重組抗表皮生長因子受體抗體組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是關(guān)于適用于人類癌癥治療的重組抗體領(lǐng)域。更特定言的，本發(fā)明提供能夠結(jié)合人類EGFR的抗體的組合物或混合物。具有3種或3種以上抗體的抗體組合物展示使代表性癌細(xì)胞系增殖減少的協(xié)同作用。使用包含兩種不同嵌合抗hEGFR抗體的組合物亦獲得有利結(jié)果，其在動物模型中展示基于迅速及有效受體內(nèi)化、誘導(dǎo)終末分化及后續(xù)腫瘤根除的新的作用機(jī)制。本發(fā)明的抗體可在一生物反應(yīng)器中以多克隆抗體形式制備。
【專利說明】重組抗表皮生長因子受體抗體組合物
[0001] 本申請是中國申請?zhí)枮?00880006835. 0、發(fā)明名稱為"重組抗表皮生長因子受體 抗體組合物"且申請日為2008年2月27日的專利申請（PCT申請?zhí)枮镻CT/DK2008/050047) 的分案申請。
[0002] 【發(fā)明所屬的【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0003] 本發(fā)明是關(guān)于適用于人類癌癥治療的重組抗體領(lǐng)域。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在細(xì)胞增 殖以及細(xì)胞凋亡、血管生成及轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散（對腫瘤發(fā)展至關(guān)重要的過程）中發(fā)揮重要 作用（Salomon 等人，Crit. Rev. Oncology/Haematology, 19:183-232 (1995) ;Wu 等人， J.Clin. Invest. ,95:1897-1905(1995) ;Karnes 等人，Gastroenterology, 114:930-9 39(1998) ;Woodburn 等人，Pharmacol. Therap. 82:241-250(1999) ;Price 等人，Eur. J. Cancer，32A: 1977-1982 (1996))。實(shí)際上，研究已證明在包括非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、 乳癌、胃癌及頭部及頸部腫瘤的多種實(shí)體瘤中，EGFR介導(dǎo)細(xì)胞生長增加 （Salomon DS等 人，Critical Reviews in Oncology/Haematology, 19:183-232(1995))。此外，現(xiàn)已知癌 細(xì)胞表面上EGFR的過度活化與晚期疾病、轉(zhuǎn)移性表型的發(fā)展及癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān) (Salomon DS 等人，Critical Reviews in 0ncology/Haematologyl9:183-232 (1995))。
[0006] 此外，EGFR表達(dá)時常伴隨EGFR表達(dá)腫瘤細(xì)胞中EGFR配體，尤其TGF-α及 EGF的產(chǎn)生，此表明自分泌環(huán)參與該等細(xì)胞的發(fā)展（Baselga等人（1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154 ;Modjtahedi 等人（1994) Int. J. Oncology. 4:277-296)。因此阻 斷該等EGFR配體與EGFR之間的相互作用可抑制腫瘤生長及存活（Baselga等人，（1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154)〇
[0007] EGFR為分子量為約170kDa的膜結(jié)合醣蛋白。EGFR由以短的23個氨基酸跨膜接頭 連接的糖基化外部配體結(jié)合域￠21個殘基）及細(xì)胞質(zhì)域（542個殘基）組成。EGFR的細(xì)胞 外部分含有25個雙硫鍵及12個N連接糖基化位點(diǎn)，且通常認(rèn)為由四個子域組成。EGFR的X 射線晶體結(jié)構(gòu)表明該受體采用不能結(jié)合EGF的自抑制約束構(gòu)形（tethered-conformation) (Ferguson等人，Mol Cell, 2003,第11卷：507-517)與可介導(dǎo)EGF配體結(jié)合及受體二聚的 活性構(gòu)形（Garret 等人，Cell2002,第 110 卷：763-773 ;0giso 等人，Cell, 2002,第 110 卷： 775-787)。具體的，已暗示域I及域III為高親和力配體結(jié)合位點(diǎn)的形成提供附加貢獻(xiàn)。域 II及域IV為富含半胱氨酸的層粘連蛋白樣區(qū)域，其使蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定且含有可能的EGFR 二聚界面。
[0008] 已知EGFR以多種不同構(gòu)形在細(xì)胞表面上存在，其中約束（tethered)構(gòu)形或鎖定 構(gòu)形最常見。約束構(gòu)形不能二聚且因此無活性。已知治療抗體艾比特思（Erbitux)通過與 域III結(jié)合且在空間上妨礙受體達(dá)成非約束狀態(tài)來使約束構(gòu)形穩(wěn)定。然而，一些受體可能 仍能夠接受非約束構(gòu)形、結(jié)合配體且二聚。單克隆抗體（mAb)通常僅有效結(jié)合該等構(gòu)形中 的一者，且因此不能有效靶向展現(xiàn)其它構(gòu)形的癌細(xì)胞或展現(xiàn)多種構(gòu)形的癌細(xì)胞。
[0009] 針對EGFR配體結(jié)合域的單克隆抗體（mAb)可阻斷與EGFR配體的相互作用且隨之 阻斷所得細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
[0010] 艾比特思?(Erbitux?)(西妥昔單抗（Cetuximab))為與人類（EGFR)胞外域特異 性結(jié)合的重組、人類/小鼠嵌合單克隆抗體。艾比特思包含鼠類抗EGFR抗體的Fv區(qū)域與 人類IgGl重鏈及κ輕鏈恒定區(qū)且分子量約為152kDa。艾比特思是在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng) 物（鼠類骨髓瘤）中產(chǎn)生。艾比特思經(jīng)批準(zhǔn)用于治療患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌且其腫瘤表達(dá) EGFR的患者。此外，艾比特思與放射性療法組合用于治療患有不能通過手術(shù)移除的頭頸鱗 狀細(xì)胞癌的患者，或用作標(biāo)準(zhǔn)鉬基療法已失敗的頭頸鱗狀細(xì)胞癌的第二線治療。
[0011] 維克替比?(Vectibix?)(盤尼圖單抗（panitumumab))為與人類EGFR特異性結(jié) 合的人類IgG2K單克隆抗體的重組。維克替比的分子量約為147kDa。盤尼圖單抗是在遺 傳工程化的哺乳動物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary))中產(chǎn)生。維克替比 經(jīng)批準(zhǔn)用于治療患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌且其腫瘤表達(dá)EGFR，且疾病在含氟嘧啶、奧賽力鉬 (oxaliplatin)及伊立替康（irinotecan)的化學(xué)療法方案治療中或治療之后仍發(fā)展的患 者。
