Abc群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，其由A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖分別與B群血清型4型(CMCC29356)腦膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)共價結(jié)合的多糖-蛋白偶聯(lián)物，以及B群ST-4821基因型(xrsw341215)腦膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)組成。該疫苗可同時預(yù)防A、B、C群腦膜炎球菌侵襲性疾病，尤其針對2歲以下流腦高危人群預(yù)防，具有更好的保護(hù)效果，并且針對自然界A、B、C群腦膜炎球菌侵襲具有更好的特異性，更好的保護(hù)作用。
【專利說明】ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多個血清群腦膜炎球菌疫苗組成的多價聯(lián)合疫苗及其制備工藝，具體地說，涉及一種由ABC群腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)物和蛋白抗原成分組成的聯(lián)合疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膜炎球菌感染所致的侵襲性敗血癥、腦膜炎、肺炎等疾病在世界各地均有發(fā)生，并引起很高的病死率和致殘率，嚴(yán)重地威脅著人類健康。根據(jù)腦膜炎球菌莢膜多糖組成的差異，可將其分成13個血清群，且所有血清群均致病。其中尤以A、B、C群病例最多，占腦膜炎球菌病例的90%以上。
[0003]目前，國內(nèi)外已有多種不同種類和不同組合的腦膜炎球菌疫苗上市，其中莢膜多糖疫苗包括A群、C群、AC群和ACYW135群；多糖-蛋白結(jié)合疫苗包括A群、C群、AC群、ACYffl35 群。
[0004]腦膜炎球菌疾病的高危人群主要是嬰幼兒，在早期研發(fā)的各血清群多糖疫苗中其細(xì)菌莢膜多糖是一種T細(xì)胞非依賴性抗原，也是一種半抗原，因嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，故而不能有效識別莢膜多糖抗原而產(chǎn)生有效抗體，故而預(yù)防效果不理想。在Hib結(jié)合疫苗成功上市的啟迪下，腦膜炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗也相繼研發(fā)成功并上市，但目前國內(nèi)外的各種組合的腦膜炎球菌結(jié)合疫苗，所用蛋白載體均為破傷風(fēng)類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)或白喉無毒變異株蛋白(CRM197)。這些蛋白載體雖也能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，但這種抗體與腦膜炎球菌疾病的預(yù)防無關(guān)。并且尤其是TT和DT，是由各自細(xì)菌毒素經(jīng)甲醛或戊二醛脫毒而來的，在百白破三聯(lián)疫苗中為了維持其脫毒效果的穩(wěn)定，避免出現(xiàn)毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，需要加入微量的甲醛或戊二醛。而在以TT或DT為蛋白載體的結(jié)合疫苗中是不加微量甲醛或戊二醛的，因而存在著蛋白載體毒性逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險。并且破傷風(fēng)毒素是高致敏原性物質(zhì)，雖經(jīng)脫毒后的破傷風(fēng)類毒素(TT)也存在著導(dǎo)致過敏發(fā)生的高風(fēng)險。這些因素，均構(gòu)成了疫苗接種的安全隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種針對ABC群腦膜炎球菌感染性疾病均有效的預(yù)防用疫苗，并能有效規(guī)避由TT或DT為蛋白載體而引起的毒性逆轉(zhuǎn)、過敏反應(yīng)等不安全風(fēng)險。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，其由A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖(CPS)分別與B群血清型4型腦膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)共價結(jié)合的多糖-蛋白偶聯(lián)物，以及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)組成。[0007]前述的聯(lián)合疫苗，所述A群腦膜炎球菌莢膜多糖分離自菌株編號為CMCC29201的A群腦膜炎球菌，所述C群腦膜炎球菌莢膜多糖分離自菌株編號為CMCC29205的C群腦膜炎球菌，所述B群血清型4型腦膜炎球菌OMV分離自菌株編號為CMCC29356的B群腦膜炎球菌，所述B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV分離自保藏編號為CGMCC N0.8982的B群腦膜炎球菌。
[0008]前述的聯(lián)合疫苗，其所用A、B、C群腦膜炎球菌菌株包括但不限于其他來源的不同血清型和基因型、克隆群的篩選株。
[0009]前述的聯(lián)合疫苗，所述疫苗中游離多糖的含量< 15%，游離蛋白的含量< 3%。
[0010]前述的聯(lián)合疫苗，用所述疫苗免疫動物后，血清抗體陽轉(zhuǎn)率> 90%。
