miR-486-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種miR-486-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的應(yīng)用。miR-486-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞以及一系列肺癌組織臨床樣本中特異低表達(dá)；在H1299細(xì)胞中，過表達(dá)的miR-486a-5p抑制H1299的細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制G1/S轉(zhuǎn)化，把細(xì)胞阻滯在G1期。實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析，miR-486a-5p通過與靶基因mRNA的3′-UTR互補(bǔ)，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶基因的mRNA，另外通過westernblotting等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定CDK4基因?yàn)閙iR-486a-5p的靶基因。本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)CDK4基因?yàn)閙iR-486a-5p的靶基因，該發(fā)明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細(xì)胞肺癌，以及提供藥物靶點(diǎn)方面提供了一定的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】mi R-486-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及miR-486-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]微RNA( microRNA，miRNA )功能調(diào)控是當(dāng)前生命科學(xué)的重要前沿。微RNA(microRNA, miRNA)是一類約22 nt的非編碼小分子RNA，廣泛存在于較高等的真核生物中，大多具有較高的保守性。miRNA作用于特異的mRNA，多使其降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，而有些miRNA則可以激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。成熟的miRNA的5'端第2~?位堿基被稱為“種子序列”，是有效調(diào)控mRNA的關(guān)鍵，miRNA的結(jié)合位點(diǎn)不僅可以是靶基因的3' -UTR，也可以是靶基因的5' -UTR或者⑶S區(qū)域。在哺乳動(dòng)物中，約30%的蛋白質(zhì)編碼基因受到miRNA的調(diào)控。
[0003]肺癌是導(dǎo)致全球癌癥死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬，并且每年新增病例120萬。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常見的癌癥,其中約80%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其5年存活率僅為15%,主要原因是缺乏有效的針對肺癌的早期診斷和治療手段。miRNA通過調(diào)控靶基因mRNA的翻譯，在肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。miRNA可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)記物，有助于疾病的準(zhǔn)確診斷及個(gè)性化治療。這一切設(shè)想的實(shí)現(xiàn)必須建立在miRNA靶基因功能研究工作的基礎(chǔ)上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種miR-486-5p在制備抑制非小細(xì)胞肺癌中H1299細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供一種miR-486-5p在制備抑制非小細(xì)胞肺癌中H1299細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)化藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的之三在于提供一種miR-486-5p在制備靶向下調(diào)H1299細(xì)胞內(nèi)源⑶K4基因表達(dá)水平藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的之四在于提供一種miR-486_5p在制備治療或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌用的組合物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明首先利用Solexa測序技術(shù)，利用qRT_PCR技術(shù)檢測多種非小細(xì)胞肺癌系中miR-486-5p的表達(dá)量變化，并從中選擇一種miR-486_5p表達(dá)下調(diào)最明顯的非小細(xì)胞肺癌系，在此細(xì)胞系中過表達(dá)miR-486-5p以檢測其功能。
[0009]細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipo2000(Invitrogen)。為了降低細(xì)胞密度、試劑用量及轉(zhuǎn)染等因素造成的孔間差異，保證實(shí)驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品設(shè)置了 3個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞時(shí)，每孔接種的細(xì)胞數(shù)量盡量保持一致，并且細(xì)胞在各孔的表面平均分布。
[0010] 細(xì)胞總RNA的提取采用生工生物公司的Trizol試劑。具體提取步驟如下:①直接在培養(yǎng)板中加入TotalRNA Extractor裂解細(xì)胞,每10 cm2面積加I ml TotalRNA Extractor，用移液器吹打混勻；
②將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10min，使得核蛋白與核酸完全分離；
③加入0.2 ml氯仿,劇烈振蕩15 sec,室溫放置3 min。12, 000 rpm 4 °C離心10
min ；
④吸取水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min ；
⑤12,000 rpm 4 °C 離心 10 min,棄上清；
⑥加入Iml 75%乙醇洗漆沉淀，12，000 rpm 4 V離心3 min,棄上清,室溫干燥5-10
min ；