[0012] 已在人類腫瘤細(xì)胞上鑒別出多種突變型EGF受體。此等突變型受體可使受體活性 獨(dú)立于配體結(jié)合（EGFRvIII)，從而導(dǎo)致致瘤性增強(qiáng)?？僧a(chǎn)生針對突變型EGFR的單克隆抗 體，但該單克隆抗體將不必有效針對非突變型EGFR。
[0013] 已在人類癌癥患者中鑒別出EGFR的突變，其影響該等患者對針對EGFR的化學(xué)療 法的反應(yīng)。W02006/110478(Novartis)揭示EGFR開放閱讀框架中的43個突變以及18個 SNP。在兩種或兩種以上類型的腫瘤類型中鑒別到一些錯義突變。W02006/091899 (Amgen) 揭示在各種癌細(xì)胞中鑒別出的八個其它突變。該等突變中的一或多者可位于由目前批準(zhǔn)的 單克隆抗體中的之一結(jié)合的表位中或影響該表位的結(jié)構(gòu)。攜帶該等突變的患者將不能由單 克隆抗體治療。
[0014] 此外，文獻(xiàn)中有報道展示糖基化位點(diǎn)中的至少一者的糖基化的異質(zhì)性（Whitson 等人，2005Biochemistry44:14920-31 ;Zhen 等人，2003Biochemistry42 ;5478_92)。該異質(zhì) 性可直接或間接引起在腫瘤細(xì)胞之間不同的表位的差異暴露。
[0015] 抗體依賴性細(xì)胞毒性（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)為抗 體介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞的替代性機(jī)制。ADCC的程度視若干因素而定，該等因素包括IgG亞型 (IgM>IgGl>IgG2)、目標(biāo)細(xì)胞上的抗體密度、抗體糖基化模式以及目標(biāo)本身的特性。
[0016] Friedmann等人（PNAS2005, 102:1915-20)已證明就通過結(jié)合有區(qū)別的EGFR表位 來抑制EGF與EGFR結(jié)合的能力而選擇的兩種鼠類單克隆抗體，其能夠協(xié)同地調(diào)降瞬時表達(dá) EGFR的KB細(xì)胞及CH0細(xì)胞中的受體表達(dá)。交叉競爭性EGF抑制抗體并不展現(xiàn)任何協(xié)同作 用。
[0017] Modjtahedi 等人（Cell Biophysics 第 22 卷，1993, 129-146)已測試若干大鼠抗 EGFR抗體與不重疊的表位的組合。該等抗體具有不同同種型。在任何情況下，使用兩種抗 體的效果介于單獨(dú)使用類似量的兩種單克隆抗體的效果的中間。在體內(nèi)與體外均證實(shí)該結(jié) 果。
[0018] W02004/032960 (Merck Patent)揭示組合使用兩種單克隆抗體Mab425與 Mab225(西妥昔單抗），與單獨(dú)使用類似量的該等單克隆抗體中的每一者相比，產(chǎn)生增加量 的與EGFR表達(dá)癌細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。該公開案亦揭示當(dāng)使用抗體組合時，與使用兩種單 克隆抗體相比，EGFR的下調(diào)會增加。
[0019] Perera 等人（Clin Cancer Res2005:11 (17) :6390-99)揭示以兩種鼠類單克隆 抗體的組合治療帶有U87MG.de2-7異種移植物的小鼠的協(xié)同效果。該等抗體中的一者 (mAb528)結(jié)合所有對西妥昔單抗具有類似特異性的EGFR亞型。另一者（mAB806)僅結(jié)合 de2-7EGFR。U87MG.de2-7細(xì)胞系為經(jīng)de2-7EGFR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。U87MG.DK細(xì)胞系表達(dá) de2-7EGFR的激酶失活變異體。當(dāng)對帶有U87MG. DK異種移植物的小鼠使用該等兩種抗體時 未觀察到協(xié)同作用。在具有表達(dá)野生型EGFR的A431細(xì)胞系的異種移植模型中，作者未提 供協(xié)同作用的證據(jù)。de2-7EGFR僅存在于有限量的癌癥類型中，該等癌癥類型諸如神經(jīng)膠質(zhì) 瘤，（在某種程度上）乳癌及肺癌。
[0020] 雖然該等研究已表明在某些情況下協(xié)同作用可存在于兩種鼠類單克隆抗體之間， 但其亦展示在許多情況下未發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用。該等研究亦未提供有效針對多種臨床相關(guān)癌細(xì) 胞系的抗EGFR抗體組合物。
[0021] 因此，對在以低劑量給與時能有效治療和/或預(yù)防與EGFR過度表達(dá)相關(guān)的疾病的 改良的針對EGFR的治療抗體存在需要。亦對廣泛適用的治療性癌癥抗體存在需要，其可在 對由所述癌細(xì)胞表達(dá)的EGFR結(jié)構(gòu)不具有詳細(xì)認(rèn)識的情況下使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 在一個方面，本發(fā)明涉及重組抗體組合物，其包含至少3種有區(qū)別的抗EGFR抗體 分子，其中所述抗體結(jié)合EGFR的有區(qū)別的第一、第二和第三表位。
[0023] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及重組抗體組合物，其包含至少兩種有區(qū)別的EGFR 抗體分子，其中一種有區(qū)別的抗EGFR抗體分子選自以下抗體組成的組：992、1024、1030、 1042、1208、1229、1254、1257、1260、1261、1277、1284、1308、1320、1344 和 1347,或具有這些 抗體的⑶R的抗體。
[0024] 優(yōu)選至少一個有區(qū)別的抗EGFR抗體分子選自下組：抗體992、1030、1024、1347、 1277、1254、1320、1260、1261和1284或具有這些抗體的CDR的抗體。在本發(fā)明的特別優(yōu)選 的實(shí)施方案中，抗體組合物包含抗體992和1024或基于它們的CDR3序列的兩抗體、或基于 它們的\和V H序列的抗體，或包含兩種具有基本上相同的結(jié)合特異性的抗體。
[0025] 已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的代表性抗體組合物在抑制代表性癌細(xì)胞系增殖中有效，這 指出了一種在癌癥治療中的體內(nèi)用途。這些結(jié)果已經(jīng)在用癌細(xì)胞球形體（cancer cell spheroid)進(jìn)行的測定中得到了確認(rèn)，癌細(xì)胞球形體可以更好地代表體內(nèi)情況，其中癌細(xì)胞 形成腫瘤。另外，本發(fā)明的抗體組合物表現(xiàn)出使來自癌球形體的細(xì)胞運(yùn)動性降低，并由此降 低形成轉(zhuǎn)移的傾向。也已經(jīng)證明了代表性抗體組合物在異種移植模型中的體內(nèi)效力。這些 結(jié)果已經(jīng)確認(rèn)了由抗體992和1024組成的特別優(yōu)選的抗體組合物。
