一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物學(xué)用納米磁性材料的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種納米磁性顆粒，具體為一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體及其制備方法。為核殼型結(jié)構(gòu)，內(nèi)核為磁性材料Fe3O4，中間層為脂質(zhì)體和納米纖維素的混合材料，最外層為包被在中間層上的抗體；其中納米纖維素的質(zhì)量含量為0.1%~50.0%，脂質(zhì)體成分的質(zhì)量含量0.5%~90.0%，磁性材料的質(zhì)量含量0.1%~50.0%，本發(fā)明免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體具有很好的生物相容性，通過(guò)與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原、抗體或核酸等在外加磁場(chǎng)中分離富集迅速，可用于生物材料檢測(cè)和分離純化，在細(xì)胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測(cè)等生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物學(xué)用納米磁性材料的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種納米磁性顆粒，具體為一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫微球技術(shù)(Immunomicrospheres)是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)利用包被有免疫活性物質(zhì)的各種微球進(jìn)行免疫學(xué)或其他生物學(xué)分析分離等方面應(yīng)用的一項(xiàng)技術(shù)。自1956年Singer將人IgG吸附存聚苯乙烯膠乳顆粒上，首次建立檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠乳凝集試驗(yàn)以來(lái)，免疫微球技術(shù)就以其簡(jiǎn)便，高效，實(shí)用的特點(diǎn)，在免疫學(xué)，微生物學(xué)，生物化學(xué)，分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域嶄露頭角。
[0003]免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres, IMMS)或叫做免疫磁性微珠簡(jiǎn)稱免疫磁珠，作為新型的功能材料近年來(lái)已被廣泛研究，其在生物醫(yī)學(xué)及臨床診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了各國(guó)研究者的高度重視。免疫磁性微球是免疫微球的一種，是指連有抗體或抗原的磁性微球，它通過(guò)表面的抗體或抗原特異地與靶物質(zhì)結(jié)合，從而賦予其磁響應(yīng)性，在特定磁場(chǎng)的作用下，通過(guò)免疫磁性微球可以發(fā)生定向移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)其免疫學(xué)檢測(cè)，分離純化，藥物導(dǎo)向等方面的目的。理想的免疫磁性微球應(yīng)具有靈敏性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好以及分離檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]免疫磁性微球是磁性微球與抗體或抗原結(jié)合的產(chǎn)物。磁性微球的范圍廣泛,包括常用的磁性高分子微球、磁性脂質(zhì)體、磁性膠束等；而磁性脂質(zhì)微球是通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ怪|(zhì)體與無(wú)機(jī)物結(jié)合 起來(lái)形成具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球，其表面可比較容易的賦予多種反應(yīng)性功能基團(tuán)，如-OH，-COOH和-NH2等，使其具有良好的生物相容性，通過(guò)與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原、抗體或核酸等，然后可在外加磁場(chǎng)中進(jìn)行分離富集。因此，磁性脂質(zhì)微球(劉信等，磁性脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用)在細(xì)胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測(cè)等生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]但是，目前存在的免疫磁性微球還存在許多問(wèn)題，如卵磷脂/膽固醇磁性脂質(zhì)體、免疫海藻酸鈉磁性脂質(zhì)體、PLGA磁性脂質(zhì)體等。首先，免疫磁性微球中抗體接枝率較低、活性較難維持。主要原因?yàn)?，利用磁性微球表面存在的活性基團(tuán)進(jìn)行改性，溫度較高，時(shí)間較長(zhǎng)，容易降低抗體的活性。再次，所制備的免疫磁性微球普遍穩(wěn)定性不足，容易發(fā)生團(tuán)聚；樣品存放半年后，均容易發(fā)生結(jié)塊。如，博士論文(華中科技大學(xué)，李青，2007年)中的免疫磁性海藻酸鈉微球使用的是反相微乳-包埋的方法，所用的材料包含磁粉，海藻酸鈉和表面活性劑琥鉬酸二異辛脂磺酸鈉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明在于提出一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，以及該免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，為核殼型結(jié)構(gòu)，內(nèi)核為磁性材料Fe3O4，中間層為脂質(zhì)體和納米纖維素的混合材料，最外層為包被在中間層上的抗體；其中納米纖維素的質(zhì)量含量為0.1%~50.0%，脂質(zhì)體成分的質(zhì)量含量0.5%~90.0%，磁性材料的質(zhì)量含量0.Ρ/50.0%。
[0008] 所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的粒徑為IOnm至lOOOOnm，優(yōu)選為50nm~500nmo
[0009]所述的抗體為單克隆抗體；所述的納米纖維素包含羧甲基纖維素、氨基化納米纖維素和羧基化納米纖維素。
[0010]所述的脂質(zhì)體的成分包括下述質(zhì)量百分比的組分:卵磷脂0.1%~50.0%、膽固醇
0.1%~50.0%, DSPE-PEG 0.1%~40.0%、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽0.0%~40.0%。
[0011]本發(fā)明免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟:
a.使用含有氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE— PEG)與抗體反應(yīng)制備抗體前體物DSPE - PEG 一抗體；
