一種氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物的制備方法，通過制備脫脂腦漿、胃蛋白酶酶解、胰酶酶解、配液濃縮得到腦蛋白水解物組合物。該組合物不補加外源氨基酸，氮含量達到6～20mg/mL，并含有適宜的輔料，在保證高氮含量的同時，能防止天然腦蛋白水解物溶液產(chǎn)生不溶物，保證相似度大于0.9。本發(fā)明提供的方法及組合物符合國家標準，能達到生產(chǎn)凍干粉針的制劑要求。
【專利說明】一種氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高氮含量的天然腦蛋白水解物組合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腦蛋白水解物是用豬腦蛋白經(jīng)酶水解所制得的特異性氨基酸混合物，無蛋白質(zhì)，含有多種人體必需氨基酸、非必需氨基酸、活性多肽、唾液酸等，為天然全提取，無任何外添加物。
[0003]上世紀70年代，腦蛋白水解物最早由奧地利EBEWE藥廠以CerebroIysin(施普善)為商品名出售。1995年，國家衛(wèi)生部批準國內(nèi)生產(chǎn)腦蛋白水解物注射液，但是國內(nèi)現(xiàn)有制備方法得到的腦蛋白水解物中氮含量偏低，達不到國家規(guī)定的標準。眾多腦蛋白水解物產(chǎn)品需要通過補加外源性氨基酸來達到國家規(guī)定的標準。為此，國家藥監(jiān)辦【2008】734號文件要求腦蛋白水解物不得補加外源性氨基酸。另外，2012年7月20日國家藥典委員會發(fā)布《關(guān)于腦蛋白水解物系列品種質(zhì)量標準修訂稿征求意見的通知》(國藥典化發(fā)2012[2012]400號)，所附標準明確規(guī)定了腦蛋白水解物系列品種生產(chǎn)過程中也不得添加非水解產(chǎn)物，如各種氨基酸。
[0004]目前，在不補加外源性氨基酸的情況下，可通過濃縮來提高腦蛋白水解物的氮含量，但濃縮液不穩(wěn)定，會產(chǎn)生沉淀，并導(dǎo)致相似度下降，不符合國家規(guī)定，也達不到生產(chǎn)凍干粉針劑要求。
[0005]因此，有必要研發(fā)一種符合上述技術(shù)要求的制備方法，使天然腦蛋白水解物氮含量高且穩(wěn)定，以達到制劑生產(chǎn)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決目前生產(chǎn)的天然腦蛋白水解物含氮量低、不穩(wěn)定等問題，本發(fā)明提供一種氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物的制備方法。
[0007]本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn):一種氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟:
(O取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，加豬腦質(zhì)量的2~4倍的水，加熱至80~100°C，保溫10~20分鐘，然后冷卻至10~40°C，以3200~3700轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速進行離心分離I~5分鐘，收集下層沉淀物，得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的0.5~5%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值2.0~5.0,加熱升溫至40~60°C進行水解3~8小時，調(diào)節(jié)pH值7.0~9.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至40~60°C，調(diào)節(jié)pH值7.0~9.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的0.5%~5%的胰酶進行水解3~8小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾得澄清溶液，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液；(4)在步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液中加入輔料至其濃度為3~65mg/mL，并加熱至輔料溶解，于50~60°C下減壓濃縮至氮含量為6~20mg/mL，即得到腦蛋白水解物。
[0008]所述步驟(4)的輔料為右旋糖酐、聚維酮、硬脂酸聚乙二醇酯中的任意一種或幾種。
[0009]所述右旋糖酐為右旋糖酐40,加入至其濃度為15~65mg/mL。
[0010]所述聚維酮為聚維酮K12或聚維酮K17，加入至其濃度為3~20mg/mL。
[0011]所述硬脂酸聚乙二醇酯加入至其濃度為3~17mg/mL。
[0012]本發(fā)明提供的是氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物，該腦蛋白水解物中不含補加的外源性氨基酸，生產(chǎn)過程中也不添加非水解產(chǎn)物，該腦蛋白水解物的氮含量達到6~20mg/mL，并含有適宜的輔料，在保證高氮含量的同時，能有效防止天然腦蛋白水解物溶液產(chǎn)生不溶物，保證相似度大于0.9。本發(fā)明提供的方法及所得腦蛋白水解物完全符合國家標準，能達到生產(chǎn)凍干粉針劑的要求。
【具體實施方式】
[0013]通過以下實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。 [0014]實施例1
(1)取凍存新鮮豬腦2kg，加水浸泡自然解凍，用水清洗后研磨成漿液，再加4倍的水8kg，加熱至80°C，保溫20分鐘，然后冷卻至32°C，再以3500轉(zhuǎn)/分進行離心分離3分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿1.216kg ；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水3.0Okg并攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的1%的胃蛋白酶20.0g，用50% (w/w)稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0，然后加熱升溫至40°C進行水解7小時,用50% (w/w)氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH值為8.0,然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至50°C，調(diào)節(jié)pH值為8.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的
1.5%的胰酶30.0g進行水解5小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾得澄清溶液，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.76mg/mL ；
(4)在步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液中加入右旋糖酐40至濃度為12mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為2.0mg/mL,再加熱至溶解,然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為18.8mg/mL,即得到腦蛋白水解物，其中的右旋糖酐40濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為10mg/ml。取所得腦蛋白水解物冷卻至室溫，冷凍過夜，室溫自然解凍復(fù)溶后，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0015]實施例2