[0026] 在小鼠中的人癌癥異種移植模型中，本發(fā)明的代表性抗體組合物與可以通過商業(yè) 方法獲得的單克隆抗體Vectibix和Erbitux相比產(chǎn)生了顯著更高的腫瘤細(xì)胞終末分化程 度?？雌饋肀景l(fā)明的優(yōu)選抗體組合物通過一種不同于單克隆抗體的作用機(jī)制工作，因為在 用本發(fā)明的抗體組合物進(jìn)行的處理終止后沒有觀察到腫瘤的再生。在用單克隆抗體進(jìn)行的 處理終止后觀察到腫瘤再生。
[0027] 在結(jié)合研究中，發(fā)明人證明了一些本發(fā)明提供的抗體表現(xiàn)出促進(jìn)另外的抗體的結(jié) 合，由此增加結(jié)合至受體的抗體總量。也已經(jīng)證明結(jié)合三種結(jié)構(gòu)域III抗體可促進(jìn)后續(xù)的 另外抗體的結(jié)合。這些觀察結(jié)果明顯支持了使用具有至少3種有區(qū)別的抗EGFR抗體分子 的組合物的概念，其中抗體結(jié)合EGFR的有區(qū)別的第一、第二和第三表位。該效果也可以藉 由選擇提供這種特定效果的多個抗體，通過使用本發(fā)明的兩種抗體的特定組合來獲得。這 些抗體是用于與其它抗體混合的優(yōu)選候選。
[0028] 本發(fā)明的組合物可以提供數(shù)種其它優(yōu)勢。癌細(xì)胞表達(dá)多種的EGFR。變異出現(xiàn)在構(gòu) 象中、糖基化中和一級結(jié)構(gòu)（突變和SNP)中。單一的單克隆抗體可以靶向這些EGFR變異 中的一些但不是全部。EGFR突變體可能是單克隆抗體的逃逸突變體。包含本發(fā)明的兩種 抗體的抗體或包含三種或更多種結(jié)合不同EGFR表位的不同抗體的抗體對突變體、SNP、缺 失突變體和糖基化中的變異較不敏感。其證據(jù)為本發(fā)明的抗體混合針對一組代表多種多樣 EGFR構(gòu)象和變異的人癌細(xì)胞系的廣泛效力。
[0029] 施用一種單克隆抗體還可能不完全關(guān)閉EGFR的激酶活性。對信號傳導(dǎo)更有效的 抑制可以通過抗體的組合來實(shí)現(xiàn)。
[0030] 因此可能有益的是，在抗體混合物中包括與不同EGFR構(gòu)象（例如，無束縛構(gòu)象 (untethered conformation)和受體二聚體）結(jié)合的抗體。這樣的抗體混合物可能在抑制 EGFR活性方面比僅結(jié)合多種構(gòu)象之一的單克隆抗體更有力。
[0031] 另外，通過使用在組合物中含有三種或更多種抗EGFR抗體的方法，可能可以提高 抗體在腫瘤細(xì)胞表面的密度，從而與單克隆抗體相比增加經(jīng)由ADCC的殺傷。
[0032] 在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及用于制備抗體組合物的方法，包括：
[0033] a)用第一表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染第一真核細(xì)胞群體，所述第一表達(dá)構(gòu)建體編碼包含能夠 結(jié)合第一有區(qū)別的EGFR表位的第一 ^^和^^鏈關(guān)聯(lián)對（cognate pair)的第一抗體；
[0034] b)用第二表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染第二真核細(xì)胞群體，所述第二表達(dá)構(gòu)建體編碼包含能夠 結(jié)合第二有區(qū)別的EGFR表位的第二VH和 '鏈關(guān)聯(lián)對的第二抗體；
[0035] c)任選地對第三或其他的群體、表達(dá)構(gòu)建體、關(guān)聯(lián)對和EGFR表位重復(fù)步驟b);
[0036] d)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的第一、第二和任選地其他的細(xì)胞群體；
[0037] e)將經(jīng)轉(zhuǎn)染的群體在一個器皿（pot)中組合以獲得細(xì)胞庫（cell bank);
[0038] f)在允許抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)來自所述細(xì)胞庫的細(xì)胞；和
[0039] g)從上清液回收并純化抗體組合物。
[0040] 為了便于制備、下游加工和表征，所有抗體包含相同的重鏈恒定區(qū)。
[0041] 在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及包含至少兩種真核細(xì)胞亞群的細(xì)胞庫；每種亞群 用一種編碼抗體的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述抗體包含能夠結(jié)合有區(qū)別的EGFR表位的V H 和 '鏈關(guān)聯(lián)對。優(yōu)選地，使用位點(diǎn)特異性整合來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0042] 另外，本發(fā)明涉及降低EGFR信號傳導(dǎo)的方法，包括向表達(dá)EGFR的細(xì)胞的組合物施 用本發(fā)明的抗體組合物并降低EGFR信號傳導(dǎo)。
[0043] 本發(fā)明還涉及殺死表達(dá)EGFR的細(xì)胞的方法，包括向表達(dá)EGFR的細(xì)胞的組合物施 用任何本發(fā)明的抗體組合物并殺死表達(dá)EGFR的細(xì)胞。
[0044] 還提供在表達(dá)EGFR的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括向表達(dá)EGFR的細(xì)胞的組合物 施用本發(fā)明的抗體組合物，從而誘導(dǎo)凋亡。
[0045] 進(jìn)一步的方面涉及抑制表達(dá)EGFR的細(xì)胞增殖的方法，包括向表達(dá)EGFR的細(xì)胞的 組合物施用本發(fā)明的抗體組合物，從而抑制增殖。
[0046] 本發(fā)明涉及在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的方法，包括向患有癌癥的個體施用本發(fā)明 的抗體組合物，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。這個方面是基于在曝露于本發(fā)明的抗體組合物 時觀察到的對癌細(xì)胞體內(nèi)終末分化的影響。
[0047] 在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及藥物用品，其包含本發(fā)明的抗體組合物和至少一 種能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的化合物作為一個組合用于在癌癥治療中同時、分開或相繼施用。 通過將本發(fā)明的抗體組合物與已知誘導(dǎo)癌細(xì)胞終末分化的作用劑（agent)結(jié)合，能夠進(jìn)一 步改進(jìn)效果。
[0048] 在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及藥物用品，其包含本發(fā)明的抗體組合物和至少 一種化療或抗腫瘤化合物作為組合用于在癌癥治療中同時、分開或相繼施用。本發(fā)明的抗 體組合物很有可能能夠用于二線治療，即在使用常規(guī)化療或抗腫瘤劑治療之后或與之同時 進(jìn)行，或在放射療法和/或外科手術(shù)之后或與之同時進(jìn)行。