b.用薄膜分散法制備納米纖維素磁性脂質(zhì)體:具體為將卵磷脂、膽固醇、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽和油溶性磁性納米顆?；旌先苡谟拖嗦确轮校跤?0-40分鐘，放入茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成脂質(zhì)體；
c.將形成的脂質(zhì)體與含有納米纖維素和抗體前體物DSPE- PEG 一抗體的水溶液混合水化，并超聲，即可得免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，即免疫納米纖維素/脂質(zhì)體復(fù)合磁性微球。
[0012]上述步驟a是將含有氨基或羧基的DSPE — PEG與單克隆抗體混合，加入縮合劑反應(yīng)0.5至48小時(shí)，透析除去未反應(yīng)的縮合劑。
[0013]所述DSPE — PEG與縮合劑的質(zhì)量比是1:0.01~10 ;所述的DSPE — PEG與所用抗體的質(zhì)量比是1: 0.01~2。
[0014] 所述縮合劑是1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N，N’-羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶、N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種。
[0015]本發(fā)明的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法，還包含如下:先用薄膜分散法制備納米纖維素磁性脂質(zhì)體；然后將表面帶氨基活性基團(tuán)的納米纖維素磁性脂質(zhì)體與抗體通過(guò)縮合劑連接。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:
本專利的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，含有Fe3O4超順磁性納米顆粒，納米纖維素，脂質(zhì)體成分(卵磷脂、膽固醇、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽、DSPE-PEG-抗體)。采用脂質(zhì)體的薄膜分散法制備。
[0017]將磁性脂質(zhì)體與納米纖維素復(fù)合制備免疫磁珠，納米纖維素的加入可提高磁性脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，同時(shí)可提供反應(yīng)的官能團(tuán)羧基。在納米纖維素/脂質(zhì)體免疫磁珠中加入高分子表面活性劑羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽，羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽的使用可減少磁球的團(tuán)聚，降低磁球的粒徑。在納米纖維素/脂質(zhì)體免疫磁珠的抗體修飾過(guò)程中，采用先制備抗體前體物DSPE - PEG 一抗體，再與脂質(zhì)成分復(fù)合的方法，前體物的使用可較高的維持抗體的活性。
[0018]該免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體具有很好的生物相容性，通過(guò)與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原、抗體或核酸等，在外加磁場(chǎng)中分離富集迅速，可用于生物材料檢測(cè)和分離純化，在細(xì)胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測(cè)等生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。如制備的抗-EpCAM抗體修飾的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體可進(jìn)行外周血中腫瘤(乳腺癌)細(xì)胞的抓捕和富集，然后將富集的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫染色分析計(jì)數(shù)，就可以指導(dǎo)臨床進(jìn)行個(gè)體化用藥方案的評(píng)估。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例1采用抗體前體物制備免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體
(I)將5.0mgDSPE 一 PEG-NH2與1.0mg抗-EpCAM單克隆抗體混合，加入濃度為1.0mg/mL的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL) 5.0mL中反應(yīng)24小時(shí)，8000-10000分子量透析袋透析除去未反應(yīng)的縮合劑；凍干后得抗體前體物DSPE — PEG 一EpCAM。
[0021](2)用薄膜分散法制備免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體。將卵磷脂10.0mg、膽固醇
6.0mg、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽2.0mg和油溶性磁性納米顆粒3.0mg混合溶于10.0mL油相氯仿中，孵育20分鐘以上，放入茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成脂質(zhì)膜；
(3)將形成的脂質(zhì)膜與含有2.0mg納米纖維素(棒狀)和2.0mgDSPE 一 PEG- EpCAM的水溶液混合水化，并超聲，即可得免疫抗-EpCAM單克隆抗體納米纖維素/脂質(zhì)體復(fù)合磁性微球。
[0022]實(shí)施例2納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備
將卵磷脂5.0mg、膽固醇2.0mg、DSPE-PEG-NH2 1.0mg和油溶性磁性納米顆粒1.0mg共溶于二氯甲烷中；混勻作為有機(jī)相，除去有機(jī)溶劑使成薄膜，然后加入含有羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽(濃度0.3mg/mL)和羧甲基纖維素的水相5.0mL (納米纖維素濃度0.5mg/mL)使脂質(zhì)膜水化，水相為0.9%的生理鹽水或pH=5至9的緩沖溶液，水化時(shí)超聲30min以上，然后磁分離3次以上備用。
[0023]實(shí)施例3免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備
取固含量為20%，粒徑5(T100nm的氨基化納米纖維素磁性脂質(zhì)體(卵磷脂/膽固醇/納米纖維素/DSPE-PEG-Nh2)溶液1.0mL與含有2.0mg抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)單克隆抗體的溶液ImL混合，加入5mg的1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，混合均勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48小時(shí)后，磁分離洗滌后備用，所制備的免疫磁性脂質(zhì)體當(dāng)中磁珠與所含的單克隆抗體的重量百分比為25:1，其可放置在水與乙醇的混合溶液(乙醇的重量為20%)中保存。本實(shí)施例可擴(kuò)展為固含量為0.5%-30%的氨基或羧基化磁珠。
[0024]實(shí)施例4免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備
