是從約0.01mg/kg體重到約10mg/kg體重。劑量單位組合物可含有這樣的量及其因數(shù)從而構(gòu)成了每日劑量。在許多情形， 抗IBD劑將會(huì)重復(fù)多次給予。如果需要，通常可以每天多次服用以便增加每日總劑量。影響優(yōu)選劑量方案的因素包括例如，貓的年齡、體重和狀況；患病的嚴(yán)重程度；給藥途徑；藥理學(xué)方面的因素，例如具體使用的抗IBD劑的活性、效力、藥物動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)特性；是否利用藥物傳輸體系；給予的抗IBD劑是否作為藥物組合物的一部分。于是，劑量方案會(huì)有很大差別，并因此可以不同于上述討論的優(yōu)選劑量方案。
[0029]另一方面，本發(fā)明提供了適用于預(yù)防和/或治療貓IBD的組合物。這些組合物已經(jīng)在本文的預(yù)防和治療IBD方法部分描述和示例說(shuō)明。
[0030]另一方面，本發(fā)明提供了適合用于預(yù)防和治療IBD方法的組合物的制備方法。該組合物可通過(guò)例如混合兩種或多種組分(包括食物組合物)制成，或者通過(guò)將一種或多種食物組合物與另外的組分，例如DHA、EPA和/或一種抗IBD劑混合，制成本發(fā)明的組合物。該組合物也可通過(guò)Small Animal Nutrition雜志，第127-146頁(yè)(2000)中討論的一種或多種方法制得。
[0031]另一方面，本發(fā)明提供了 DHA和任選加入的至少一種選自EPA、ARA、LA和ALA的脂肪酸制備適合用于預(yù)防或治療貓IBD的組合物的用途。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了利用DHA制備含約0.05%到約1% DHA組合物的用途。在一些實(shí)施方式中，組合物中含有約0.1 %到約0.4%的DHA。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.1 %到約0.2%的DHA。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05%到0.2%的DHA。進(jìn)一步地在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05%到約0.15%的DHA。在更進(jìn)一步的某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05%，或約0.1%到約0.15%，約0.2%，或約0.4%的DHA。在某些實(shí)施方式中，組合物含有食品組合物。
[0032]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 DHA和至少一種選自EPA、ARA、LA和ALA (優(yōu)選EPA)的脂肪酸用于制備預(yù)防和/或治療貓IBD的組合物的用途，該組合物含有約0.05%到約1%的DHA和各占約0.05%到約1%的EPA、ARA、LA和/或ALA。在一些實(shí)施方式中，組合物含有約0.1 %到約0.4 %的DHA和約0.1 %到約0.5 %的EPA、ARA, LA和/或ALA中的一種或多種。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.1 %到約0.2%的DHA和約0.1%到約0.3 %的EPA、ARA、LA和/或ALA中的一種或多種。在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05 %到約0.2 %的DHA和約0.05 %到約0.3 %的EPA、ARA, LA和/或ALA中的一種或多種。進(jìn)一步地在某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05%到約0.15%的DHA和約0.15%到約0.3%的一種或多種脂肪酸。在更進(jìn)一步的某些實(shí)施方式中，組合物含有約0.05%或約0.1%到約0.15%，約0.2%，或約0.4 %的DHA和約0.05%，約0.1%，或約0.15%到約0.2%，約
0.3%，約0.4%，或約0.5%的一種或多種脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，組合物含有食物組合物。
