一種治療腫瘤的藥物組合物及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于治療腫瘤的組合藥物，由吖啶黃或藥學(xué)上可接受的鹽、美法侖或藥學(xué)上可接受的鹽和藥用載體組成，其中吖啶黃以及美法侖的摩爾配比為1∶100到1∶10，所述腫瘤包括血液性腫瘤及實(shí)體瘤。藥物形式選用將吖啶黃及美法侖分別制成單一的制劑，或者藥物形式選用將吖啶黃及美法侖制成復(fù)方制劑。本發(fā)明制備的組合藥物，可以提高腫瘤治療效果，并可以降低其毒性，減緩腫瘤生長(zhǎng)的速度。
【專利說(shuō)明】一種治療腫瘤的藥物組合物及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物用途領(lǐng)域，涉及用于治療腫瘤的聯(lián)合用藥物組合物，尤其涉及用于治療腫瘤的吖啶黃和美法侖的藥物組合物，及其制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，根據(jù)2012年中國(guó)腫瘤年報(bào)的數(shù)據(jù)，目前我國(guó)腫瘤的發(fā)病率為285.91/10萬(wàn)，全國(guó)每年新發(fā)腫瘤病例估計(jì)約為312萬(wàn)例，平均每天每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤。我國(guó)居民一生罹患腫瘤的概率為22%。全國(guó)腫瘤死亡率為180.54/10萬(wàn)。估計(jì)每年因癌癥死 亡病例達(dá)270萬(wàn)例。我國(guó)居民因癌癥死亡的幾率為13%。
[0003]烷化劑是臨床常用的化療藥物，其在體內(nèi)能形成缺電子中間體，使生物大分子富電子基團(tuán)烷基化，從而改變生物大分子的結(jié)構(gòu)域功能，使細(xì)胞的分裂增殖受到抑制或引起細(xì)胞死亡。烷化劑對(duì)快速分裂增殖的惡性腫瘤細(xì)胞最為敏感，但由于其還影響體內(nèi)增值較快的正常細(xì)胞，因此存在著一定的毒性。以多發(fā)性骨髓瘤及晚期卵巢癌的一線用藥美法侖(又名馬法蘭、米爾法蘭或左旋苯丙氨酸氮芥等)為例，其能夠引起患者的骨髓抑制，導(dǎo)致白細(xì)胞及血小板下降。因此臨床上大多采取聯(lián)合用藥的方案，以在保持和提高抗腫瘤藥物療效的同時(shí)，減少其毒性作用。
[0004]吖啶黃是由鹽酸3，6- 二氨基-10-甲基吖啶及3，6- 二氨基吖啶所組成的混合物，是一類煤焦油中提取的染料。它于1921年被德國(guó)科學(xué)家Paul Ehrlich發(fā)現(xiàn)可用作抗菌藥，并在第一次世界大戰(zhàn)期間被廣泛應(yīng)用于睡眠病的治療。此外其稀水溶液還被用作表面抗菌劑或口服尿路抗菌藥；隨著抗生素的問(wèn)世及應(yīng)用，吖啶黃逐漸退出臨床，目前多被當(dāng)做獸藥使用。長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用顯示，給予病人吖啶黃五個(gè)月以上，未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒副作用反應(yīng)，這顯示了其在臨床應(yīng)用中良好的前景。目前，尚未有將吖啶黃同烷化劑聯(lián)合使用用于治療腫瘤的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，由吖啶黃或藥學(xué)上可接受的鹽、美法侖或藥學(xué)上可接受的鹽組成，其中吖啶黃以及美法侖的摩爾配比為1:100到1:10。和藥用載體
所述的吖啶黃為鹽酸3，6- 二氨基-10-甲基吖啶及3，6- 二氨基吖啶的混合物，CAS號(hào)為 8048-52-0。
[0006]所述的可藥用的鹽為與酸加成的鹽，選用的酸為鹽酸、富馬酸、馬來(lái)酸、檸檬酸或琥珀酸。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的組合藥物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。所述吖啶黃的有效體外治療濃度為0.1-lOMmol/L，優(yōu)選0.5-1.5Mmol/L，有效體內(nèi)治療濃度為l_50mg/kg體重(裸鼠),優(yōu)選5-20mg/kg體重(裸鼠)。所述的腫瘤包括血液性腫瘤及實(shí)體瘤。[0008]所述可藥用載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知和常用的，如丸劑、片劑、膠囊劑等中的填充物或載體物質(zhì)，這些物質(zhì)通常被保健專家認(rèn)可用于這一目的且作為藥劑的非活性成分。
[0009]所述組合藥物可以制成任意劑型。
[0010]應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明所述的藥物使用包括以下兩種方式:
一是將吖啶黃及美法侖分別制成單獨(dú)的制劑，兩種制劑的劑型可以不同，并且可聯(lián)合使用的藥物可以采用其現(xiàn)有劑型。在使用時(shí)可以將這兩種藥物先后使用，也可以同時(shí)使用。將兩種藥物先后使用時(shí)，吖啶黃的單獨(dú)制劑可以首先服用。依次給藥時(shí)，給予第二種組分時(shí)第一種組分應(yīng)該還未喪失其在體內(nèi)的有效作用。
[0011]二是將上述吖啶黃及美法侖制成單一的復(fù)方制劑，使用時(shí)同時(shí)服用。
