一種應(yīng)用帶pcl內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，步驟a，制作PLC內(nèi)核；步驟b，制作帶PCL內(nèi)核PGA/PLA復(fù)合耳支架；步驟c，制作PGA/PLA復(fù)合耳支架；步驟d，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)；步驟e，耳廓支架構(gòu)建軟骨；步驟f，體外構(gòu)建耳廓的裸鼠皮下回植，將軟骨細(xì)胞-耳支架復(fù)合物體外培養(yǎng)1周后分別進(jìn)行裸鼠皮下植入。本發(fā)明應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料可以構(gòu)建組織工程軟骨，具有足夠的強(qiáng)度對(duì)抗植入皮下所帶來的張力從而維持原先復(fù)雜精確的形狀。
【專利說明】—種應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉生物組織領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小耳癥(microtia)是繼唇腭裂之后發(fā)病率最高的體表先天畸形，傳統(tǒng)治療主要以自體肋軟骨移植為主，對(duì)供區(qū)造成極大損傷。理論上講，組織工程技術(shù)至少在以下三個(gè)方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)治療模式:(I)對(duì)病人損傷小，可取少量細(xì)胞擴(kuò)增后構(gòu)建大塊軟骨；(2)構(gòu)建的軟骨有功能，是真正意義上的結(jié)構(gòu)與功能重建；(3)可精確塑形，更符合臨床應(yīng)用需求。
[0003]然而，現(xiàn)有技術(shù)中的體外構(gòu)建的軟骨因力學(xué)性能不足，植入動(dòng)物體內(nèi)后難以克服皮下張力而維持原有形態(tài)。雖然鈦網(wǎng)支撐物輔助移植可解決裸鼠體內(nèi)形態(tài)維持問題，但在大動(dòng)物體內(nèi)會(huì)引發(fā)異物反應(yīng)干擾軟骨再生。
[0004]鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的研究和實(shí)踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，具體過程為:步驟a，制作PLC內(nèi)核；PCL內(nèi)核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)制成的網(wǎng)格狀多孔支架，將網(wǎng)格狀的PCL裁剪成適合大小，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓，待加壓過程中冷卻至室溫后，取出成耳廓型的PCL內(nèi)核，修剪多余材料；
[0007]步驟b，制作帶PCL內(nèi)核PGA/PLA復(fù)合耳支架；
[0008]步驟bl，將長(zhǎng)纖維撕開制成單股PGA無紡棉，將PGA無紡棉均勻的鋪在專用的長(zhǎng)方形盒中，制作成長(zhǎng)方形的小片，每片約150mg，共需2片；
[0009]步驟b2，將上述小片置于耳廓模具中并用無水乙醇浸飽，加壓固定，待無水乙醇揮發(fā)后，耳廓形態(tài)初步穩(wěn)定；
[0010]步驟b3，滴加0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具內(nèi)繼續(xù)加壓塑形，每次滴加PLA溶液前先稱重，待材料約為158-165mg時(shí)即不再滴加PLA溶液，最后得到兩片耳廓形態(tài)PGA/PLA復(fù)合支架；
[0011 ] 步驟b4，將上述耳廓形態(tài)網(wǎng)格狀PCL疊加于上述兩片耳廓形態(tài)PGA支架間，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓冷卻，使微融的PCL與上下兩層PGA/PLA復(fù)合支架緊密粘合；
[0012]步驟b5，取出制備好的帶內(nèi)核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液后于模具中加壓塑形，最終形成具有逼真耳廓形態(tài)的帶內(nèi)核支架；
[0013]步驟c，制作PGA/PLA復(fù)合耳支架；
[0014] 與上述步驟b相同，將長(zhǎng)纖維撕開制成單股PGA無紡棉，制作成長(zhǎng)方形的小片，每片約300mg，滴加1% PLA，待材料約為330mg時(shí)即制備完成，修剪為耳廓形狀備用；
[0015]步驟d，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)；
[0016]步驟dl，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側(cè)耳廓軟骨，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀細(xì)胞，除去胰蛋白酶；
[0017]步驟d2，加入0.15% II型膠原酶，以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化6~8h:
[0018]步驟d3，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基重懸， 所得細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并檢查軟骨細(xì)胞活力，在倒置顯微鏡下血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至IxlOVcm2的濃度接種在IOOmm培養(yǎng)皿上，在37°C，5% CO2,飽和濕度條件下，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至70% -80%融合時(shí)進(jìn)行傳代；