[0033]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 DHA和EPA制備組合物的用途，該組合物含有從約0.05 %到約I %的DHA和約0.05 %到約I %的EPA，其中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為I到2以預(yù)防或治療貓IBD。在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1.2到1.8。在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1.2到1.5。在某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1.3到1.6。在進(jìn)一步的某些實(shí)施方式中，組合物中EPA的量與DHA的量的比例約為1，1.2，或1.3到約為1.5，
1.6，1.8，或約2。在一些實(shí)施方式中，組合物含有食品組合物。
[0034]另一方面，本發(fā)明提供了一種確定貓是否患有IBD的方法。該方法包括將從貓中獲得的血液中采集的淋巴細(xì)胞分成三份含有相同淋巴細(xì)胞數(shù)量的樣品；將第二份樣品接觸一定量的促細(xì)胞分裂劑一段時(shí)間；將第三份樣品在一定量的DHA的存在下接觸與第二份樣品相同量的同一促細(xì)胞分裂劑相同的時(shí)間；比較所有樣品中淋巴細(xì)胞的增殖水平。如果第二份樣品中的淋巴細(xì)胞增殖水平高于第一份樣品中的淋巴細(xì)胞增殖水平，并且第三份樣品中的淋巴細(xì)胞水平低于第二份樣品中的淋巴細(xì)胞增殖水平，則該貓患有IBD。
[0035]從貓中獲得的血液中采集淋巴細(xì)胞，并將其分成含有相同量淋巴細(xì)胞的樣品。從貓中獲得血液，從血液中分離淋巴細(xì)胞，以及計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實(shí)施方式中，淋巴細(xì)胞可用如實(shí)施例1中所述的方法采集。從貓的血液中分離的淋巴細(xì)胞被分成三份或更多份含有相同量淋巴細(xì)胞的樣品。在一些實(shí)施方式中，淋巴細(xì)胞被分成三份樣品(如，第一、第二、第三份樣品)。其中的一份樣品(即，第一份樣品)用來(lái)作為對(duì)照。剩下兩份樣品中的一份(即，第二份樣品)置于一定量的促細(xì)胞分裂劑下一段時(shí)間，另一份樣品(即，第三份樣品)在一定量的DHA的存在下置于與第二份樣品相同量的同樣的促細(xì)胞分裂劑下相同的時(shí)間。所有樣品在相同的溫度下培養(yǎng)同樣的一段時(shí)間。
[0036]促細(xì)胞分裂劑是一種引發(fā)有絲分裂的制劑。能夠引發(fā)貓淋巴細(xì)胞有絲分裂的任意一種促細(xì)胞分裂劑均適用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方式中，促細(xì)胞分裂劑是一種多克隆促細(xì)胞分裂劑。多克隆促細(xì)胞分裂劑是一種能使多種不同特異性或克隆起源的淋巴細(xì)胞有絲分裂的促細(xì)胞分裂劑。本發(fā)明中適于IBD診斷方法的促細(xì)胞分裂劑包括例如植物凝集素(PHA)，伴刀豆球蛋白(ConA)，美洲商陸促細(xì)胞分裂劑(PWM)，脂多糖(LPS)和抗⑶3抗體。
[0037]測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。任一種體外測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖的方法均適用于本發(fā)明的方法。體外淋巴細(xì)胞增殖可直接測(cè)定(如通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)或通過(guò)有絲分裂指數(shù)確定)或間接測(cè)定(如通過(guò)淋巴細(xì)胞群的總體代謝活性率確定或通過(guò)監(jiān)測(cè)脫氧核糖核酸(DNA)的合成來(lái)確定)，在一些實(shí)施方式中，采用實(shí)施例1中所述的方法測(cè)定體外淋巴細(xì)胞增殖。