取固含量為20%，粒徑30(T500nm的羧基化納米纖維素磁性脂質(zhì)體(卵磷脂/膽固醇/納米纖維素/DSPE-PEG-C00H)溶液1.0mL與含有2.0mg抗表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growthfactor, EGF)單克隆抗體的溶液1.0mL混合,加入5.0mg的二環(huán)己基碳二亞胺，混合均勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)后，磁分離洗滌后備用，所制備的免疫磁性脂質(zhì)體當(dāng)中磁珠與所含的單克隆抗體的重量百分比為50:1，其可放置在水與乙醇的混合溶液(乙醇的重量為10%)中保存。本實(shí)施例可擴(kuò)展為使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N，N’’-羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4- 二甲氨基吡啶或N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種縮合劑。
[0025]實(shí)施例5免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備
取固含量為20%，粒徑1000nm的不含有氨基或羧基化納米纖維素磁性脂質(zhì)體(卵磷脂/膽固醇/納米纖維素)溶液1.0mL與含有2.0mg抗表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)單克隆抗體的溶液1.0mL混合,充分振蕩混合均勻，室溫孵化48小時(shí)后，磁分離洗滌后備用，所制備的EGFR單克隆抗體修飾的磁珠當(dāng)中磁珠與所含的EGFR單克隆抗體的重量百分比為200:1。本實(shí)施例可擴(kuò)展為使用其它種類的抗體或抗原來(lái)制備免疫磁性脂質(zhì)體。
[0026]實(shí)施例6提供抗-EpCAM免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的應(yīng)用
取濃度為2.0mg/mL的抗-EpCAM免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體40微升，與乳腺癌患者穿刺液300微升混合，加入1.0mLPBS (0.lmol/L)混合振蕩孵育30分鐘；孵育后磁分離，并水洗3次，收集穿刺液中的乳腺癌細(xì)胞；最后，可將收集到的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，并計(jì)數(shù)分析，同時(shí)可進(jìn)行基因及細(xì)胞水平的分析。
[0027]上述實(shí)施例僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見(jiàn) 的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【權(quán)利要求】
1.一種免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，為核殼型結(jié)構(gòu)，內(nèi)核為磁性材料Fe3O4，中間層為脂質(zhì)體和納米纖維素的混合材料，最外層為包被在中間層上的抗體；其中納米纖維素的質(zhì)量含量為0.1%-50.0%，脂質(zhì)體成分的質(zhì)量含量0.5%-90.0%，磁性材料的質(zhì)量含量0.1%-50.0%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，其特征在于，所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的粒徑為IOnm至1000Onm,優(yōu)選為50nm-500nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，其特征在于，所述的抗體為單克隆抗體；所述的納米纖維素包含羧甲基纖維素、氨基化納米纖維素和羧基化納米纖維素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，其特征在于，所述的脂質(zhì)體的成分包括下述質(zhì)量百分比的組分:卵磷脂0.1%-50.0%、膽固醇0.1%-50.0%、DSPE-PEG0.1%-40.0%、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽0.0%-40.0%。
5.如權(quán)利要求1所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟: a.使用含有氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE— PEG)與抗體反應(yīng)制備抗體前體物DSPE - PEG 一抗體； b.用薄膜分散法制備免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體:具體為將卵磷脂、膽固醇、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽和油溶性磁性納米顆?；旌先苡谟拖嗦确轮校跤?0-40分鐘，放入茄形瓶中，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)成脂質(zhì)體； c.將形成的脂質(zhì)體與含有納米纖維素和抗體前體物DSPE- PEG 一抗體的水溶液混合水化，并超聲，即可得免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體，即免疫納米纖維素/脂質(zhì)體復(fù)合磁性微球。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，步驟a是將含有氨基或羧基的DSPE - PEG與單克隆抗體混合，加入縮合劑反應(yīng)0.5至48小時(shí)，透析除去未反應(yīng)的縮合劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述DSPE - PEG與縮合劑的質(zhì)量比是1:0.01-10 ;所述的DSPE — PEG與所用抗體的質(zhì)量比是I:0.01_2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述縮合劑是1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N, N’ -羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶、N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種。
9.如權(quán)利要求1所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體的制備方法， 為如下步驟:先用薄膜分散法制備納米纖維素磁性脂質(zhì)體；然后將表面帶氨基活性基團(tuán)的納米纖維素磁性脂質(zhì)體與抗體通過(guò)縮合劑連接。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的免疫納米纖維素磁性脂質(zhì)體在生物材料檢測(cè)和分離純化中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/02GK103961703SQ201410164928
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】穆海東, 汪寧梅, 梁曉飛 申請(qǐng)人:上海裕隆醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所股份有限公司