[0049] 在另一方面，提供選自下組的多核苷酸：具有圖23(SEQ ID N0100)中所示核酸 序列的核酸；編碼具有圖23(SEQ ID N0100)中所示氨基酸序列的多肽的核酸；具有圖 34A(SEQ ID N0102)中所示核酸序列的核酸；和編碼具有圖34A(SEQ ID N0102)中所示氨 基酸序列的多肽的核酸。另外還提供包含圖23 (SEQ ID N0101)中所示氨基酸序列的多肽 和包含圖34B(SEQ ID N0103)中所示氨基酸序列的多肽；包含如上定義的所述核酸可操作 地連接于能夠指導(dǎo)所述核酸表達(dá)的啟動子序列的表達(dá)載體；和用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo) 的細(xì)胞。
[0050] 這些序列構(gòu)成稱猴（Cynomolgous)(即來自食蟹猴（Macaca fascicularis)的） EGFR多核苷酸和多肽序列。這個種的猴是廣泛用于毒理學(xué)研究的動物。對于在包括針對人 自身抗原的抗體的毒理學(xué)研究中具有任何價值的動物物種，關(guān)鍵是所述抗體也結(jié)合該毒理 動物（tox-animal)中的祀蛋白，優(yōu)選以大約相同的親和力結(jié)合。借助本發(fā)明人的貢獻(xiàn)，現(xiàn) 在已使測試抗體與獼猴EGFR的結(jié)合成為可能。獼猴和人EGFR是高度同源的蛋白質(zhì)，但令 人驚奇的是發(fā)現(xiàn)了大量對人和獼猴EGFR的親和力差異很大的抗體。這強(qiáng)調(diào)了使用準(zhǔn)確的 獼猴EGFR蛋白進(jìn)行篩選的重要性，這種蛋白已由本發(fā)明人提供。
[0051] 另外還提供用于篩選抗體對獼猴EGFR的結(jié)合的方法，包括步驟
[0052] -提供至少一種測試抗體；
[0053] -實(shí)施測定法以測定抗體與獼猴EGFR胞外結(jié)構(gòu)域（圖23, SEQ ID N0101)或全長 獼猴EGFR(圖34B，SEQ ID N0103)的結(jié)合；或抗體與表達(dá)獼猴EGFR胞外結(jié)構(gòu)域或表達(dá)全長 獼猴EGFR的細(xì)胞表面的結(jié)合；
[0054] -和選擇至少一種結(jié)合獼猴EGFR胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。
[0055] 所述方法可以進(jìn)一步包括篩選與人EGFR胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合或與表達(dá)人EGFR的細(xì) 胞的結(jié)合。
[0056] 在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及用于鑒定抗EGFR抗體的方法，該抗體能夠增強(qiáng)另 一抗EGFR抗體對EGFR的同時結(jié)合，所述方法包括
[0057] a.在第一測定中，測定第一抗體對于固定量EGFR抗原的最大結(jié)合能力，
[0058] b.在第二測定中，用第二抗EGFR抗體使固定量EGFR抗原飽和，
[0059] c.將EGFR-抗體復(fù)合物與所述第一抗體接觸，并測定最大結(jié)合能力，和
[0060] d.比較結(jié)合能力以測定步驟c的最大結(jié)合能力是否超過步驟a的最大結(jié)合能力。
[0061] 本申請還涉及以下方面：
[0062] 項1. 一種重組抗體組合物，其包含至少3種有區(qū)別的抗EGFR抗體分子，其中所述 抗體結(jié)合EGFR的有區(qū)別的第一、第二和第三表位。
[0063] 項2.項1的抗體，其中所述表位不重疊。
[0064] 項3.項1的抗體，其中至少一種有區(qū)別的抗體分子能夠抑制EGF結(jié)合。
[0065] 項4.項1的抗體，其中至少一種有區(qū)別的抗體分子能夠防止EGFR磷酸化。
[0066] 項5.項1的抗體，其中至少一種有區(qū)別的抗體分子能夠增強(qiáng)EGFR的內(nèi)化/降解。 [0067] 項6.項1的抗體，其包含至少一種其它有區(qū)別的抗EGFR抗體分子，其中該其它抗 體結(jié)合第四有區(qū)別的表位。
[0068] 項7.項6的抗體，其包含至少一種其它有區(qū)別的抗EGFR抗體分子，其中該其它抗 體結(jié)合第五有區(qū)別的表位。
[0069] 項8.項7的抗體，其包含至少一種其它有區(qū)別的抗EGFR抗體分子，其中該其它抗 體結(jié)合第六有區(qū)別的表位。
[0070] 項9.項1的抗體，其包含至少一種域III抗體和至少一種域I/II抗體。
[0071] 項10.項1的抗體，其包含至少兩種域III抗體和一種域I抗體。
[0072] 項11.項1的抗體，其包含至少兩種域III抗體，諸如至少三種域III抗體。
[0073] 項12.項1的抗體，其包含至少一種能夠增強(qiáng)至少一種其它抗體與不同有區(qū)別的 表位結(jié)合的抗體。
[0074] 項13.項1的抗體，其中所述抗體為具有鼠類可變鏈與人類恒定鏈的嵌合抗體。
[0075] 項14.項13的抗體，其中該人類恒定鏈為IgGl或IgG2。
[0076] 項15.項1的抗體，其中至少一種抗體為人源化抗體。
[0077] 項16.項1的抗體，其中至少一種抗體為人類抗體。
[0078] 項17.項1的抗體，其中EGFR選自由人類EGFR、突變?nèi)祟怑GFR和人類EGFR的缺 失變異體組成的組。
[0079] 項18.項17的抗體，其中EGFR為人類EGFR與非人類靈長類EGFR兩者。
[0080] 項19. 一種重組抗體組合物，其包含至少2種有區(qū)別的EGFR抗體分子，其中一種 有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由具有以下抗體的⑶R的抗體組成的組：992、1024、1030、 1042、1208、1229、1254、1257、1260、1261、1277、1284、1308、1320、1344 和 1347。
[0081] 項20.項19的重組抗體組合物，其中至少一種有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選 自由具有以下抗體的CDR的抗體組成的組：992、1030、1024、1347、1277、1254、1320、1260、 1261 和 1284。
[0082] 項21.項19的重組抗體組合物，其中兩種有區(qū)別的EGFR抗體分子是選自由具 有以下抗體的CDR的抗體組成的組合的組：992+1030、992+1024、992+1042、992+1320、 1277+1024。
[0083] 項22. -種抗體組合物，其包含至少2種有區(qū)別的抗人類EGFR抗體分子，
[0084] a.其中第一有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、包 含抗體992的'序列（SEQ ID N072的氨基酸3-109)和VH序列（SEQ ID N040的氨基酸 3-124)的抗體、具有抗體992的CDR3s(SEQ ID N0116和111)的抗體、與抗體992結(jié)合相同 表位的抗體、和能夠抑制抗體992與人類EGFR結(jié)合的抗體；且