[0038]本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方式中，淋巴細(xì)胞增殖是通過(guò)監(jiān)測(cè)DNA的合成來(lái)測(cè)定的。監(jiān)控和測(cè)定DNA合成的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。任一種監(jiān)控和測(cè)定DNA合成的方法均適用于本發(fā)明的方法。DNA的合成可通過(guò)例如用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷或5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記有絲分裂活性細(xì)胞的DNA，并確定結(jié)合到DNA中的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷或BrdU的量得以監(jiān)控和測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，采用實(shí)施例1中所述的方法測(cè)定DNA的合成。[0039]正如上面討論的那樣，貓是否患上IBD是通過(guò)比較第一、第二、第三份樣品中體外淋巴細(xì)胞增殖水平來(lái)確定的。如果第二份樣品(即，經(jīng)促細(xì)胞分裂劑處理，但不含DHA的樣品)中的淋巴細(xì)胞增殖水平高于第一份樣品(即，未經(jīng)促細(xì)胞分裂劑或DHA處理的對(duì)照組)中的淋巴細(xì)胞增殖水平，那么該測(cè)定方法中使用的促細(xì)胞分裂劑確實(shí)刺激了第二、第三份樣品中體外淋巴細(xì)胞增殖。若符合上述情況，那么將第三份樣品(即用促細(xì)胞分裂劑和DHA處理的樣品)中的淋巴細(xì)胞增殖水平與第二份淋巴細(xì)胞的增殖水平進(jìn)行比較。如果第三份樣品中的淋巴細(xì)胞水平低于第二份樣品中的淋巴細(xì)胞增殖水平，那么DHA抑制了促細(xì)胞分裂劑的促炎癥作用，表明貓患有IBD。
[0040]此外，本發(fā)明提供了一種套盒形式的用于預(yù)防和/或治療IBD的制品。該套盒包括DHA或本發(fā)明的含DHA的組合物。在某些實(shí)施例中，該套盒還包括抗IBD劑(即該套盒包括一種或多種抗IBD劑)。在某些實(shí)施例中，該套盒進(jìn)一步包括一種或多種的使用說(shuō)明(a)把DHA給予貓，(b)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合給予其DHA，(c)通過(guò)把DHA給予貓，預(yù)防和/或治療IBD，以及(d)通過(guò)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合給予其DHA，預(yù)防和/或治療IBD。
[0041]在某些實(shí)施例中，該套盒包括含有DHA的食品組合物。在某些實(shí)施例中，該套盒進(jìn)一步包括抗IBD劑。在某些實(shí)施例中，該套盒還包括一種或多種的使用說(shuō)明(a)給貓喂食含DHA的食品組合物，(b)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合喂食含DHA的食品組合物，(c)通過(guò)給貓喂食含DHA的食品組合物以預(yù)防和/或治療IBD，以及(d)通過(guò)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合向其喂食含DHA的食品組合物，預(yù)防和/或治療IBD。
[0042]此外，本發(fā)明提供了一種包括兩種或多種組分的套盒形式的制品，當(dāng)所述組分結(jié)合在一起以及任意地與套盒內(nèi)或外的附加組分結(jié)合在一起時(shí)，產(chǎn)生本發(fā)明的適合預(yù)防和/或治療貓IBD的含DHA組合物。要結(jié)合的兩種或多種組分之一可以是例如純DHA或其衍生物或含DHA的組合物。要結(jié)合的兩種或多種組分中的另一組分可以是例如一種食品組合物。如果要制備組合物，需要添加套盒內(nèi)或外的附加組分，套盒將提供關(guān)于這些附加組分的使用說(shuō)明。在某些實(shí)施例中，該套盒進(jìn)一步包括抗IBD劑。在一些實(shí)施例中，該套盒進(jìn)一步包括一種或多種使用說(shuō)明(a)通過(guò)兩種或多種組分的結(jié)合，以及任意地與套盒內(nèi)或外的附加組分結(jié)合，制備該組合物，(b)向貓喂食該組合物，例如用于預(yù)防和/或治療IBD，(c)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合向貓喂食該組合物，(d)通過(guò)向貓喂食該組合物以預(yù)防和/或治療IBD ;以及(e)通過(guò)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合向其喂食該組合物以預(yù)防和/或治療IBD。
