靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的tlr4復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物及其制備方法和在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。該復(fù)合物由Q9肽（QQQKKKKKK）和T9肽（LTQQVVMKF）的融合肽與TLR4RNAi通過(guò)靜電作用結(jié)合而成，該復(fù)合物可利用Q9肽的導(dǎo)向作用，特異靶向小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性CX3CR1受體，在T9肽與CX3CR1受體作用的同時(shí)，TLR4RNAi高效轉(zhuǎn)染入小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦出血后的炎癥反應(yīng)，可用于制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的抗炎藥物，在腦出血的治療領(lǐng)域有著良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種多肽-基因復(fù)合物，具體涉及一種靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物及其制備方法和在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腦出血是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)危重癥，因其高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率而受到廣泛關(guān)注。隨著人民生活水平的提高及老齡化的到來(lái)，腦出血發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。大量研究表明，腦出血后存在明顯的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)參與了腦出血后繼發(fā)性腦水腫和腦損害等病理過(guò)程。ICH后血腫周?chē)∧z質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活，釋放TNF-α、IL-1等致炎因子，加之血腦屏障破壞，外周血單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向血腫周邊區(qū)聚集，由此誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)功能缺損加劇。
[0003]Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類(lèi)介導(dǎo)天然免疫的古老受體,通過(guò)識(shí)別外源性配體(PAMPs，如細(xì)菌、真菌、病毒等)和內(nèi)源性配體(DMAPs，機(jī)體損傷相關(guān)分子)，并通過(guò)下游的接頭信號(hào)分子MyD88或TRIF活化，導(dǎo)致NF- κ B的激活，產(chǎn)生大量的炎癥因子，在天然免疫中具有重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)腦出血后由血腫成分血紅蛋白(Hb)及代謝產(chǎn)物血紅素(Heme)通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4受體，繼之通過(guò)下游信號(hào)分子MyD88或TRIF活化，導(dǎo)致NF-κ B的激活，產(chǎn)生大量諸如IL-UTNF-a、IL_6的炎癥因子，產(chǎn)生炎癥損傷，最終導(dǎo)致ICH繼發(fā)性神經(jīng)功能缺損加重。因此，如果能發(fā)現(xiàn)通過(guò)TLR4靶向抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的藥物，將會(huì)為腦出血的炎癥損傷帶來(lái)新的治療策略。
[0004]CX3C趨化因子受體I (CX3CR1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，其特異性配體CX3CL1屬于CX3C家族的δ類(lèi)趨化因子，主要由神經(jīng)元分泌。CX3CL1通過(guò)CX3CR1受體可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的趨化、增殖、存活，細(xì)胞內(nèi)鈣水平的升高以及細(xì)胞因子和金屬蛋白酶的分泌，這些反應(yīng)能被抗CX3CR1抗體阻止。因此，如果能夠有效干擾CX3CR1受體的表達(dá)，則理論上可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生或惡化。
[0005]RNA干擾(RNA interference, RNAi)是大多數(shù)真核生物體內(nèi)一種調(diào)控基因表達(dá)的方式，主要通過(guò)小干擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)特異性地沉默靶基因的表達(dá)，具有高效性、特異性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、藥物靶點(diǎn)篩選、基因治療等研究領(lǐng)域。因此，可以利用RNAi技術(shù)干擾CX3CR1受體的表達(dá)。但RNAi技術(shù)也面臨一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，就是如何將siRNA有效地傳遞進(jìn)入靶細(xì)胞。由于siRNA容易被核酸酶降解且真核細(xì)胞不易攝取外源性的裸露核酸，直接用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率低下，因此，必須選擇適當(dāng)?shù)妮d體包裹siRNA，以免siRNA降解并且能夠輔助siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0006]US28是人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)編碼的四個(gè)七次跨膜趨化因子受體之一，具有廣譜趨化因子結(jié)合活性，在結(jié)構(gòu)上與人源CX3CR1受體的同源性最高。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于US28受體N末端的誘惑配體多肽T9可以阻斷人源CX3CR1受體結(jié)合生理性趨化因子形成的趨化作用，但其本身不引起趨化運(yùn)動(dòng)，不影響胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞自然活性；其能夠引起細(xì)胞表面受體CX3CR1內(nèi)化，但內(nèi)化的受體部分能夠再循環(huán)到細(xì)胞表面，對(duì)人源CX3CR1受體的生理功能沒(méi)有明顯影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種TLR4復(fù)合物，該復(fù)合物可以特異靶向小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生或惡化。
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物，由Q9肽和T9肽的融合肽與TLR4通過(guò)靜電作用結(jié)合而成，所述Q9肽的氨基酸序列為QQQKKKKKK，所述T9肽的氨基酸序列為L(zhǎng)TQQVVMKF。 [0009]進(jìn)一步，所述Q9肽和T9肽的融合肽由Q9肽的羧基端和T9肽的氨基端直接連接--? 。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的制備方法，是在渦旋條件下，向含有TLR4 RNAi和氯化鈉的水溶液中滴加Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴畢，繼續(xù)渦旋30-60分鐘，再靜置30-60分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物。
[0011]進(jìn)一步，所述TLR4 RNAi與Q9肽和T9肽的融合肽的質(zhì)量比為1:1。