⑦加入30-50μL RNase-free ddH20，充分溶解RNA，將所得到的RNA溶液置于-70 V保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0011]反轉(zhuǎn)錄PCR 米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit。由于miRNA與mRNA不同,miRNA不具有Poly (A)結(jié)構(gòu),但本轉(zhuǎn)錄試劑盒可以同時(shí)對樣品中的miRNA以及它的small non-coding RNA進(jìn)行Poly(A)加尾反應(yīng),然后利用UniversalAdaptor Primer將經(jīng)過加尾的RNA以及mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,并引入U(xiǎn)niniRqPCR Primer的結(jié)合位點(diǎn)，利用這一位置對樣品中任何cDNA進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。用來檢測的儀器為B1-Rad公司的iQ5系統(tǒng)，試劑為TaKaRa公司的SYBR Green Mix。這種試劑里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dye。U6用來作為內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)所用到的引物為:miR-486-5p 引物 Forward:5' - TCCTGTACTGAGCTGCCCCGAG-3 ' , Reverse:為 Un1-miR qPCR primer ;U6 引物為 Forward:5 ' -CTCGCTTCGGCAGCACA- 3' , Reverse:5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3;。
[0012]第二步，利用CCK8技術(shù)和流式細(xì)胞儀技術(shù)，分別檢測過表達(dá)miR-486-5p后H1299細(xì)胞的增殖和周期情況的變化。
[0013]非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞被培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。CO2培養(yǎng)箱中含有5% 0)2并且濕潤，溫度為37°C。為了降低細(xì)胞密度、試劑用量及轉(zhuǎn)染等因素造成的孔間差異，保證實(shí)驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品設(shè)置了 3個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞時(shí)，每孔接種的細(xì)胞數(shù)量盡量保持一致，并且細(xì)胞在各孔的表面平均分布。
[0014]轉(zhuǎn)染步驟如下:①轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的前一天，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至培養(yǎng)板中，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到50%。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一，細(xì)胞生長過度會(huì)削弱細(xì)胞活力，降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率準(zhǔn)備mimic-lipo2000混合液:a.稀釋miRNA mimic:用50 μL不含血清培養(yǎng)基Opt1-MEM稀釋miRNA mimics,使加入細(xì)胞中的終濃度為50 nmol/L,輕輕混勻，室溫孵育5 min ；b.稀釋lipo2000:用50 μL不含血清的Opt1-MEM稀釋I μL lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min ；c.將a與b輕輕混勻，室溫孵育20 min。注意:稀釋好的lipo2000長時(shí)間放置可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染試劑活性的降低，應(yīng)盡量在25 min之內(nèi)與稀釋好的mimics混合。在混合試劑時(shí)，不能劇烈吹打或震蕩，手指輕彈管壁即可，過度用力可能會(huì)破壞脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和miRNA-m imics-lipo2000混合物的形成將miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；④將培養(yǎng)板置于37°C的CO2培養(yǎng)箱中48 h。培養(yǎng)6 h后，將孔里含有mimics-1 ipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基。
[0015]本實(shí)驗(yàn)采用D0JIND0公司的CCK8 (Cell Counting Kit_8)試劑盒。該試劑盒利用了水溶性四銼鹽-WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5- (2，4-二磺基苯)-2H-四銼單鈉鹽)。它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲瓚染料。它在450 nm吸光度下可直接在96孔板中讀出，無需額外處理，由450 nm處吸光度確定的CCK8的量直接與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
[0016]熒光染料碘化丙啶(PI)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色劑，常用于細(xì)胞周期檢測。PI是一種溴化乙錠的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿過活細(xì)胞膜，卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的Gl /GO期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N)，而G2 /M期具有四倍。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。
[0017]第三步，通過Targetscan軟件預(yù)測miR-486-5p的靶基因，并將其mRNA的:V -UTR連接至PGL-3載體。將miR-486-5p與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞，48 h后檢測熒光強(qiáng)度。
[0018]人胚腎細(xì)胞HEK-293T被培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。CO2培養(yǎng)箱中含有5% CO2并且濕潤，溫度為37°C。人胚腎細(xì)胞HEK-293T購自中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫。