[0012]配置藥物組合物及使用時(shí)，需要產(chǎn)生作用的吖啶黃及美法侖的劑量可以改變，且最終由醫(yī)務(wù)人員決定，所考慮的因素包括患者年齡及疾病性質(zhì)和嚴(yán)重程度。[0013]本發(fā)明做了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證明，將吖啶黃與美法侖聯(lián)合使用的藥物聯(lián)合用藥，可以提高腫瘤治療效果，并可以降低其毒性，減緩腫瘤生長(zhǎng)的速度。所述的腫瘤包括血液性腫瘤及實(shí)體瘤。
[0014]吖啶黃本身曾在臨床上作為抗菌藥使用，未曾見(jiàn)其被用于臨床治療腫瘤的相關(guān)報(bào)道。同時(shí)吖啶黃與烷化劑美法侖的聯(lián)合用藥也未見(jiàn)報(bào)道。
[0015]本發(fā)明公開(kāi)了一種用于治療腫瘤的吖啶黃-美法侖聯(lián)合用藥物，包括抗菌藥吖啶黃以及烷化劑美法侖或其藥學(xué)上可接受的鹽且任選的可以包括一種或多種可藥用載體。本申請(qǐng)的發(fā)明人做了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，將未曾在臨床上用于腫瘤治療的抗菌藥吖啶黃與雙功能烷化劑美法侖聯(lián)合用藥后，可以顯著提高腫瘤治療效果，而不增加其毒性，表現(xiàn)出顯著的藥理學(xué)協(xié)同作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為體外通過(guò)磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B, SRB)比色法或水溶性四唑鹽-WST-8比色法測(cè)定的對(duì)宮頸癌、結(jié)腸癌及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的增值影響。其中在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中所使用吖啶黃的濃度為0.5Mmol/L，在宮頸癌Hela及多發(fā)性骨髓瘤RPM1-8226細(xì)胞中所使用吖啶黃的濃度為0.75Mmol/L。
[0017]圖2為體外通過(guò)PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥物對(duì)宮頸癌、結(jié)腸癌及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系凋亡的影響示意圖。其中在宮頸癌Hela上，對(duì)照組凋亡率3.88 ± 1.29%，吖啶黃單用組凋亡率6.65 ± 1.82%，美法侖單用組凋亡率24.82土 1.48%，合用組凋亡率40.35±0.01% ;在結(jié)腸癌HCTl 16上，對(duì)照組凋亡率
5.60±0.38%，吖啶黃單用組凋亡率13.16±0.61%，美法侖單用組凋亡率17.69±1.65%，合用組凋亡率38.49±1.97% ;在多發(fā)性骨髓瘤RPM1-8226上，對(duì)照組凋亡率0.04±0.02%,吖啶黃單用組凋亡率0.09±0.09%,美法侖單用組凋亡率26.52± 1.57%，合用組凋亡率50.33 ±2.72%。
[0018]圖3為體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)中，吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞移植瘤的影響示意圖。
[0019]圖4為體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)中，吖啶黃與美法侖聯(lián)合用藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤的影響示意圖。
[0020]圖5為體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)中，利用TUNEL標(biāo)記法測(cè)定的宮頸癌細(xì)胞凋亡示意圖。正在凋亡的細(xì)胞因連接上的辣根過(guò)氧化酶HRP與二氨基聯(lián)苯胺DAB發(fā)生反應(yīng)而呈現(xiàn)深棕色。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1:結(jié)腸癌此1'116、宮頸癌抱1&及多發(fā)性骨髓瘤1?^1-8226細(xì)胞株中，吖啶黃與美法侖單用及合用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
[0023]實(shí)驗(yàn)材料:結(jié)腸癌HCT116、宮頸癌Hela及多發(fā)性骨髓瘤RPM1-8226細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；吖啶黃、美 法侖及磺酰羅丹明B購(gòu)自Sigma公司；水溶性四唑鹽-WST-8試劑盒購(gòu)自Dojindo東仁化學(xué)科技公司。
[0024]實(shí)驗(yàn)方法:
Cl)細(xì)胞處理:細(xì)胞以0.5X104個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種于96孔板，加入吖啶黃DMSO溶液(終濃度0.5或0.75μΜ)預(yù)處理8小時(shí)后再加入梯度濃度的美法侖，處理24小時(shí)。
[0025](2)細(xì)胞增殖測(cè)定:對(duì)于貼壁細(xì)胞，棄去上清液后加入100μL三氯乙酸，4°C固定I小時(shí)后三蒸水沖洗、晾干；加入100μL乙酸溶液配制的磺酰羅丹明B作用15分鐘后，用10%乙酸溶液沖洗，晾干。加入150μL Tris堿溶液，振蕩溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定Α540并計(jì)算增殖抑制率。對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接加入20μL水溶性四唑鹽WST-8，37°C孵育2到4小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定A450并計(jì)算增殖抑制率。