(1)取新鮮豬腦2kg，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質(zhì)量的水6kg，加熱至100°C，保溫10分鐘，然后冷卻至40°C，再以3200轉(zhuǎn)/分進行離心分離5分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水3kg攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的0.5%的胃蛋白酶10g，調(diào)節(jié)pH值為2.0，然后加熱升溫至50°C進行水解8小時，調(diào)節(jié)pH值為9.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至40°C，調(diào)節(jié)pH值為9.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的5%的胰酶100g進行水解3小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.40mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度20mg/mL、聚維酮K12至16.67mg/mL,再加熱至溶解,然后于60°C下減壓濃縮至氮含量為10.2mg/mL,即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為60mg/ml、聚維酮K12濃度為50mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0016]實施例3
(1)取新鮮豬腦2 kg，用水清洗后研磨成漿液，再加2倍質(zhì)量的水4kg，加熱至90°C，保溫15分鐘，然后冷卻至30°C，再以3700轉(zhuǎn)/分進行離心分離I分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的3%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，然后加熱升溫至50°C進行水解5小時，調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至60°C，調(diào)節(jié)pH值為7.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量
2.5%的胰酶進行水解6小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.84mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度38.4mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為6.4mg/mL,再加熱至溶解,然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為10mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫,冷凍過夜后,室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0017]實施例4
(1)取新鮮豬腦2kg，用水清洗后研磨成漿液，再加2倍質(zhì)量的水4kg，加熱至80°C，保溫20分鐘，然后冷卻至10°C，再以3500轉(zhuǎn)/分進行離心分離5分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的5%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，然后加熱升溫至60°C進行水解3小時，調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至60°C，調(diào)節(jié)pH值為7.0,再加入新鮮豬腦質(zhì)量
0.5%的胰酶進行水解8小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.84mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度28.8mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為4.8mg/mL,再加熱至溶解,然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為8.0mg/mL,即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為10mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫,冷凍過夜后,室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0018]實施例5(1)取新鮮豬腦2kg，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質(zhì)量的水6kg，加熱至90°C，保溫12分鐘，然后冷卻至30°C，再以3600轉(zhuǎn)/分進行離心分離4分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的3%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為6.0，然后加熱升溫至50°C進行水解4小時，調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至60°C，調(diào)節(jié)pH值為7.0,再加入新鮮豬腦質(zhì)量
3.5%的胰酶進行水解3小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.84mg/mL ； (4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度25.6mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為10.24mg/mL，再加熱至溶解，然后于45°C下減壓濃縮至氮含量為15.0mg/mL,即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為100mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為40mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0019]實施例6
(1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質(zhì)量的水加熱至80°C，保溫15分鐘，然后冷卻至30°C，再以3500轉(zhuǎn)/分進行離心分離3分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦1.5倍質(zhì)量的水并攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量3%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為2.5，然后加熱升溫至50°C進行水解6小時，調(diào)節(jié)pH值為
7.5，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到胃酶酶解液；
(3)將步驟(2)所得胃酶酶解液加熱升溫至40°C，調(diào)節(jié)pH值為8.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量2%的胰酶進行水解4小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.68mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度9.2mg/mL、聚維酮K17至濃度11.04mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度9.2mg/mL,再加熱至溶解，然后于50°C下減壓濃縮至氮含量為20mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為50mg/ml、聚維酮K17至濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為50mg/ml。冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0020]實施例7