[0085] b.其中第二有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、包 含抗體1024的'序列（SEQ ID N073的氨基酸3-114)和￥11序列（SEQ ID N041的氨基酸 3-120)的抗體、具有抗體1024的CDR3s(SEQ ID N0120和114)的抗體、與抗體1024結(jié)合相 同表位的抗體和能夠抑制抗體1024與人類EGFR結(jié)合的抗體。
[0086] 項23.項22的組合物，其中
[0087] a.該第一有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、包含 抗體992的 '和VH序列的抗體、具有抗體992的CDR3的抗體、和與抗體992結(jié)合相同表位 的抗體；且
[0088] b.該第二有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、包含 抗體1024的 '和VH序列的抗體、具有抗體1024的⑶R3的抗體、和與抗體1024結(jié)合相同 表位的抗體。
[0089] 項24.項22的組合物，其中
[0090] a.該第一有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、包含 抗體992的 '和VH序列的抗體、和具有抗體992的⑶R3的抗體；且
[0091] b.該第二有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、包含 抗體1024的 '和VH序列的抗體、和具有抗體1024的⑶R3的抗體。
[0092] 項25.項22的組合物，其中
[0093] a.該第一有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、和包 含抗體992的 '和VH序列的抗體；且
[0094] b.該第二有區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、和包 含抗體1024的 '和VH序列的抗體。
[0095] 項26.項22的組合物，其包含抗體992和1024。
[0096] 項27.項22的組合物，其中該第一和該第二抗EGFR抗體不抑制彼此與人類EGFR 的結(jié)合。
[0097] 項28.項22的組合物，其中所述抗體中的至少一者能夠增加其它抗體對人類EGFR 的最大結(jié)合能力。
[0098] 項29.項22的組合物，其中該組合物中的該第一抗體相對于該第二抗體的比例是 介于5%與95%之間，諸如介于10%與90%之間，較優(yōu)選介于20%與80%之間，更優(yōu)選介 于30 %與70 %之間，更優(yōu)選介于40 %與60 %之間，諸如介于45 %與55 %之間，諸如為約 50%。
[0099] 項30.項22的組合物，其中該第一和該第二抗體是同種型的IgGl或IgG2。
[0100] 項31.項22的組合物，其中與抗體992結(jié)合相同表位的該抗體是選自包含以下克 隆的抗體群：克隆 1209、1204、992、996、1033 和 1220。
[0101] 項32.項22的組合物，其中與抗體1024結(jié)合相同表位的該抗體是選自包含以下 克隆的抗體群：克隆 1031、1036、1042、984、1024、1210、1217、1221 和 1218。
[0102] 項33.項22的組合物，其中包含抗體992的⑶R3的該抗體另外包含抗體992的 VH 和 VL 的 CDR1 與 CDR2。
[0103] 項34.項22的組合物，其中包含抗體1024的⑶R3的該抗體另外包含抗體1024 的 VH 和 VL 的 CDR1 與 CDR2。
[0104] 項35.項22的組合物，其中與抗體992競爭的該抗體是選自由以下抗體組成的 組：抗體 1208、1254 和 1277。
[0105] 項36.項22的組合物，其中與抗體1024競爭的該抗體是選自由以下抗體組成的 組：抗體1042和1320。
[0106] 項37.項22的組合物，其中該組合物除該第一和該第二抗體之外不含有其它抗 EGFR抗體。
[0107] 項38.項22的組合物，其進(jìn)一步包含第三有區(qū)別的抗EGFR抗體，其中該第三有 區(qū)別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1030、包含抗體1030的 '序列 彼〇10勵74的氨基酸3-114(113))和￥11序列彼〇10勵42的氨基酸3-120)的抗體、具 有抗體1030的CDR3s(SEQ ID N0112和119)的抗體、與抗體1030結(jié)合相同表位的抗體、和 能夠抑制抗體1030與人類EGFR結(jié)合的抗體。
[0108] 項39.項37的組合物，其中該第三抗體使得該第一和/或第二抗體與人類EGFR 的結(jié)合增強(qiáng)。
[0109] 項40.項37的組合物，其中與抗體1030結(jié)合相同表位的該抗體是選自由以下克 隆組成的抗體群：克隆 1195、1030、1034、1194、980、981、1246 和 1223。
[0110] 項41.項37的組合物，其中包含抗體1030的⑶R3的該抗體另外包含抗體1030 的 VH 和 VL 的 CDR1 和 CDR2。
[0111] 項42.項38的組合物，其中該組合物除該第一、該第二、和該第三抗體之外不含有 其它抗EGFR抗體。
[0112] 項43.項22的組合物，其中所述有區(qū)別的抗體經(jīng)制備用于同時、依次或單獨(dú)給藥。
[0113] 項44.項22的組合物，其中該組合物使得受體內(nèi)化。
[0114] 項45.項22的組合物，其中該組合物使得體內(nèi)A431NS腫瘤退化。
[0115] 項46.項22的組合物，其中該組合物能夠誘導(dǎo)體內(nèi)A431NS細(xì)胞的終末分化。
[0116] 項47.項22的組合物，其中該組合物能夠上調(diào)體內(nèi)腫瘤內(nèi)披蛋白（involucrin) 表達(dá)。
[0117] 項48. -種雙特異性結(jié)合分子，其具有項22的抗體組合物的結(jié)合特異性。
[0118] 項49.項48的雙特異性結(jié)合分子，其包含抗體992和1024的⑶R。
[0119] 項50.項48的雙特異性結(jié)合分子，其為雙重可變域抗體。
[0120] 項51.項48的雙特異性結(jié)合分子，其為雙特異性Fab片段或雙特異性scFV。
[0121] 項52. -種制造抗體組合物的方法，其包含：
[0122] a)以編碼第一抗體的第一表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染第一真核細(xì)胞群體，所述第一抗體包含 能夠結(jié)合第一有區(qū)別的EGFR表位的VH和VL鏈的第一關(guān)聯(lián)對；
[0123] b)以編碼第二抗體的第二表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染第二真核細(xì)胞群體，所述第二抗體包含 能夠結(jié)合第二有區(qū)別的EGFR表位的VH和VL鏈的第二關(guān)聯(lián)對；
[0124] c)對于第三或其它群體、表達(dá)構(gòu)建體、關(guān)聯(lián)對、和EGFR表位任選地重復(fù)步驟b);
[0125] d)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的第一、第二和任選地其它細(xì)胞群體；
[0126] e)將所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的群體在一器皿中組合以獲得細(xì)胞庫（cell bank);