[0043]在某些實(shí)施例中，該套盒在適合套盒組分的單一包裝中的分離容器內(nèi)或者虛擬包裝中的分離容器內(nèi)，包含(A) DHA，(B)含DHA的組合物，或者(C)兩種或多種組分，當(dāng)這些組分結(jié)合一起，以及任意地與套盒內(nèi)或外的附加組分結(jié)合一起時(shí)，將產(chǎn)生含DHA的組合物，以及一種或多種(I)至少一種選自EPA，ARA，LA和ALA的脂肪酸，(2) 一種適合對(duì)炎癥性腸病敏感或患有該病的貓食用的食品組合物；(3)—種抗IBD劑，以及(4) 一種或多種以下操作的說(shuō)明(a)制備僅含DHA或者含有與至少一種選自EPA，ARA, LA和ALA的脂肪酸結(jié)合的DHA的組合物，(b)制備一種適合對(duì)炎癥性腸病敏感或患有該病的貓食用的食品組合物，該組合物含有治療有效量的單獨(dú)的DHA或與至少一種選自EPA，ARA, LA和ALA的脂肪酸結(jié)合的DHA。(c)把單獨(dú)的或與至少一種選自EPA，ARA, LA和ALA的脂肪酸結(jié)合的DHA給予貓，以預(yù)防和/或治療IBD，(d)向貓喂食僅包含DHA或包含與至少一種選自EPA，ARA，LA和ALA的脂肪酸結(jié)合的DHA的組合物，以預(yù)防和/或治療IBD，(e)給予貓抗IBD劑，并結(jié)合向其喂食僅包含DHA或包含與至少一種選自EPA，AM’ LA和ALA的脂肪酸結(jié)合的DHA的組合物，以及(f )給予貓抗IBD劑，并結(jié)合向其喂食僅包含DHA或包含與至少一種選自EPA，AM，LA和ALA的脂肪酸結(jié)合的DHA的組合物，以預(yù)防和/或治療IBD。
[0044]術(shù)語(yǔ)“單一包裝”通常意味著套盒組分是實(shí)體聯(lián)系或結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)容器，并被認(rèn)為是制造、分配、銷售或使用上的一個(gè)單元。例如，所述容器包括袋子、盒子、瓶子、熱縮塑料包，用U形釘固定的或其他固定組分及他們的混合。例如，單一包裝可以是實(shí)體聯(lián)合的容器或各個(gè)食品組合物，并被認(rèn)為是制造、分配、銷售或使用上的一個(gè)單元。術(shù)語(yǔ)“虛擬包裝”通常意味著套盒組分通過(guò)在一種或多種實(shí)體或虛擬的套盒組分上的說(shuō)明書(shū)相互聯(lián)系，該說(shuō)明書(shū)教導(dǎo)使用者如何獲取例如在裝有組分的袋子中的附加組分，和教導(dǎo)使用者通過(guò)網(wǎng)絡(luò)、接觸記錄消息、瀏覽可視性訊息，或者是聯(lián)系動(dòng)物看護(hù)者獲取如何使用套盒的說(shuō)明。當(dāng)套盒中包含虛擬包裝時(shí)，該套盒就限制于用一種或多種實(shí)體套盒組分在虛擬環(huán)境中的說(shuō)明。
[0045]此外，本發(fā)明提供了關(guān)于傳達(dá)以下一種或多種操作的信息或說(shuō)明的手段(I)使用DHA或含DHA組合物，以預(yù)防和/或治療貓的IBD，(2)通過(guò)把抗IBD劑給予貓，并結(jié)合向其喂食DHA或含DHA組合物，以預(yù)防和/或治療貓的IBD，以及(3)使用本發(fā)明的套盒用于預(yù)防和/或治療貓IBD，所述手段包括含有所述信息或說(shuō)明的文件、數(shù)字儲(chǔ)存媒介、光貯存媒介、音頻顯示，或可視性顯示。在一些實(shí)施例中，該傳達(dá)手段包括含有所述信息或說(shuō)明的文件、數(shù)字儲(chǔ)存媒介、光貯存媒介、音頻顯示，或可視性顯示。優(yōu)選的，該傳達(dá)手段是可視性的網(wǎng)站或含有所述信息或說(shuō)明的小冊(cè)子，產(chǎn)品標(biāo)簽，包裝插頁(yè)，廣告，或可視性顯示。例如，有用的信息或說(shuō)明包含(I)如何使用本發(fā)明的組合物，方法或套盒的信息或說(shuō)明，以及(2)若動(dòng)物看護(hù)者對(duì)本發(fā)明或其使用方法有疑問(wèn)時(shí)的聯(lián)絡(luò)信息。
[0046]此外，本發(fā)明提供了利用DHA和任選地與至少一種選自EPA，AM，LA和ALA的脂肪酸制備藥物的用途。另外，本發(fā)明還提供了治療有效量的所述脂肪酸在制備適用于預(yù)防和/或治療貓IBD的藥物方面的用途。通常，制備所述藥物是通過(guò)將化合物或組合物與賦形劑、緩沖劑、粘合劑、增塑劑、著色劑、稀釋劑、壓縮劑、潤(rùn)滑劑、香料、潤(rùn)濕劑以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的可用于藥物生產(chǎn)和制備、適合動(dòng)物使用的其他組分混合而制成的。