[0011]前述的聯(lián)合疫苗，每毫升疫苗中含有A群腦膜炎球菌莢膜多糖8-40 μ g，C群腦膜炎球菌莢膜多糖8-40 μ g，B群ST-4821基因型腦膜炎球菌0MV10-80 μ g。將疫苗分裝于西林瓶或預(yù)充式注射器內(nèi)密封保存。例如，每劑分裝量為0.5ml。
[0012]前述的聯(lián)合疫苗，所述疫苗為液體劑型或凍干劑型。
[0013]當(dāng)所述疫苗為液體劑型時，任選含有鋁佐劑，所述鋁佐劑包括但不限于氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁等。
[0014]當(dāng)所述疫苗為凍干劑型時，任選含有賦形劑，所述賦形劑包括但不限于乳糖、蔗糖、明膠、山梨醇或人血白蛋白等。用于凍干劑型疫苗的稀釋液時，其稀釋液可以是磷酸鹽緩沖生理鹽水或生理鹽水，也可以采用含鋁佐劑的緩沖液或生理鹽水，其中，每毫升稀釋液中鋁含量為0.05-0.80mg。
[0015]本發(fā)明還提供所述聯(lián)合疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0016]1)A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖的制備:分別向A、C群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨沉淀多糖，離心獲得莢膜多糖復(fù)合物，再向復(fù)合物中加入氯化鈣或氯化鈉解聚，然后用乙醇分步沉淀，獲得粗制多糖，經(jīng)脫氧膽酸鈉處理，用CaptoAdhere和Capto DEAE凝膠層析，收集流穿液，再經(jīng)G25凝膠脫鹽，或用苯酚抽提，超濾，除菌過濾后即得純化的莢膜多糖，置_20°C以下或凍干后保存。
[0017]2) B群血清型4型及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV的制備:分別對B群血清型4型及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌的液體培養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)流離心，收獲菌體，菌體經(jīng)抽提分離出OMV復(fù)合物，經(jīng)脫氧膽酸鈉處理后，再依次經(jīng)硫酸銨分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等電點沉淀，離子交換凝膠層析和疏水凝膠層析，G25凝膠層析，分子篩層析等，超濾，除菌過濾后即得純化的0MV，置2-8°C避光保存。
[0018]3)莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的制備:將步驟I)中制備的A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖，分別經(jīng)溴化氰活化后，在活化的糖鏈上連接已二酰肼，超濾去除游離的溴化氰、已二酰肼，然后加入步驟2)中制備的B群血清型4型腦膜炎球菌OMV作為蛋白載體，在ADH的橋聯(lián)作用下分別形成A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物，經(jīng)分子篩凝膠層析收集所述偶聯(lián)物，除菌過濾后，置2-8 °C避光保存。
[0019]4)疫苗配制:根據(jù)A群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的磷含量計算A群腦膜炎球菌莢膜多糖含量，根據(jù)C群群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的唾液酸含量計算C群腦膜炎球菌莢膜多糖含量，根據(jù)B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV的含量，配制ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗毫升。
[0020]在A、C群CPS與B群血清型4型OMV共價偶聯(lián)物的制備中，A、C群CPS可分別經(jīng)酸水解，形成分子量較均一的I X IO3-1 X IO6道爾頓的CPS，經(jīng)高碘酸氧化，硼氫化合物作用而形成。
[0021] 本發(fā)明還提供一株新分離的B群ST-4821基因型腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningococcus) xrsw341215 (即B群ST-4821基因型腦膜炎球菌)，來源于國內(nèi)B群流行性腦脊髓膜炎患者血液標(biāo)本分離株，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC N0.8982，保藏日期2014年4月I日。
[0022]本發(fā)明涉及ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗的研發(fā)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和規(guī)模化生產(chǎn)，用于適齡人群接種，預(yù)防疫苗型血清群腦膜炎球菌感染所致的侵襲性疾病。
[0023]本疫苗由三種抗原成分經(jīng)疫苗相融性研究等確定配伍，組合而成。三種抗原成分別為=A群腦膜炎球菌CPS與B群腦膜炎球菌(CMCC29356株)OMV共價結(jié)合的A群偶聯(lián)物；C群腦膜炎球菌CPS與B群腦膜炎球菌(CMCC29356) OMV共價結(jié)合的C群偶聯(lián)物；B群腦膜炎球菌(xrsw341215株，保藏編號CGMCC N0.8982) 0MV。疫苗分裝于2ml西林瓶或預(yù)充式注射器中，每劑疫苗0.5ml，含分別結(jié)合到載體蛋白上的A群CPS:4-20 μ g, C群多糖4_20 μ g和xrsw341215株B群0MV5-40 μ g，鋁佐劑0.025-0.4mg。檢定合格后，于2_8°C避光保存，效期為24個月。