[0127] f)在允許所述抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)來自該細(xì)胞庫中的細(xì)胞；和
[0128] g)自上清液中回收且純化該抗體組合物。
[0129] 項53.項52的方法，其中該抗體組合物為項1至18中任一的抗體組合物。
[0130] 項54.項52的方法，其中所述細(xì)胞是以位點(diǎn)特異性整合方式轉(zhuǎn)染。
[0131] 項55.項52的方法，其中所述VH和VL鏈?zhǔn)莵碓从谑箢惽宜隹贵w的恒定區(qū)是來 源于人類。
[0132] 項56.項55的方法，其中所有抗體均包含相同重鏈恒定區(qū)。
[0133] 項57. -種細(xì)胞庫，其包含真核細(xì)胞的至少兩種子群體；各子群體是以一編碼包 含能夠結(jié)合有區(qū)別的EGFR表位的VH和VL鏈的關(guān)聯(lián)對之抗體的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0134] 項58.項57的細(xì)胞庫，其中該細(xì)胞庫編碼項1至18中任一的抗體組合物。
[0135] 項59.項57的細(xì)胞庫，其中所述細(xì)胞是使用位點(diǎn)特異性整合方式轉(zhuǎn)染。
[0136] 項60. -種降低EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包含向表達(dá)EGFR的細(xì)胞組合物施用項 1至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合分子，和降低該EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0137] 項61. -種殺死表達(dá)EGFR的細(xì)胞的方法，其包含向表達(dá)EGFR的細(xì)胞組合物施用 項1至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合分子，和殺死所述 EGFR表達(dá)細(xì)胞。
[0138] 項62. -種在表達(dá)EGFR的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包含向表達(dá)EGFR的細(xì) 胞組合物施用項1至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合分子， 由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0139] 項63. -種抑制表達(dá)EGFR的細(xì)胞增殖的方法，其包含向表達(dá)EGFR的細(xì)胞組合物 施用項1至47中任一項的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合分子，由此 抑制增殖。
[0140] 項64. -種誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分化的方法，其包含向患有癌癥的個體施用項1至 47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合分子，由此誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì) 胞分化。
[0141] 項65.項64的方法，其中該分化為終末分化。
[0142] 項66.項64的方法，其中該分化伴隨有內(nèi)披蛋白表達(dá)增加。
[0143] 項67. -種誘導(dǎo)EGFR內(nèi)化的方法，其包含向表達(dá)EGFR的細(xì)胞給藥有效量的項1 至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合分子，由此誘導(dǎo)EGFR內(nèi) 化。
[0144] 項68. -種藥物組合物，其包含呈組合形式用于在癌癥治療中同時、單獨(dú)或依次 施用的兩種或兩種以上項1至47項中任一的抗體、或項48至51中任一項的雙特異性結(jié)合 分子。
[0145] 項69.項68的制品，其進(jìn)一步包含呈組合形式用于在癌癥治療中同時、單獨(dú)或依 次施用的至少一種能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的化合物。
[0146] 項70.項69的制品，其中該化合物是選自由以下各物組成的組：視黃酸、苯基丁酸 鹽/酯、全反式視黃酸、活性形式維生素 D。
[0147] 項71.項68的制品，其進(jìn)一步包含呈組合形式用于在癌癥治療中同時、單獨(dú)或依 次施用的至少一種化療或抗腫瘤化合物。
[0148] 項72.項71的制品，其中該化療化合物是選自由以下各物組成的組：阿德力霉 素（adriamycin)、順鉬（cisplatin)、紫杉醇（taxol)、阿霉素（doxorubicin)、拓樸替康 (topotecan)、氟啼陡、奧賽力鉬（oxaliplatin)和伊立替康（irinotecan)。
[0149] 項73. -種多核苷酸，其是選自由以下各物組成的組：
[0150] a.具有顯示于SEQ ID N0100中的核酸序列的核酸；
[0151] b.編碼具有顯示于SEQ ID NolOl中的氨基酸序列的多肽的核酸；
[0152] c.具有顯示于SEQ ID N0102中的核酸序列的核酸；
[0153] d.編碼具有顯示于SEQ ID N0103中的氨基酸序列的多肽的核酸；和
[0154] e.具有a至d中任一者的互補(bǔ)序列的核酸。
[0155] 項74. -種表達(dá)載體，其包含項73的核酸，該核酸與能夠指導(dǎo)該核酸表達(dá)的啟動 子序列操作性連接。
[0156] 項75. -種細(xì)胞，其是以項74的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0157] 項76. -種多肽，其包含顯不于SEQ ID N0101中的氨基酸序列。
[0158] 項77. -種多肽，其包含顯示于SEQ ID N0103中的氨基酸序列。
[0159] 項78. -種用于篩選與稱猴（cynomolgous)EGFR結(jié)合的抗體的方法，其包含以下 步驟：
[0160] a.提供至少一種測試抗體；
[0161] b.實(shí)施測定以確定與以下部分結(jié)合的抗體：
[0162] i)獼猴 EGFR 的胞外域（SEQ ID N0101)或全長獼猴 EGFR(SEQ ID N0103);或
[0163] ii)表達(dá)該獼猴EGFR胞外域（SEQ ID N0101)或表達(dá)全長獼猴EGFR(SEQ ID N0103)的細(xì)胞的表面；
[0164] c.和選擇至少一種結(jié)合獼猴EGFR胞外域的抗體。
[0165] 項79.項78的方法，其進(jìn)一步包含就與人類EGFR胞外域的結(jié)合或與表達(dá)人類 EGFR的細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行篩選。
[0166] 項80. -種鑒別能夠增強(qiáng)另一抗EGFR抗體與EGFR的同時結(jié)合的抗EGFR抗體的 方法，該方法包含
[0167] a.在第一鑒定中，測定第一抗體對于固定量的EGFR抗原的最大結(jié)合能力，
[0168] b.在第二鑒定中，以第二抗EGFR抗體飽和固定量的EGFR抗原，
[0169] c.使該EGFR抗體復(fù)合物與該第一抗體接觸且測定最大結(jié)合能力，和