[0026]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:加入吖啶黃預(yù)處理能夠顯著增加美法侖對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用，根據(jù)國(guó)際通用的合用協(xié)同指數(shù)Cl計(jì)算，證明兩藥之間存在良好的協(xié)同作用。增殖抑制率參見(jiàn)圖1。
[0027]實(shí)施例2:吖啶黃增加美法侖引起的腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0028]實(shí)驗(yàn)材料:細(xì)胞株及藥品來(lái)源同實(shí)施例1。溴化乙錠(PI)購(gòu)自BD公司。
[0029]儀器:FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。
[0030]實(shí)驗(yàn)方法:貼壁細(xì)胞以每孔IO6個(gè)的密度接種于Corning 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，懸浮細(xì)胞以IO6每mL培養(yǎng)液的密度接種于3mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶。過(guò)夜后加入吖啶黃預(yù)處理8小時(shí)，然后加入美法侖共同培養(yǎng)。24小時(shí)后將離心收集得到的細(xì)胞用PBS洗3次，加入75%酒精在-20°C固定2小時(shí)，離心并洗滌3次后加入含RNA酶的PBS溶液消化30分鐘，加入溴化乙錠染色并用流式細(xì)胞儀測(cè)定sub-Gl期細(xì)胞百分比，從而確定細(xì)胞凋亡率。
[0031]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:吖啶黃與美法侖合用組細(xì)胞凋亡率對(duì)比單用組有顯著增加，參見(jiàn)圖2。
[0032]實(shí)施例3:吖啶黃可以增加美法侖對(duì)于裸鼠移植瘤的作用
實(shí)驗(yàn)材料:藥物來(lái)源同實(shí)施例1，裸鼠來(lái)自上海斯萊克公司，均為雌性，2-3周齡。
[0033]實(shí)驗(yàn)方法:裸鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為對(duì)照組、吖啶黃組、美法侖組合吖啶黃美法侖合用組，每組5只，皮下接種Hela細(xì)胞株或HCT116細(xì)胞株，IO7個(gè)細(xì)胞每只，每天或隔天測(cè)定瘤體積并記錄。待腫瘤長(zhǎng)至70mm3時(shí)，對(duì)照組給予生理鹽水，吖啶黃組給予IOmg/kg，美法侖組給予0.25mg/kg,隔天給藥，合用組兩種藥物都給。實(shí)驗(yàn)周期約為2周。
[0034]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:合用組腫瘤生長(zhǎng)明顯慢于其他3組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出腫瘤并稱量，瘤重也顯著小于其他3組。參見(jiàn)圖3、圖4及表1、表2。
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，由吖啶黃或藥學(xué)上可接受的鹽、美法侖或藥學(xué)上可接受的鹽組成，其中吖啶黃或藥學(xué)上可接受的鹽與美法侖或藥學(xué)上可接受的鹽的摩爾配比為1:100到1:10，所述的吖啶黃為鹽酸3，6-二氨基-10-甲基吖啶及3，6-二氨基吖啶的混合物，CAS號(hào)為8048-52-0，所述的腫瘤包括血液性腫瘤及實(shí)體瘤。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的可藥用的鹽為與酸加成的鹽，選用的酸為鹽酸、富馬酸、馬來(lái)酸、檸檬酸或琥珀酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于治療腫瘤的藥物組合物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，藥物形式選用將吖啶黃及美法侖分別制成單一的制劑，或者藥物形式選用將吖啶黃及美法侖制成復(fù)方制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，單一制劑使用選擇同時(shí)服用或按順序服用，按順序服用時(shí)先服吖啶黃制劑再服美法侖制劑，且服用美法侖制劑需在吖啶黃制劑在體內(nèi)任然保持有效濃度范圍時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要 求4所述的應(yīng)用，其特征在于，吖啶黃的有效體內(nèi)治療濃度為l-50mg/kg體重。
【文檔編號(hào)】A61K31/196GK103933044SQ201410190126
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】楊波, 何俏軍, 曹戟, 朱虹, 應(yīng)美丹, 林冠宇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)