[0024]本發(fā)明提供一種以ABC群腦膜炎球菌抗原成分所組成的聯(lián)合疫苗，其中，A、C群莢膜多糖分別與B群血清型4型菌體OMV載體偶聯(lián)，用國內(nèi)優(yōu)勢致病的另一株B群ST-4821基因型腦膜炎球菌菌株0MV，組成由A、C莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物和B群OMV的三價聯(lián)合疫苗。該疫苗可同時預(yù)防A、B、C群腦膜炎球菌侵襲性疾病，尤其針對2歲以下流腦高危人群預(yù)防，具有更好的保護(hù)效果，并且針對自然界A、B、C群腦膜炎球菌侵襲具有更好的特異性，更好的保護(hù)作用。
[0025]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0026](一)采用同一致病菌、不同血清群的B群腦膜炎球菌OMV為蛋白載體，分別與A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖共價結(jié)合，是多糖-蛋白結(jié)合疫苗、載體蛋白應(yīng)用的最佳組合。
[0027]( 二)B群腦膜炎球菌CMCC29356株OMV是血清型4型，而A群流腦的蛋白分型也均為血清型4型，因而，該B群腦膜炎球菌OMV產(chǎn)生的抗體具有輔助、增強針對A群預(yù)防效
果O
[0028](三)有效規(guī)避了TT、DT為載體蛋白的毒性逆轉(zhuǎn)、過敏反應(yīng)等不安全風(fēng)險。
[0029](四)篩選國內(nèi)優(yōu)勢致病的B群腦膜炎球菌菌株xrsw341215，純化的OMV抗原，針對國內(nèi)B群流腦疾病的預(yù)防，具有更好的專一性、針對性和較廣泛的保護(hù)范圍。
[0030](五)B群腦膜炎球菌(OMV)制備工藝具有獨創(chuàng)性、新穎性，因而，有效保持了菌體OMV的天然構(gòu)象，所產(chǎn)生的抗體針對自然界致病菌的侵襲具有更好的特異性。
[0031](六)本疫苗含有針對優(yōu)勢致病的A、B、C群腦膜炎球菌抗原成分，可同時預(yù)防ABC群腦膜炎球菌侵襲。
【具體實施方式】
[0032]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0033]實施例1ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗及其制備工藝
[0034]本實施例由來自于四株腦膜炎球菌的純化組分抗原組成，具體的血清群及抗原成分如下:[0035]A群腦膜炎球菌菌株來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(CMCC)，菌株號CMCC29201，組分抗原是莢膜多糖(CPS)。
[0036]C群腦膜炎球菌菌株來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(CMCC)，菌株號CMCC29205，組分抗原是莢膜多糖(CPS)。
[0037]B群腦膜炎球菌菌株來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(CMCC)，菌株號CMCC29356，組分抗原是外膜蛋白囊(OMV)。
[0038]B群腦膜炎球菌菌株來源于國內(nèi)B群流行性腦脊髓膜炎患者血液標(biāo)本分離菌株xrsw341215，保藏編號為CGMCC N0.8982，組分抗原是外膜蛋白囊(OMV)。
[0039]生產(chǎn)工藝包括以下步驟:
[0040]1、A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖的制備
[0041]分別向A、C群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨而沉淀多糖，經(jīng)離心獲得莢膜多糖(CPS)復(fù)合物，再經(jīng)加入氯化鈣或氯化鈉解聚，乙醇分步沉淀，獲得粗制多糖，經(jīng)脫氧膽酸鈉處理，用Capto Adhere和Capto DEAE凝膠層析,收集流穿液，再經(jīng)G25凝膠脫鹽，或苯酚抽提，超濾，去除雜質(zhì)成分，除菌過濾，而獲得純化的CPS，檢定合格，儲存于_20°C以下保存，有效期5年。
[0042]2、B群血清型4型及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌(OMV)的制備
[0043]分別將二株B群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)液經(jīng)連續(xù)流離心，收獲菌體，從菌體經(jīng)抽提液溶出膜蛋白復(fù)合物，再依次經(jīng)脫氧膽酸鈉處理，硫酸胺分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等電點沉淀，離子交換凝膠層析，疏水凝膠層析，分子篩凝膠層析，G25凝膠層析，超濾，除菌過濾，而獲得純化的0MV，經(jīng)檢定合格，儲存于2-8°C避光保存，有效期I年。
[0044]3、莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的制備