[0012]進(jìn)一步，所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的制備方法是在渦旋條件下，向含有濃度為200 μ g/mL的TLR4 RNAi和濃度為lmg/mL的氯化鈉的水溶液中，滴加等體積濃度為200 μ g/mL的Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴加完畢后，繼續(xù)渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物。
[0013]本發(fā)明還提供了所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物在制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0014]進(jìn)一步，所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物在制備治療腦出血的藥物中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:Q9肽為帶正電荷的短肽，可通過(guò)電性中和作用與帶負(fù)電荷的TLR4 RNAi聚合形成致密顆粒，提高細(xì)胞對(duì)TLR4 RNAi的攝取率，增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。CX3CR1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，來(lái)源于US28受體N末端的誘惑配體多肽T9可以阻斷人源CX3CR1受體結(jié)合生理性趨化因子形成的趨化作用，但其本身不引起趨化運(yùn)動(dòng)，不影響胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞自然活性。本發(fā)明所述TLR4復(fù)合物可通過(guò)T9肽的導(dǎo)向作用，特異靶向小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性CX3CR1受體，在T9肽與CX3CR1受體作用的同時(shí)，TLR4 RNAi高效轉(zhuǎn)染入小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的發(fā)生或惡化，可用于制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的藥物，在腦出血治療領(lǐng)域有著良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為透射電鏡鑒定TLR4復(fù)合物。
[0017]圖2為T(mén)LR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后細(xì)胞因子的分泌水平。
[0018]圖3為T(mén)LR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力。
[0019]圖4為T(mén)LR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腦出血小鼠腦組織含水量。
[0020]圖5為T(mén)LR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腦出血小鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分?！揪唧w實(shí)施方式】
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
[0022]一、靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的制備 1、Q9肽和T9肽的融合肽Q9-T9的制備 融合肽Q9-T9由Q9肽的羧基端與T9肽的氨基端直接連接而成，氨基酸序列為QQQKKKKKK LTQQVVMKF。融合肽Q9-T9的合成在AB-431A型多肽合成儀上進(jìn)行，采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案。以0.25mmol對(duì)羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)樹(shù)脂為起始樹(shù)脂，按照融合肽Q9-T9的氨基酸序列，使肽鏈自羧基端向氨基端逐個(gè)延伸，肽鏈合成完畢后，將含有肽鏈的樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去離子水0.25mL組成)中，室溫下攪拌反應(yīng)使肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，然后用G6玻砂漏斗過(guò)濾，收集濾液，室溫下低壓蒸干，殘余物用去離子水溶解后，用AeKTA explorer 100型中壓液相色譜儀進(jìn)行純化，色譜柱為C18柱,流動(dòng)相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸水溶液,流動(dòng)相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元線(xiàn)性梯度洗脫，流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)在0-15分鐘內(nèi)由10%上升至50%，流速為lmL/min，收集融合肽Q9-T9的洗脫液，冷凍干燥，即得融合肽Q9-T9，用去離子水溶解制成濃度為3mg/mL的溶液，用孔徑為0.20 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌，_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0023]取融合肽Q9-T9的洗脫液，用Delta 600型反相高壓液相色譜儀進(jìn)行純度鑒定，色譜柱為Symmetry C18柱，流動(dòng)相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元線(xiàn)性梯度洗脫，流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)在0-15分鐘內(nèi)由10%上升至60%，流速為lmL/min。結(jié)果經(jīng)峰面積歸一化法計(jì)算，融合肽Q9-T9的純度為98%。另取融合肽Q9-T9的洗脫液，用API 2000 LC/MS/MS型質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量鑒定，結(jié)果顯示，融合肽Q9-T9的分子量實(shí)測(cè)值與理論值相符。
[0024]2、TLR4復(fù)合物的制備
TLR4RNAi的核苷酸序列為:5’ -ACGUGCACUUGUGGGUCCA-3’。于室溫、渦旋條件下，向100 μ L含有濃度為500 μ g/mL的TLR4和濃度為lmg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100 μ L濃度為500 μ g/mL的融合肽Q9-T9溶液，滴加速度為5 μ L/min，滴加完畢后，于室溫下繼續(xù)渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得TLR4復(fù)合物。
[0025]將新鮮制備的TLR4復(fù)合物滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，用吸水紙吸干，晾干30秒，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸鈾水溶液負(fù)染30秒，用吸水紙吸干，晾干30秒，SOkV透射電鏡觀(guān)察。結(jié)果如圖1所示，所得TLR4復(fù)合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長(zhǎng)徑小于 25nm。
[0026]同時(shí)，按照上述相同方法，以陰性對(duì)照OVA RNAi (5’ -ACUUGUGGACGUGCGUCCA-3’)替代TLR4RNAi，制得陰性對(duì)照復(fù)合物。
[0027]二、靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的活性測(cè)試