[0047]本發(fā)明并不局限于本文所述的特定方法、實(shí)驗(yàn)方案以及試劑，因?yàn)樗麄兙勺儎?dòng)。此外，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅為了描述特定的實(shí)施例，并無(wú)意限制該發(fā)明的范圍。除非文中明確指明，本文和附加的權(quán)利要求中的“一”、“一種”以及“該”等單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)，類似的，“含”、“含有”以及“包括”等被解釋為“包含”而不是“專有”。
[0048]除非另有定義，本文所用的科技術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)均與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)理解一致。盡管所有與本文中所述的類似或相同的方法、原料均可用來(lái)實(shí)施本發(fā)明，但本文所描述的均是優(yōu)選的方法、設(shè)備和原料。
[0049]本文所提及的所有專利、專利申請(qǐng)以及公開(kāi)出版物均以法律許可的程度并入本文作為參考文獻(xiàn)，用于描述和公開(kāi)上述參考文獻(xiàn)中公開(kāi)的可用于本發(fā)明的化合物、過(guò)程、技術(shù)、程序、工藝、制品和其他組合物。然而，本文中無(wú)任何內(nèi)容會(huì)被理解為承認(rèn)由于在前發(fā)明的緣故而無(wú)權(quán)居先。
實(shí)施例
[0050]本發(fā)明可通過(guò)以下實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明。除非另有明確說(shuō)明，這些實(shí)施例應(yīng)被理解為僅為說(shuō)明本發(fā)明，而不意味著限制該發(fā)明的范圍。
[0051]實(shí)施例1
該實(shí)施例說(shuō)明了 DHA和EPA對(duì)分別從健康的和患IBD的貓?zhí)崛〉牧馨图?xì)胞在體外淋巴細(xì)胞增殖的影響。
[0052]該實(shí)驗(yàn)使用了十一只健康貓和十一只患IBD的貓?；糏BD的貓的經(jīng)腸部活檢診斷，并患有慢性腹病史。在六周內(nèi)，所有腹的貓均被喂食營(yíng)養(yǎng)充足的干性食品的貓，顯示出腸胃不適。在四、五、六周中， 對(duì)所有貓進(jìn)行抽血。帶有等量淋巴細(xì)胞的樣品將進(jìn)行體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
[0053]更具體地說(shuō)，4.5ml血液與4.5ml HBSS (Hank，s平衡鹽水溶液)+25mM HEPES混合。將4ml的Ficoll-Paque Plus (Amersham)緩慢注入被稀釋的血液之下。對(duì)混合物進(jìn)行20分鐘、500g、25°C的離心分離。棄去上層液體。淋巴細(xì)胞被轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的試管中，并在6ml HBSS+25mM HEPES中再懸浮，隨后進(jìn)行10分鐘、200g、25°C的離心處理。棄去上清液，并用6mlHBSS洗滌淋巴細(xì)胞。離心和洗滌步驟再重復(fù)兩次。洗滌后的淋巴細(xì)胞隨后在5mlAM培養(yǎng)基(Invitrogen)中再懸浮。在100 μ I AM培養(yǎng)基中含有200000個(gè)淋巴細(xì)胞的樣品將被用于淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
[0054]淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)利用Amersham’ s Biotrak細(xì)胞增殖ELISA系統(tǒng)(版本2)進(jìn)行。淋巴細(xì)胞樣品在含有7 μ g/ml PHA(植物血球凝集素)、含有/不含有12.5 μ M和25 μ M DHA或EPA的96孔板上培養(yǎng)40小時(shí)，培養(yǎng)室條件為37°C、5% CO2、濕度90%。隨后，加入20 μ I的100 μ M BrdU，樣品在37°C下培養(yǎng)2小時(shí)。然后，從培養(yǎng)室取出平板，在300g、25°C下離心10分鐘。培養(yǎng)基通過(guò)輕擊和吸干去除，細(xì)胞在化學(xué)通風(fēng)櫥干燥至少15分鐘。