[0045]A、C群腦膜炎球菌CPS，分別經(jīng)溴化氰(CNBr)活化后，再在活化糖鏈連接上已二酰肼(ADH)，經(jīng)超濾去除游離的CNBr、ADH,加入CMCC29356株B群腦膜炎球菌OMV為蛋白載體，經(jīng)加入的碳二亞胺(EDAC)縮合作用，在ADH的橋聯(lián)作用下形成多糖-蛋白間的共價結(jié)合鍵，制備得到莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物。在此偶聯(lián)物中含有四種不同成分，分別是大分子量的莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物，小分子量多糖-蛋白偶聯(lián)物，未結(jié)合到蛋白載體的游離多糖，未結(jié)合到多糖的游離蛋白。經(jīng)分子篩凝膠層析，收集大分子量莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物，收獲除菌過濾原液，經(jīng)檢測合格，于2-8°C避光保存，有效期為6個月。
[0046]4、疫苗配制:根據(jù)測定A群偶聯(lián)物的磷含量計算A多糖含量，C群偶聯(lián)物的唾液酸含量計算C多糖含量，B群ST-4821基因型OMV的蛋白含量，配制ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，使每1ml疫苗中含有A群多糖8-40 μ g，C群多糖8_40 μ g，B群OMV蛋白10-80 μ g。再分裝至西林瓶或預(yù)充式注射器內(nèi)，每劑分裝量為0.5ml。經(jīng)檢定合格，于2-8 °C避光保存，有效期為2年。
[0047]生產(chǎn)工藝特點:
[0048](I)采用流腦半綜合液體培養(yǎng)基進(jìn)行B群腦膜炎球菌大罐液體培養(yǎng)，細(xì)菌繁殖快，產(chǎn)率高，通常只需4.5-6h，每升培養(yǎng)基收獲菌體12-18克。
[0049](2)蛋白產(chǎn)率高:從菌體純化獲得的蛋白產(chǎn)率達(dá)1.0-1.6%。
[0050](3)交叉保護(hù)率高 ，對AC群有顯示輔助增強效應(yīng)
[0051]a.B群CMCC29356株OMV抗原為血清型4型，與A群蛋白抗原的血清型同為血清型4型。根據(jù)至今的研究結(jié)果證實，A群菌蛋白抗原為單一的血清型4型，因此B群CMCC29356株OMV抗原所產(chǎn)生的針對血清型4型的特異性抗體，對所有A群菌具有廣泛的交叉保護(hù)性；
[0052]b.從國內(nèi)篩選的B群優(yōu)勢致病株xrsw341215，是我國獨有的基因型(ST-4821)菌株，且與國內(nèi)2003年春季流行的C群腦膜炎球菌菌株是同一基因型(ST-4821)，因此，其抗體針對C群保護(hù)也有效；
[0053]c.ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，各自針對A、C的抗體效價，顯著高于單價A、C偶聯(lián)物免后抗體，說明B群菌株編號為CMCC29356的腦膜炎球菌載體蛋白、xrsw341215株OMV抗原具有輔助增強效應(yīng)。
[0054]實施例2不同生產(chǎn)廠家AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性比較研究
[0055]實驗方案:
[0056]1、四種來源的疫苗分別是國產(chǎn)IAC疫苗、國產(chǎn)2AC疫苗、祥瑞生物AC疫苗以及實施例I中制備的ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗。
[0057]2、實驗動物:BALB/C小鼠，12~14克/只體重。
[0058]3、分組:每組10只，雌、雄各半，每罐飼養(yǎng)5只同性小鼠。
[0059]4、免疫方式:皮下注射；免疫劑量:2.5 μ g多糖/A、C各群。
[0060]5、免疫程序:全程免疫三針次，即0、14、21天，各免疫一針。
[0061]6、血清分離及檢測:每次免后二周采血，分離血清，ELISA測定單只小鼠抗體效價，計算每組幾何平均滴度(GMT)，比較四種疫苗免疫原性。結(jié)果如表1所示。
[0062]7、實驗結(jié)果分析
[0063]7.1AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗國產(chǎn)1、國產(chǎn)2，由于載體蛋白是TT，因而免疫血清測不到B群腦膜炎球菌B4、B.ST-4821血清效價；祥瑞生物AC疫苗是以B群Nm血清型4型OMV為載體蛋白，免疫血清顯示較高的血清效價，ABC群Nm疫苗中含有A、C、B.4、B.ST-4821抗原成分，并均能測到較高的抗體效價。
[0064]7.2四種來源的疫苗，不同免疫針次的血清抗體效價測定顯示，有明顯的免疫針次效應(yīng)，免疫回憶應(yīng)答明顯，血清抗體效價分別三針次> 二針次 >一針次。
[0065]7.3四種來源的疫苗中，各自A、C群抗體效價測定數(shù)據(jù)顯示，以B群血清型4型OMV為載體蛋白的結(jié)合疫苗的A、C群抗體效價顯然高于以TT為載體的結(jié)合疫苗。這說明B群OMV有增強A、C群抗體效價的輔助效應(yīng)。
[0066]7.4ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，不但產(chǎn)生了 B.ST-4821的較高的抗體效價，而且各針次的A、C、B.4免疫血清GMT均高于國產(chǎn)1、國產(chǎn)2、祥瑞生物的AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗，說明B.ST-48210MV抗原成分可能存在較廣泛的輔助增強效應(yīng)。
[0067]實施例3國內(nèi)B群流腦患者分離株xrsw341215免疫血清與國內(nèi)、國外不同來源的優(yōu)勢致病B群流腦菌株的交叉抗體測定