[0019]通過查找NCBI數(shù)據(jù)庫，查找到CDK4基因的mRNA序列，進(jìn)而查找到該mRNA的3 ' -UTR序列。查找TargetScan數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)在該mRNA的3 ' -UTR序列的3520-3526位點(diǎn)上含有miR-486-5p種子序列的結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR，將該位點(diǎn)包含在內(nèi)。CDK4-3' -UTR 引物為 Forward:5' - GCTCTAGAGCCATTTCCCTTCTGGACACTG-3' , Reverse:5' - GGAATTCATCTCGGCTCACCGCAACCT-3'。該引物引入了油a I 和&oR I 兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0020]第四步，在H1299細(xì)胞中過表達(dá)miR-486_5p，檢測⑶K4 mRNA水平變化。
[0021]非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299被培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。CO2培養(yǎng)箱中含有5% CO2并且濕潤，溫度為37°C。細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipo2000(Invitrogen)0為了降低細(xì)胞密度、試劑用量及轉(zhuǎn)染等因素造成的孔間差異，保證實(shí)驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品設(shè)置了 3個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞時(shí)，每孔接種的細(xì)胞數(shù)量盡量保持一致，并且細(xì)胞在各孔的表面平均分布。之后提取RNA，利用Takara公司的Primescript RT Master Mix perfect Real Time 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行 qRT-PCR 檢測。用來檢測的儀器為B1-Rad公司的iQ5系統(tǒng)，試劑為TaKaRa公司的SYBR Green Mix。這種試劑里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dye018S rRNA用來作為內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)所用到的引物為:0)K4 引物 Forward:5/ - AATGTTGTACGGCTGATGGA-3' ,Reverse:5' -AGAAACTGACGCATTAGATCCT-3' ;18S 引物 Forward:5' -CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'，Reverse:5/ -TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'。
[0022]定量蛋白采用Lowry法。用⑶K4的多抗進(jìn)行檢測。該抗體為Cell Signal公司生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用12% SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜緩沖液和膜清洗液的配制均參照分子克隆。CDK4蛋白的抗體按照1:800稀釋，Gapdh蛋白的抗體按照1:1000稀釋。所采用的二抗帶有HRP標(biāo)記，按照1:10000稀釋。用Milipore的化學(xué)發(fā)光劑顯色。
[0023]H1299細(xì)胞系中miR-486_5p基因通過與其靶基因CDK4的mRNA的:V -UTR互補(bǔ)，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶mRNA。結(jié)合生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，確定了在H1299細(xì)胞系中miR-486-5p與⑶K4有相互作用，這種相互作用影響了 H1299細(xì)胞的增殖、周期等生命活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)通過軟件預(yù)測、構(gòu)建載體，同時(shí)對靶基因的3' -UTR利用試劑盒進(jìn)行突變，然后在HEK293T細(xì)胞中利用熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證了⑶K4是miR-486-5p的靶基因，并在H1299細(xì)胞中利用qRT-PCR、western blot技術(shù),進(jìn)一步驗(yàn)證了該發(fā)現(xiàn)。所公開的為在H1299細(xì)胞系中⑶K4是miR-486-5p的靶基因的首次報(bào)道，該發(fā)明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細(xì)胞肺癌，以及提供藥物靶點(diǎn)方面提供了一定的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-486_5p的相對表達(dá)含量；
圖2為miR-486-5p在32對肺癌組織臨床樣本中的表達(dá)量；
圖3為過表達(dá)miR-486-5p后抑制H1299細(xì)胞的增殖；
圖4為過表達(dá)miR-486-5p把H1299細(xì)胞抑制在Gl期；
圖5為CDK4是miR-486-5p的靶基因，圖A:miR-486-5p與CDK4野生型和突變型3' -UTR結(jié)合序列示意圖。圖B:雙熒光報(bào)告分析。miR-486-5p家族下調(diào)含有野生型3' -UTR的報(bào)告基因表達(dá)，而對含有突變型3' -UTR的報(bào)告基因表達(dá)沒有影響。圖C:過表達(dá) miR-486_5p 下調(diào) H1299 中 CDK4 的蛋白水平。轉(zhuǎn)染 miR-486_5p 的 mimics,通過 westernblotting檢測CDK4的蛋白含量。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面將結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)例僅用于闡述本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]實(shí)施例一:根據(jù)Solexa測序結(jié)果，確定miR-486_5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中低表達(dá)
本發(fā)明所用到的k-ras基因突變小鼠肺癌模型(L703T2)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化細(xì)胞所季宏斌教授課題組提供。