(1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，再加4倍質(zhì)量的水加熱至90°C，保溫10分鐘，然后冷卻至15°C，再以3500轉(zhuǎn)/分進行離心分離I分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦1.5倍質(zhì)量的水并攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量4%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為4.0，然后加熱升溫至55°C進行水解6小時，調(diào)節(jié)pH值為9.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到胃酶酶解液；
(3)將步驟(2)所得胃酶酶解液加熱升溫至40°C，調(diào)節(jié)pH值為8.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量4%的胰酶進行水解6小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.45mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度38.34mg/mL，再加熱至溶解，然后于60°C下減壓濃縮至氮含量為18mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為200mg/ml。冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0021]實施例8
(1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質(zhì)量的水加熱至88°C，保溫20分鐘，然后冷卻至40°C，再以3500轉(zhuǎn)/分進行離心分離5分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦1.5倍質(zhì)量的水并攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量2.5%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為4.5，然后加熱升溫至60°C進行水解3小時，調(diào)節(jié)pH值為7.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到胃酶酶解液；
(3)將步驟(2)所得胃酶酶解液加熱升溫至50°C，調(diào)節(jié)pH值為7.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量5%的胰酶進行水解5小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.70mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入聚維酮K17至濃度為15.42mg/mL、再加熱至溶解，然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為12mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中聚維酮K17濃度為50mg/ml。冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復(fù)溶，溶液澄清，沒有產(chǎn)生不溶物。
[0022]對比例I
取與實施例1相同的新鮮豬腦，按現(xiàn)有技術(shù)的方法制得氮含量3.32mg/ml的腦蛋白水解物，取所得腦蛋白水解物三份，分別于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的腦蛋白水解物。
[0023]對比例2
取與實施例1相同的新鮮豬腦，按現(xiàn)有技術(shù)的方法制得氮含量3.14mg/ml的腦蛋白水解物，取所得腦蛋白水解物三份，分別于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的腦蛋白水解物。
[0024]對比例3
取與實施例1相同的新鮮豬腦，按現(xiàn)有技術(shù)的方法制得氮含量3.76mg/ml的腦蛋白水解物，取所得腦蛋白水解物三份，分別于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的腦蛋白水解物。
[0025]取上述對比例1、2、3的高氮含量的腦蛋白水解物各四份，其中一份置于室溫下，其余三份冷凍過夜，室溫自然解凍復(fù)溶，再用0.22濾膜過濾后，檢測各份的相似度，數(shù)據(jù)如下表:
【權(quán)利要求】
1.一種氮含量高且穩(wěn)定的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟: (1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，加豬腦質(zhì)量的2~4倍的水，加熱至80~100°C，保溫10~20分鐘，然后冷卻至10~40°C，以3200~3700轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速進行離心分離I~5分鐘，收集下層沉淀物，得脫脂腦漿； (2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質(zhì)量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的0.5~5%的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值2.0~5.0，加熱升溫至40~60°C進行水解3~8小時，調(diào)節(jié)pH值7.0~9.0，然后經(jīng)300目尼龍篩網(wǎng)過濾，得到酶解液； (3)將步驟(2)所得酶解液加熱溫至40~60°C，調(diào)節(jié)pH值7.0~9.0，再加入新鮮豬腦質(zhì)量的0.5%~5%的胰酶進行水解3~8小時，然后經(jīng)陶瓷膜循環(huán)過濾使溶液澄清，再經(jīng)10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液； (4)在步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液中加入輔料至濃度為3~65mg/mL，并加熱至輔料溶解，于50~60°C下減壓濃縮至氮含量為6~20mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)的輔料為右旋糖酐、聚維酮、硬脂酸聚乙二醇酯中的任意一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述右旋糖酐為右旋糖酐40，加入至濃度為15~65mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述聚維酮為聚維酮K12或聚維酮K17,加入至濃度為3~20mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述硬脂酸聚乙二醇酯加入至濃度為 3 ~17mg/mL。
【文檔編號】A61K9/19GK103919807SQ201410187868
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】馬維波, 陳雪江 申請人:云南盟生藥業(yè)有限公司