[0019]步驟e，耳廓支架構(gòu)建軟骨；
[0020]將耳廓支架用75 %乙醇消毒后，PBS沖洗3次，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗3次后將支架置于培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)；將第一代(PD兔耳軟骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10%FBS和1%三抗的DMEM培養(yǎng)液重懸至濃度100X 106/ml，等量均勻的接種在兩組支架材料上；
[0021]步驟f，體外構(gòu)建耳廓的裸鼠皮下回植，將軟骨細(xì)胞-耳支架復(fù)合物體外培養(yǎng)I周后分別進(jìn)行裸鼠皮下植入。
[0022]進(jìn)一步，在上述步驟f中，植入時(shí)采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部橫向切開皮膚約2cm，用眼科彎剪在皮下向頭側(cè)分離出腔隙；將細(xì)胞材料復(fù)合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉鉤暴露分離開的腔隙，眼科鑷輕輕夾持組織邊緣，將組織送入到皮下間隙內(nèi)，耳支架凹陷面貼靠皮膚，固定好位置，以5-0尼龍線縫合切口 ；以Imm注射器由皮膚刺入，抽吸空氣，使皮膚和肉膜緊貼細(xì)胞材料復(fù)合物，8周后取材。
[0023]進(jìn)一步，在上述步驟e中，將軟骨細(xì)胞等量均勻的接種在兩組支架材料上，在37°C,5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)4小時(shí)后，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，即10%胎牛血清，1%三抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。
[0024]進(jìn)一步，在上述步驟dl中，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側(cè)耳廓軟骨，仔細(xì)剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊，氯霉素沖洗液沖洗3遍。
[0025]進(jìn)一步，在上述步驟b3中，滴加PLA溶液時(shí)，PLA含量占總PGA/PLA支架的5% -10%。
[0026]進(jìn)一步，在上述步驟b4中，在55_70°C高溫下加熱，I小時(shí)后置于壓力器下200N-500N加壓至模具徹底冷卻。
[0027]進(jìn)一步,在上述步驟a中，網(wǎng)格間距層高0.1mm。
[0028]進(jìn)一步，在上述步驟a中，在55_70°C下，加熱約5_10分鐘后，迅速加壓，壓力為200N-500N。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料可以構(gòu)建組織工程軟骨，具有足夠的強(qiáng)度對(duì)抗植入皮下所帶來的張力從而維持原先復(fù)雜精確的形狀。
[0030]本發(fā)明擬采用的網(wǎng)狀PCL內(nèi)核在構(gòu)建耳廓等特殊形態(tài)軟骨方面具有顯著優(yōu)勢(shì):
(1)該支架可通過三維打印制備，網(wǎng)孔大小，網(wǎng)格厚度等關(guān)鍵參數(shù)均可精確調(diào)控；(2)該支架在常規(guī)加熱(約60°C)加壓的條件下可通過模具精確塑形，冷卻到室溫或體溫后形態(tài)維持不變，顯然有利于耳廓形態(tài)精確控制及維持；(3)在包裹PGA纖維的前提下加熱加壓塑形，則PCL內(nèi)核可與PGA纖維緊密粘連，且網(wǎng)孔部分也能被PGA填充，不會(huì)發(fā)生內(nèi)核與外圍材料脫離的現(xiàn)象。
[0031]此外，接種的細(xì)胞經(jīng)PGA引導(dǎo)能長(zhǎng)入PCL網(wǎng)孔內(nèi)部，經(jīng)體外培養(yǎng)，PGA降解后，所形成的軟骨樣組織不僅充分覆蓋PCL表面，并且也充分長(zhǎng)入其網(wǎng)孔內(nèi)部，形成錨定結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步防止了外圍組織與內(nèi)核材料脫離。
[0032]本發(fā)明構(gòu)建出具有精確形態(tài)并且不隨時(shí)間而變形的組織工程耳廓軟骨，為組織工程入耳向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化探索新的思路與方法。 【具體實(shí)施方式】
[0033]以下，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說明。
[0034]本發(fā)明應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法的具體過程為，
[0035]步驟a，制作PLC內(nèi)核；PCL內(nèi)核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)制成的網(wǎng)格狀多孔支架，本實(shí)施例中，網(wǎng)格間距2mm，層高0.1mm。將網(wǎng)格狀的PCL裁剪成適合大小，置于耳廓模具中加壓固定。在55-70°C下,加熱約5-10分鐘后,迅速加壓,壓力為200N-500N ;待加壓過程中冷卻至室溫后，取出成耳廓型的PCL內(nèi)核，修剪多余材料。