[0170] d.對比該結(jié)合能力以確定步驟c的該最大結(jié)合能力是否超過步驟a的最大結(jié)合能 力。
[0171] 項81.項80的方法，其中該EGFR抗原為固定在固體表面上的重組蛋白質(zhì)。
[0172] 項82.項80的方法，其中該EGFR抗原是存在于表達(dá)EGFR的細(xì)胞的表面上。
[0173] 項83.項82的方法，其中該細(xì)胞包含編碼EGFR的表達(dá)構(gòu)建體。
[0174] 項84.項80的方法，其中該第一抗體為免疫球蛋白且該第二抗體為Fab片段。
[0175] 項85.項80的方法，其中所述鑒定為ELISA。
[0176] 項86.項80的方法，其中EGFR抗原包含人類EGFR胞外域（SEQ ID N0108)或獼 猴 EGFR 胞外域（SEQ ID N0101)。
[0177] 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0178] 發(fā)明概述
[0179] 該鑒定可用于鑒別具有類似于抗體992與1024的特性的其它抗體組合。
[0180] 定義
[0181] 術(shù)語「抗體」描述血清的功能性組份且通常指分子集合（抗體或免疫球蛋白）或 一個分子（抗體分子或免疫球蛋白分子）?？贵w分子能夠與特定抗原決定簇（抗原或抗原 性表位）結(jié)合或反應(yīng)，此又可引起免疫效果機(jī)制的誘導(dǎo)。個別抗體分子通常認(rèn)為具有單特 異性，且抗體分子組合物可為單克隆（亦即由相同抗體分子組成）或多克?。ㄒ嗉从蓛煞N 或兩種以上與相同抗原或甚至有區(qū)別的不同抗原上的相同或不同表位反應(yīng)的不同抗體分 子組成）。各抗體分子均具有使其能夠特異性地與其相應(yīng)抗原結(jié)合的有區(qū)別的結(jié)構(gòu)，且所 有天然抗體分子均具有相同總的基本結(jié)構(gòu)：兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。抗體亦共同稱 為免疫球蛋白。如本文中所使用的術(shù)語抗體亦意欲包括嵌合及單鏈抗體以及抗體的結(jié)合片 段，諸如Fab、Fv片段或scFv片段，以及多聚形式，諸如二聚IgA分子或五價IgM?？贵w可 為人類、鼠類、嵌合、人源化或再成型抗體。
[0182] 術(shù)語「關(guān)聯(lián)VH和VL編碼對」描述來源于（或包含于）相同抗體產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的VH 和VL編碼序列的初始對。因此，關(guān)聯(lián)VH和VL對代表最初存在于該細(xì)胞所來源的供體中的 VH和VL配對。術(shù)語「由VH和VL編碼對表達(dá)的抗體」表明抗體或抗體片段是由含有VH和 VL編碼序列的載體、質(zhì)?；蝾愃莆锂a(chǎn)生。當(dāng)關(guān)聯(lián)VH和VL編碼對表達(dá)為完全抗體或其穩(wěn)定 片段時，其保持最初由其所來源的細(xì)胞表達(dá)的抗體的結(jié)合親和力及特異性。關(guān)聯(lián)對文庫亦 稱為關(guān)聯(lián)對的全套（repertoire)或集合，且可個別地保存或匯集。
[0183] 術(shù)語「CDR(complementarity determining region)」-互補(bǔ)決定區(qū)是如 Lefranc 等人（2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol27, 55-77 中所定義。
[0184] 術(shù)語「重組多克隆蛋白質(zhì)的有區(qū)別的成員」表示包含不同但同源蛋白質(zhì)分子的蛋 白質(zhì)組合物中的一種蛋白質(zhì)分子，其中各蛋白質(zhì)分子與該組合物中的其它分子同源，且亦 含有一或多段可變多肽序列，其特征在于多克隆蛋白質(zhì)中的個別成員之間的氨基酸序列的 差異。
[0185] 術(shù)語「頭接頭啟動子（head-to-head promoter)」是指將啟動子對以密切接近方式 安置以使由該等啟動子驅(qū)動的兩個基因片段的轉(zhuǎn)錄以相反的方向進(jìn)行。頭接頭啟動子亦可 以兩個啟動子之間由不相關(guān)核酸組成的填充片段構(gòu)建。該填充片段可容易地含有多于500 個核昔fe。頭接頭啟動子亦可稱為雙向啟動子。
[0186] 術(shù)語「免疫球蛋白」通常用作存在于血液或血清中的抗體的混合物的通用名稱，但 亦可用于表示來源于其它來源的抗體的混合物。
[0187] 術(shù)語「免疫球蛋白分子」表示個別抗體分子，例如作為免疫球蛋白的一部分，或任 何多克隆或單克隆抗體組合物的一部分。
[0188] 術(shù)語「所關(guān)注的變異核酸分子文庫」是用于描述共同編碼「所關(guān)注的重組多克隆 蛋白質(zhì)」的核酸分子的集合。當(dāng)用于轉(zhuǎn)染時，所關(guān)注的變異核酸分子文庫是含于表達(dá)載體文 庫中。該文庫通常具有至少2、3、5、10、20、50、1000、10 4、105或106個不同成員。
[0189] 術(shù)語「質(zhì)量傳遞（mass transfer)」是用于描述所關(guān)注的核酸序列自一載體群體傳 遞至另一載體群體，且對各DNA同時如此進(jìn)行而不借助于所關(guān)注的個別DNA的分離。該等 載體群體可為含有（例如）所關(guān)注的可變區(qū)、啟動子、前導(dǎo)區(qū)或增強(qiáng)組件的文庫。該等序列 可隨后在不預(yù)先自（例如）噬菌體載體分離的情況下移至哺乳動物表達(dá)載體中。尤其對于 抗體序列而言，該技術(shù)確保在將文庫自（例如）選擇載體（例如噬菌體呈現(xiàn)載體）移至哺 乳動物表達(dá)載體時不喪失V H與\之間的連接的多樣性。據(jù)此保留VH和VL的初始配對。
[0190] 如本文中所使用的術(shù)語「操作性連接（operably linked)」是指一片段當(dāng)置于與另 一片段的功能關(guān)系中時與該另一片段連接。舉例而言，編碼信號序列的DNA若表達(dá)為參與 多肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之前導(dǎo)序列則與編碼該多肽的DNA操作性連接。再者，啟動子或增強(qiáng)子 若刺激編碼序列的轉(zhuǎn)錄則與該序列操作性連接。
[0191] 術(shù)語「多克隆抗體」描述能夠與相同或不同抗原上的若干不同特定抗原決定簇結(jié) 合或反應(yīng)的不同抗體分子的組合物。通常認(rèn)為多克隆抗體的可變性是位于所謂的多克隆抗 體的可變區(qū)中。然而，在本發(fā)明的上下文中，多克隆性亦可理解為描述個別抗體分子之間的 存在于所謂恒定區(qū)中的差異，例如在含有兩種或兩種以上抗體同種型的抗體混合物的情況 下，該等抗體同種型諸如人類同種型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2,或鼠類同種型 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。出于本發(fā)明的目的，該多克隆抗體亦可稱為「抗體組合 物」。