[0068]1、國內(nèi)菌株:從167株國內(nèi)收集的B群流腦患者、攜帶者中篩選，確定的患者分離優(yōu)勢致菌株，共8株(表2)。
[0069]表2國內(nèi)B群患者分離株
[0070]
【權(quán)利要求】
1.ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗，其特征在于，其由A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖分別與B群血清型4型腦膜炎球菌OMV共價結(jié)合的多糖-蛋白偶聯(lián)物，以及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述A群腦膜炎球菌莢膜多糖分離自菌株編號為CMCC29201的A群腦膜炎球菌，所述C群腦膜炎球菌莢膜多糖分離自菌株編號為CMCC29205的C群腦膜炎球菌，所述B群血清型4型腦膜炎球菌OMV分離自菌株編號為CMCC29356的B群腦膜炎球菌，所述B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV分離自保藏編號為CGMCC N0.8982的B群腦膜炎球菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，每毫升疫苗中含有A群腦膜炎球菌莢膜多糖8-40 yg, C群腦膜炎球菌莢膜多糖8-40 μ g，B群ST-4821基因型腦膜炎球菌0MV10-80y go
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，疫苗分裝于西林瓶或預(yù)充式注射器內(nèi)密封保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述疫苗為液體劑型或凍干劑型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述疫苗為液體劑型，任選含有鋁佐劑，所述鋁佐劑包括 但不限于氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述疫苗為凍干劑型，任選含有賦形劑，所述賦形劑包括但不限于乳糖、蔗糖、明膠、山梨醇或人血白蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述凍干劑型的疫苗，其稀釋液是磷酸鹽緩沖生理鹽水、生理鹽水，或含有鋁佐劑的緩沖液或生理鹽水，其中，每毫升稀釋液中鋁含量為0.05-0.80mg。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖的制備:分別向A、C群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨沉淀多糖，離心獲得莢膜多糖復(fù)合物，再向復(fù)合物中加入氯化鈣或氯化鈉解聚，然后用乙醇分步沉淀，獲得粗制多糖，經(jīng)脫氧膽酸鈉處理，用Capto Adhere和Capto DEAE凝膠層析，收集流穿液，再經(jīng)G25凝膠脫鹽，或用苯酚抽提，超濾，除菌過濾后即得純化的莢膜多糖，置_20°C以下或凍干后保存； 2)B群血清型4型及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV的制備:分別對B群血清型4型及B群ST-4821基因型腦膜炎球菌的液體培養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)流離心，收獲菌體，菌體經(jīng)抽提分離出OMV復(fù)合物，經(jīng)脫氧膽酸鈉處理后，再依次經(jīng)硫酸銨分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等電點沉淀，離子交換凝膠層析和疏水凝膠層析，G25凝膠層析，分子篩層析，超濾，除菌過濾后即得純化的0MV，置2-8°C避光保存； 3)莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的制備:將步驟I)中制備的A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖，分別經(jīng)溴化氰活化后，在活化的糖鏈上連接已二酰肼，超濾去除游離的溴化氰、已二酰肼，然后加入步驟2)中制備的B群血清型4型腦膜炎球菌OMV作為蛋白載體，在ADH的橋聯(lián)作用下分別形成A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物，經(jīng)分子篩凝膠層析收集所述偶聯(lián)物，除菌過濾后，置2-8 °C避光保存； 4)疫苗配制:根據(jù)A群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的磷含量計算A群腦膜炎球菌莢膜多糖含量，根據(jù)C群群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)物的唾液酸含量計算C群腦膜炎球菌莢膜多糖含量，根據(jù)B群ST-4821基因型腦膜炎球菌OMV的含量，配制ABC群腦膜炎球菌聯(lián)合疫苗毫升。
10.腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningococcus)xrsw341215，其保藏編號為 CGMCCN0.8982
【文檔編號】A61P31/04GK104001166SQ201410200898
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】王建華 申請人:北京祥瑞生物制品有限公司