[0036]步驟b，制作帶PCL內(nèi)核PGA/PLA復(fù)合耳支架；
[0037]步驟b I，將長(zhǎng)纖維撕開制成單股PGA無紡棉，將PGA無紡棉均勻的鋪在專用的長(zhǎng)方形盒中，制作成長(zhǎng)方形的小片，每片約150mg，共需2片；
[0038]步驟b2，將上述小片置于耳廓模具中并用無水乙醇浸飽，加壓固定，待無水乙醇揮發(fā)后，耳廓形態(tài)初步穩(wěn)定；
[0039]步驟b3，滴加0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具內(nèi)繼續(xù)加壓塑形，每次滴加PLA溶液前先稱重，待材料約為158-165mg時(shí)即不再滴加PLA溶液，最后得到兩片耳廓形態(tài)PGA/PLA復(fù)合支架；滴加PLA溶液時(shí)，PLA含量占總PGA/PLA支架的5% -10% ;一般來說，不使用PLA或者PLA過少容易使PGA纖維過于蓬松而不利于塑形；但PLA含量過多又容易造成材料過于致密，導(dǎo)致PGA纖維難以充分填充PGL網(wǎng)孔，此外還會(huì)影響PGA/PLA材料的孔隙率、親水性等；一般PLA含量小于20%時(shí)不會(huì)對(duì)材料的生物相容性造成明顯影響。
[0040]步驟b4，將上述耳廓形態(tài)網(wǎng)格狀PCL疊加于上述兩片耳廓形態(tài)PGA支架間，置于耳廓模具中加壓固定，在55-70°C高溫下加熱，I小時(shí)后置于壓力器下200N-500N加壓至模具徹底冷卻，使微融的PCL與上下兩層PGA/PLA復(fù)合支架緊密粘合；
[0041]步驟b5，取出制備好的帶內(nèi)核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液后于模具中加壓塑形，最終形成具有逼真耳廓形態(tài)的帶內(nèi)核支架；同理還可以制作出其他形態(tài)的支架，如圓形、三角形、方形、氣管狀等。
[0042]步驟c，制作PGA/PLA復(fù)合耳支架；
[0043]與上述步驟b相同，將長(zhǎng)纖維撕開制成單股PGA無紡棉，制作成長(zhǎng)方形的小片，每片約300mg，滴加1% PLA，待材料約為330mg時(shí)即制備完成，修剪為耳廓形狀備用。
[0044]步驟d，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)；
[0045]步驟dl，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側(cè)耳廓軟骨，仔細(xì)剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊,氯霉素沖洗液沖洗3遍；加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀細(xì)胞，除去胰蛋白酶；
[0046]步驟d2，加入0.15% II型膠原酶，即NB4，以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化6~8h ；
[0047]步驟d3，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基重懸，所得細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并檢查軟骨細(xì)胞活力，在倒置顯微鏡下血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至IxlOVcm2的濃度接種在IOOmm培養(yǎng)皿上，在37°C，5% CO2,飽和濕度條件下，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至70% -80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。
[0048]步驟e，耳廓支架構(gòu)建軟骨；
[0049]將耳廓支架用75%乙醇消毒后，PBS沖洗3次，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗3次后將支架置于培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)；將第一代(PD兔耳軟骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10%FBS和1%三抗的DMEM培養(yǎng)液重懸至濃度100X 106/ml，等量均勻的接種在兩組支架材料上。在37°C，5% C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)4小時(shí)后，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，即10%胎牛血清，I %三抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。
[0050]步驟f，體外構(gòu)建耳廓的裸鼠皮下回植；
[0051]將軟骨細(xì)胞-耳支架復(fù)合物體外培養(yǎng)I周后分別進(jìn)行裸鼠皮下植入；植入時(shí)采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部橫向切開皮膚約2cm，用眼科彎剪在皮下向頭側(cè)分離出腔隙；將細(xì)胞材料復(fù)合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉鉤暴露分離開的腔隙，眼科鑷輕輕夾持組織邊緣，將組織送入到皮下間隙內(nèi)，耳支架凹陷面貼靠皮膚，固定好位置，以5-0尼龍線縫合切口 ；以Imm注射器由皮膚刺入，抽吸空氣，使皮膚和肉膜緊貼細(xì)胞材料復(fù)合物，8周后取材。