[0027]將正常小鼠的肺組織和患有非小細(xì)胞肺癌的小鼠的肺組織取樣，用TRIZOL法裂解組織，加入氯仿，待蛋白與核酸分層，離心之后吸取上清并加入異丙醇沉淀，再次離心后以乙醇洗滌沉淀，晾干，獲得總RNA。利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建兩種組織的cDNA文庫，以oligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,通過變性反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄2步獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)的cDNA。
[0028]將樣品利用Solexa方法測序(Solexa測序由華大基因公司完成)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-486-5p的表達(dá)顯著下調(diào)(參見圖1和圖2)。
[0029]實(shí)施例二:miR-486-5p對H1299細(xì)胞增殖的影響將H1299細(xì)胞均勻地鋪在96孔板中，使用的培養(yǎng)基為1640。24 h后將miR-486_5p的mimics通過lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，通過無血清培養(yǎng)液的共孵育后轉(zhuǎn)入H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6h后換掉細(xì)胞培養(yǎng)液，放入新鮮的培養(yǎng)液，然后立即加入CCK8試劑，在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2.5 h，再將溶液轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板，檢測450 nm的吸光度值，每隔24 h測量一次。
[0030]檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組與對照組相比較，其吸光度有顯著的下降，也即轉(zhuǎn)染了miR-486-5p的細(xì)胞的增殖速度顯著低于對照組，說明miR-486_5p具有抑制H1299細(xì)胞增殖的作用(參見圖3)。
[0031]實(shí)施例三:miR-486-5p對H1299細(xì)胞周期的影響
將H1299細(xì)胞均勻地鋪在6孔板中，每個(gè)樣品三次重復(fù)。24 h后轉(zhuǎn)染miR-146a_5p的mimics。48 h后收集細(xì)胞。用PBS洗兩次，70%乙醇固定4°C過夜。PBS洗一次，50 mg/ml的RNase消化I h，室溫。50 mg/ml PI染色30 min，4°C，用流式細(xì)胞儀檢測。(參見圖4)。
[0032]實(shí)施例四:雙熒光素酶報(bào)告基因分析
將CDMmRNA的3' -UTR (533 bp)連接在pGL_3質(zhì)粒上，該質(zhì)粒上含有SV40的啟動(dòng)子，連接上的3' -UTR包含了 miR-486-5p與CDK4的結(jié)合位點(diǎn)。用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑把miR-486-5p的mimics與構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞中，并同時(shí)轉(zhuǎn)入pRL質(zhì)粒作為背景信號(hào)，在轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液換為新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后,用Promega公司的雙突光素酶報(bào)告基因分析試劑盒檢測PGL和pRL的熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的終濃度為400nmol/L，mimics的終濃度為20 nmol/L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了 miR-486_5p的HEK-293T細(xì)胞中雙熒光素酶的表達(dá)顯著低于對照組。之后利用突變試劑盒做了⑶K43' -UTR的點(diǎn)突變，用lip2000轉(zhuǎn)染試劑把miR-486-5p的mimics與構(gòu)建好的點(diǎn)突變質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因分析試劑盒檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了 miR-486-5p的HEK -293T細(xì)胞中雙熒光素酶的表達(dá)與對照組沒有什么變化，這些都說明CDK4是miR-486-5p的靶基因(參見圖5)。
[0033]實(shí)施例五:qRT_PCR驗(yàn)證miR-486_5p對H1299細(xì)胞內(nèi)源CDK4基因的抑制作用
將 H1299 細(xì)胞均勻地鋪在 6 孔板中，24 h 后將 miR-486_5p mimics、NC、miR-486_5pinhibitor、ant1-NC通過lipo2000與無血清培養(yǎng)液1640共孵育后轉(zhuǎn)入H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液換為新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，提取RNA，利用Takara公司試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行qRT-PCR檢測。
[0034]將H1299細(xì)胞均勻地鋪在6孔板中，每個(gè)樣品三次重復(fù)。24h后轉(zhuǎn)染miR-486_5p的mimics。48h后收集、裂解細(xì)胞，并定量各樣品中的⑶K4蛋白含量。qRT-PCR和westernblot結(jié)果表明，miR-486-5p對CDK4具有抑制作用(參見圖5)。
[0035]盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
【權(quán)利要求】
1.一種miR-486-5p在制備抑制非小細(xì)胞肺癌中H1299細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
2.—種miR-486-5p在制備抑制非小細(xì)胞肺癌中H1299細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)化藥物中的應(yīng)用。
3.一種miR-486-5p在制備靶向下調(diào)H1299細(xì)胞內(nèi)源⑶K4基因表達(dá)水平藥物中的應(yīng)用。
4.一種miR-486-5p在制備治療或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌用的組合物或試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104069506SQ201410162165
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】金由辛, 馬中良, 申雨晴, 袁天蔚, 張冰潔, 李艷利, 韋嘉勵(lì) 申請人:上海大學(xué)