在每一個(gè)孔中加入200 μ I固定劑，平板在室溫下培養(yǎng)30分鐘。細(xì)胞固定劑通過(guò)輕擊和吸干去除，在每一個(gè)孔中加入200 μ I封閉緩沖液，平板在室溫下培養(yǎng)30分鐘。封閉緩沖液通過(guò)輕擊和吸干去除，在每一個(gè)孔中加入100 μ I抗-BrdU工作液，平板在室溫下培養(yǎng)90分鐘?？?BrdU溶液通過(guò)輕擊和吸干去除,每個(gè)孔用300 μ I的洗滌液漂洗3次。在每一個(gè)孔中，加入100 μ I的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，培養(yǎng)10分鐘或直到色度達(dá)到要求。加入25 μ I IM硫酸終止反應(yīng)，平板在細(xì)胞融合酶標(biāo)儀(PerkinElmer)上于5分鐘內(nèi)讀數(shù)。體外淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表1和表2。
[0055]表1
DHA對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響
【權(quán)利要求】
1.二十二碳六烯酸在制備適合預(yù)防或治療貓炎癥性腸病的組合物中的用途，其中所述二十二碳六烯酸的量為足以向貓?zhí)峁?至165mg/ kg體重/天的二十二碳六烯酸的治療有效量。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述二十二碳六烯酸的量為足以向貓?zhí)峁?2至65mg/kg體重/天的二十二碳六烯酸的治療有效量。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述的二十二碳六烯酸呈含有二十二碳六烯酸的組合物的形式。
4.權(quán)利要求3的用途，其中組合物包括0.05至0.2%重量的二十二碳六烯酸。
5.權(quán)利要求3的用途，其中所述組合物包括食品，補(bǔ)充劑，治療劑，或者部分或全部可食用的玩具。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述食品是小吃。
7.權(quán)利要求3的用途，其中所述組合物包括干性、半濕或濕性食品。
8.權(quán)利要求1或2的用途，其中進(jìn)一步包括抗炎癥性腸病劑。
9.權(quán)利要求1或2的用途，其中進(jìn)一步包括至少一種選自二十碳五烯酸，花生四烯酸、以及亞油酸的脂肪酸。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述亞油酸是α-亞油酸。
11.權(quán)利要求9的用途，其中每種脂肪酸占所述組合物的0.05%至1%重量。
12.權(quán)利要求9的用途，其中所述的脂肪酸是二十碳五烯酸。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述組合物中二十碳五烯酸與二十二碳六烯酸的重量比例為I至2。
14.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述的組合物進(jìn)一步包括至少一種選自二十碳五烯酸、花生四烯酸和亞油酸的脂肪酸。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述亞油酸是α-亞油酸。
16.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述的組合物是藥物。
17.二十二碳六烯酸和任選的至少一種選自二十碳五烯酸、花生四烯酸以及亞油酸的脂肪酸在制備預(yù)防或治療貓炎癥性腸病的藥物方面的用途，其中所述二十二碳六烯酸的量為足以向貓?zhí)峁?至165mg/ kg體重/天的二十二碳六烯酸的治療有效量。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述二十二碳六烯酸的量為足以向貓?zhí)峁?2至65mg/kg體重/天的二十二碳六烯酸的治療有效量。
19.權(quán)利要求17或18的用途，其中所述亞油酸是α-亞油酸。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK103933021SQ201410161931
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月29日
【發(fā)明者】C.庫(kù), W.D.舍恩赫爾, K.L.格羅斯 申請(qǐng)人:希爾氏寵物營(yíng)養(yǎng)品公司