[0052]本發(fā)明在體外構(gòu)建過程中，外圍PGA材料充分降解，并且被接種于其上的軟骨細(xì)胞所分泌的自體軟骨組織替代，因此可有效避免PGA支架引發(fā)的異物反應(yīng)；體外構(gòu)建所形成的是軟骨樣組織，而非單純的細(xì)胞材料復(fù)合物，因此性能更穩(wěn)定，也更利于操作；體外構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)有利于今后利用干細(xì)胞構(gòu)建軟骨，因?yàn)楦杉?xì)胞必須經(jīng)歷體外培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)成熟的軟骨定向分化。
[0053]結(jié)果分析:
[0054]軟骨細(xì)胞與材料
[0055]原代軟骨細(xì)胞一般12~24小時(shí)貼壁，48小時(shí)后完全鋪展開，開始增殖。軟骨細(xì)胞剛剛貼壁時(shí)仍為圓形，逐漸伸展后呈橢圓形、三角形和多角形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形。傳代后軟骨細(xì)胞增長(zhǎng)加速，分裂細(xì)胞多見，大多是多角形，折光性強(qiáng)，一般5至7天左右即可達(dá)到90%以上的融合狀態(tài)，免疫熒光染色細(xì)胞核PI襯染為紅色，表達(dá)有II型膠原的細(xì)胞漿染為綠色。[0056]體外培養(yǎng)I周內(nèi)用倒置像差顯微鏡連續(xù)觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的軟骨細(xì)胞穩(wěn)定地粘附在PGA材料纖維上，并分裂增殖，逐漸分泌細(xì)胞外基質(zhì)。生物相容性檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DNA定量檢測(cè)無差別，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PCL內(nèi)核不影響軟骨細(xì)胞在材料上的粘附。掃描電鏡顯示，兩組材料的細(xì)胞均已已完全鋪展開并形成豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組切面可見PCL內(nèi)核上也有細(xì)胞粘附并分泌基質(zhì)。
[0057]本發(fā)明的PCL-PGA/PLA復(fù)合耳支架，基于該耳支架體外構(gòu)建的耳廓形態(tài)軟骨已獲得成功，并且植入裸鼠體內(nèi)后可長(zhǎng)期維持形態(tài)。以往基于PGA/PLA耳支構(gòu)建的耳廓在裸鼠體內(nèi)無法維持形態(tài)；用鈦網(wǎng)支撐物輔助移植有助于形態(tài)維持，但在大動(dòng)物體內(nèi)可能會(huì)引發(fā)異物反應(yīng)。因此，本發(fā)明采用PCL支架作為內(nèi)核，外圍包裹PGA纖維，再經(jīng)PLA包埋，形成PCL-PGA/PLA復(fù)合耳支架；目前，基于該支架應(yīng)用動(dòng)物軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建耳廓形態(tài)軟骨已獲成功，并且植入裸鼠體內(nèi)后可長(zhǎng)期維持形態(tài)。
[0058]通過延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間，提高體外構(gòu)建軟骨質(zhì)量，解決利用細(xì)胞材料復(fù)合物在免疫動(dòng)物體內(nèi)再生軟骨組織。
[0059]采用10%~20%含量的PLA包埋PGA，既增加支架材料的力學(xué)性能又延緩其降解速率，在體外實(shí)現(xiàn)構(gòu)建產(chǎn)物形態(tài)長(zhǎng)久維持；采用醫(yī)用純鈦內(nèi)支撐網(wǎng)在皮下植入時(shí)輔助維持耳廓形態(tài)；將上述體內(nèi)構(gòu)建的耳廓去除內(nèi)支撐后再植入皮下，形態(tài)可繼續(xù)維持。
[0060]PCL內(nèi)核材料在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建過程中有助于維持耳廓的精確形態(tài)，并且生物相容性好，可形成緊實(shí)的PCL軟骨復(fù)合體。
[0061] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，該具體過程為: 步驟a，制作PLC內(nèi)核；PCL內(nèi)核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術(shù)制成的網(wǎng)格狀多孔支架，將網(wǎng)格狀的PCL裁剪成適合大小，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓，待加壓過程中冷卻至室溫后，取出成耳廓型的PCL內(nèi)核，修剪多余材料； 步驟b，制作帶PCL內(nèi)核PGA/PLA復(fù)合耳支架； 步驟b I，將長(zhǎng)纖維撕開制成單股PGA無紡棉，將PGA無紡棉均勻的鋪在專用的長(zhǎng)方形盒中，制作成長(zhǎng)方形的小片，每片約150mg，共需2片； 步驟b2，將上述小片置于耳廓模具中并用無水乙醇浸飽，加壓固定，待無水乙醇揮發(fā)后，耳廓形態(tài)初步穩(wěn)定； 步驟b3，滴加0.3 % -3 %的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具內(nèi)繼續(xù)加壓塑形，每次滴加PLA溶液前先稱重，待材料約為158-165mg時(shí)即不再滴加PLA溶液，最后得到兩片耳廓形態(tài)PGA/PLA復(fù)合支架； 步驟b4，將上述耳廓形態(tài)網(wǎng)格狀PCL疊加于上述兩片耳廓形態(tài)PGA支架間，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓冷卻，使微融的PCL與上下兩層PGA/PLA復(fù)合支架緊密粘合； 