1、TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞將小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2于6孔板內(nèi)單層培養(yǎng)至覆蓋面積約30%，換入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基2mL，并加入TLR4復(fù)合物100 μ L，培養(yǎng)4小時(shí)，再換入完全DMEM培養(yǎng)基2mL，培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸，獲得TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0028]同時(shí)，按照上述相同方法，采用陰性對(duì)照復(fù)合物，獲得陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0029]另外，分別將TLR4復(fù)合物和陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染少突膠質(zhì)細(xì)胞HO，作為無(wú)關(guān)細(xì)胞對(duì)照。
[0030]2、ELISA檢測(cè)TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后細(xì)胞因子的分泌水平
設(shè)置空白組(正常小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2)、對(duì)照組(陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞)。取各組細(xì)胞，以4X IO5/孔種植于24孔板中，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物至終濃度為10μ g/mL，刺激24小時(shí)，之后棄去含紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)液并洗滌細(xì)胞2次，再加入DMEM培養(yǎng)基lmL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒測(cè)定白細(xì)胞介素-1 β (IL-Ιβ )和腫瘤壞死因子α (TNF-α)的含量。結(jié)果如圖2所示，TLR4復(fù)合物可以明顯降低紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1 β和TNF-a的水平。
[0031]3、用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力
設(shè)置空白組(正常小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2)、對(duì)照組(陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞)。先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線(xiàn)，大約每隔0.5-lcm—道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線(xiàn)。在空中加入約5X105個(gè)細(xì)胞，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物至終濃度為10μ g/mL，刺激24小時(shí)，之后棄去含紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)液并洗滌細(xì)胞2次，再加入DMEM培養(yǎng)基lmL，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過(guò)夜能鋪滿(mǎn)。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線(xiàn)劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。放入37度5%co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按24小時(shí)取樣觀(guān)察0.4mm2內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)。結(jié)果如圖3所示，TLR4復(fù)合物可以明顯降低紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力。
[0032]4.干濕重法測(cè)量TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腦出血小鼠腦組織含水量
將各組小鼠于大腦的基底節(jié)注射30 μ L的全血。I小時(shí)候，在血腫周?chē)俅巫⑸? μ LTLR4復(fù)合物及對(duì)照。術(shù)后24h快速處死小鼠。取出小鼠大腦，沿正中線(xiàn)對(duì)半切開(kāi)。取出受損處大腦半球，迅速稱(chēng)重，記錄。將大腦半球放入100°C烘烤24h至恒重，稱(chēng)重，記錄。計(jì)算含水量，公式為:大腦組織含水量百分比=(濕重-干重)/濕重X100%。結(jié)果如圖4所示，TLR4復(fù)合物可以明顯降低腦出血后的腦水腫。
[0033]5、TLR4復(fù)合物轉(zhuǎn)染的腦出血小鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分
將 各組小鼠于大腦的基底節(jié)注射30 μ L的全血。I小時(shí)候，在血腫周?chē)俅巫⑸? μ LTLR4復(fù)合物及對(duì)照。3天后，根據(jù)Garcia法對(duì)小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。具體指標(biāo)為:1.自主運(yùn)動(dòng)2.四肢活動(dòng)對(duì)稱(chēng)性3.前肢的對(duì)稱(chēng)性4.爬籠壁5.推軀干反應(yīng)6.觸須對(duì)刺激反應(yīng)。在上述指標(biāo)中，無(wú)活動(dòng)或反應(yīng)分；少許活動(dòng):1分；反應(yīng)較差:2分；正?；顒?dòng):3分。分別由2人同時(shí)對(duì)各組進(jìn)行測(cè)定。如圖5所示，TLR4復(fù)合物可以明提高腦出血后的神經(jīng)功能。
[0034]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和 范圍。
【權(quán)利要求】
1.靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物，其特征在于，由Q9肽和T9肽的融合肽與TLR4RNAi通過(guò)靜電作用結(jié)合而成，所述Q9肽的氨基酸序列為QQQKKKKKK，所述T9肽的氨基酸序列為L(zhǎng)TQQVVMKFo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物，其特征在于，所述Q9肽和T9肽的融合肽由Q9肽的羧基端和T9肽的氨基端直接連接而成。
3.權(quán)利要求1或2所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的制備方法，其特征在于，在渦旋條件下，向含有TLR4 RNAi和氯化鈉的水溶液中滴加Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴畢，繼續(xù)渦旋30-60分鐘，再靜置30-60分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述TLR4 RNAi與Q9肽和T9肽的融合肽的質(zhì)量比為1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的制備方法，其特征在于，在渦旋條件下，向含有濃度為100 μ g/mL的TLR4 RNAi和濃度為lmg/mL的氯化鈉的水溶液中，滴加等體積濃度為200 μ g/mL的Q9肽和T9肽的融合肽溶液，滴加完畢后，繼續(xù)渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物。
6.權(quán)利要求1或2所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物在制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于:所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4復(fù)合物在制備治療腦出血的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103933580SQ201410176829
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】袁邦清, 楊曌, 沈漢超, 吳賢群, 陳羽建, 林立 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院四七六醫(yī)院