步驟b5，取出制備好的帶內(nèi)核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3 % -3 %的PLA 二氯甲烷溶液后于模 具中加壓塑形，最終形成具有逼真耳廓形態(tài)的帶內(nèi)核支架； 步驟C，制作PGA/PLA復(fù)合耳支架； 與上述步驟b相同，將長(zhǎng)纖維撕開制成單股PGA無紡棉，制作成長(zhǎng)方形的小片，每片約300mg，滴加1% PLA，待材料約為330mg時(shí)即制備完成，修剪為耳廓形狀備用； 步驟d，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)； 步驟dl，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側(cè)耳廓軟骨，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀細(xì)胞，除去胰蛋白酶； 步驟d2，加入0.15% II型膠原酶，以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化6~8h ; 步驟d3，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基重懸，所得細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并檢查軟骨細(xì)胞活力，在倒置顯微鏡下血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至IxlOVcm2的濃度接種在IOOmm培養(yǎng)皿上，在37°C，5% CO2，飽和濕度條件下，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至70% -80%融合時(shí)進(jìn)行傳代；步驟e，耳廓支架構(gòu)建軟骨；將耳廓支架用75 %乙醇消毒后，PBS沖洗3次，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗3次后將支架置于培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)；將第一代(PD兔耳軟骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10% FBS和1%三抗的DMEM培養(yǎng)液重懸至濃度100 X 106/ml，等量均勻的接種在兩組支架材料上；步驟f，體外構(gòu)建耳廓的裸鼠皮下回植，將軟骨細(xì)胞-耳支架復(fù)合物體外培養(yǎng)I周后分別進(jìn)行裸鼠皮下植入。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟f中，植入時(shí)采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部橫向切開皮膚約2cm，用眼科彎剪在皮下向頭側(cè)分離出腔隙；將細(xì)胞材料復(fù)合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉鉤暴露分離開的腔隙，眼科鑷輕輕夾持組織邊緣，將組織送入到皮下間隙內(nèi)，耳支架凹陷面貼靠皮膚，固定好位置，以5-0尼龍線縫合切口 ；以Imm注射器由皮膚刺入，抽吸空氣，使皮膚和肉膜緊貼細(xì)胞材料復(fù)合物，8周后取材。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟e中，將軟骨細(xì)胞等量均勻的接種在兩組支架材料上，在37°C，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)4小時(shí)后，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，即10 %胎牛血清，I %三抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟dl中，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側(cè)耳廓軟骨，仔細(xì)剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊,氯霉素沖洗液沖洗3遍。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟b3中，滴加PLA溶液時(shí)，PLA含量占總PGA/PLA支架的5% -10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟b4中，在55-70°C高溫下加熱，I小時(shí)后置于壓力器下200N-500N加壓至模具徹底冷卻。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟a中，網(wǎng)格間距層高0.1mm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用帶PCL內(nèi)核材料構(gòu)建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟a中，在55-70°C下，加熱約5-10分鐘后，迅速加壓，壓力為200N-500N。
【文檔編號(hào)】A61L27/48GK103948969SQ201410163412
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】周廣東, 劉豫, 曹誼林, 殷宗琦 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司