[0192] 術(shù)語「表位」通常用于描述動物中，較優(yōu)選哺乳動物中且最優(yōu)選人類中具有抗原 或免疫原活性的較大分子的片段（proportion)或較大分子的部分（例如抗原或抗原性位 點(diǎn)）。具有免疫原活性的表位為引發(fā)動物中抗體反應(yīng)的較大分子的一部分。具有抗原活性 的表位為較大分子的由此項技術(shù)中熟知的任何方法（例如由本文所述的免疫鑒定）所確定 的抗體免疫特異性結(jié)合的部分。抗原性表位不必具有免疫原性?？乖瓰榭贵w或抗體片段免 疫特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如毒素、病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)或DNA。抗原或抗原位點(diǎn)通常具有一個 以上表位，除非其極小，且通常能夠刺激免疫反應(yīng)。表位可為線性的或構(gòu)形的。線性表位由 蛋白質(zhì)分子上的由抗體識別的約6至10個鄰接氨基酸組成。相反，構(gòu)形（conformational) 表位由不依次排列的氨基酸組成。此處抗體僅識別3維結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子折疊成三維結(jié) 構(gòu)時，形成表位的氨基酸并置以使抗體能夠識別該序列。在變性蛋白質(zhì)中僅線性表位可被 識別。根據(jù)定義，構(gòu)形表位須處于折疊蛋白質(zhì)的外部。識別構(gòu)形表位的抗體可能僅在輕微、 未變性程序下結(jié)合。與相同抗原上的不同表位結(jié)合的抗體視表位的位置而定可對其所結(jié)合 的抗原的活性具有不同的效果。與抗原的活性位點(diǎn)中的表位結(jié)合的抗體可完全阻斷該抗原 的功能，而在不同表位處結(jié)合的另一抗體可能單獨(dú)對抗原活性無效果或具有極小效果。然 而該等抗體仍可活化互補(bǔ)序列且因此使抗原消除，且當(dāng)與一或多種在相同抗原的不同表位 上結(jié)合的抗體組合時可產(chǎn)生協(xié)同效果。在本發(fā)明中，表位較優(yōu)選為EGFR胞外域的片段。本 發(fā)明的抗原較優(yōu)選為抗體或抗體片段免疫特異性結(jié)合的胞外域EGFR蛋白質(zhì)、多肽或其片 段。EGFR相關(guān)抗原亦可為抗體或抗體片段免疫特異性結(jié)合的EGFR多肽胞外域或其片段的 類似物或衍生物。
[0193] 能夠彼此競爭結(jié)合相同抗原的抗體可結(jié)合相同或重疊（overlapping)的表位或 可具有彼此密切接近的結(jié)合位點(diǎn)，以便競爭主要由空間障礙引起。測定抗體之間的競爭的 方法是描述于實(shí)施例中。
[0194] 如本文中所使用的術(shù)語「多克隆蛋白質(zhì)」或「多克隆性」是指包含不同但同源蛋白 質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組合物，該等蛋白質(zhì)分子較優(yōu)選選自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白質(zhì)分 子與組合物的其它分子同源，且亦含有一或多段可變多肽序列，其特征在于多克隆蛋白質(zhì) 的個別成員之間氨基酸序列的差異。該等多克隆蛋白質(zhì)的已知實(shí)例包括抗體或免疫球蛋白 分子、T細(xì)胞受體及B細(xì)胞受體。多克隆蛋白質(zhì)可由所定義的蛋白質(zhì)分子子集組成，所述子 集已由諸如對所需目標(biāo)的共有結(jié)合活性的共同特征定義，例如在針對所需目標(biāo)抗原的多克 隆抗體情況下。
[0195] 「蛋白質(zhì)」或「多肽」意謂任何氨基酸鏈，不考慮長度或翻譯后修飾。蛋白質(zhì)可以單 體或的多聚體形式存在，包含兩個或兩個以上經(jīng)組裝的多肽鏈、蛋白質(zhì)片段、多肽、寡肽或 肽。
[0196] 術(shù)語「RFLP」是指「限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism)」，一種在以限制酶裂解之后分析核酸分子片段的位移的膠體模式的方法。
[0197] 術(shù)語「不規(guī)則性（scrambling)」描述以下情況，其中由個別細(xì)胞表達(dá)出兩種或兩 種以上包含兩種不同多肽鏈（例如來自免疫球蛋白超家族）的多克隆蛋白質(zhì)的不同成員。 該情況可在個別細(xì)胞整合入一對以上基因片段至基因組中時出現(xiàn)，其中各對基因片段編碼 多克隆蛋白質(zhì)的不同成員。在該等情況中，可產(chǎn)生由該等基因片段表達(dá)的非所需多肽鏈組 合。該等非所需多肽鏈組合可能不具有任何治療效果。
[0198] 術(shù)語「VH-'鏈不規(guī)則性」為以上定義的不規(guī)則性的實(shí)例。在該實(shí)例中，VH和VL編 碼基因片段構(gòu)成一對基因片段。該不規(guī)則性在由細(xì)胞產(chǎn)生非所需VH和VL多肽組合時發(fā)生， 其中兩個不同VH和VL編碼基因片段對是整合入同一細(xì)胞中。該不規(guī)則性抗體分子不太可 能保留其初始特異性且因此可能不具有任何治療效果。
[0199] 術(shù)語「轉(zhuǎn)染」在本文中用作將外來DNA引入細(xì)胞中的廣義術(shù)語。該術(shù)語亦意欲涵 蓋將外來DNA引入細(xì)胞中的其它功能等效方法，諸如轉(zhuǎn)化、感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或供體細(xì)胞與受體細(xì) 胞的融合。
[0200] 術(shù)語「可變多肽序列」及「可變區(qū)」可互換使用。
[0201] 術(shù)語「有區(qū)別的表位」意謂當(dāng)兩種不同抗體結(jié)合有區(qū)別的表位時，存在低于100% 的抗原結(jié)合競爭，較優(yōu)選低于50%的抗原結(jié)合競爭，更優(yōu)選基本上無抗原結(jié)合競爭。抗體對 的「有區(qū)別的表位」的分析通常通過在飽和抗體條件下使用對表達(dá)EGFR的細(xì)胞及個別熒光 標(biāo)記抗體的FACS分析，或如實(shí)施例中所述使用捕獲或結(jié)合至流動單元（cell)表面的EGFR 抗原的表面電漿共振的結(jié)合實(shí)驗來測定。
[0202] 術(shù)語能夠「抑制EGF結(jié)合」當(dāng)應(yīng)用于一種抗體分子時意謂該抗體分子對于與EGFR 結(jié)合的EGF展現(xiàn)的IC50值小于10nM，較優(yōu)選小于8nM，更優(yōu)選小于7nM，更優(yōu)選小于5nM，更 優(yōu)選小于4nM，更優(yōu)選小于3nM，更優(yōu)選小于2nM，更優(yōu)選小于2nM，更優(yōu)選小于InM。
[0203] 術(shù)語「表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor)」、「EGFR」及 「EGFR抗原」在本文中可互換使用，且包括人類EGFR的變異體、同功異型物及物種同源物。 在一較優(yōu)選具體實(shí)例中，本發(fā)明的抗體與EGFR抗原的結(jié)合通過抑制或阻斷EGFR配體與 EGFR的結(jié)合抑制表達(dá)EGFR的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）的生長。術(shù)語「EGFR配體」包含EGFR 的所有（例如生理學(xué)）配體，包括（但不限于）EGF、TGF-α、結(jié)合EGF的肝素（ΗΒ-EGF)、雙 調(diào)蛋白（amphiregulin ;AR)、和瑞古林（heregulin)、β -細(xì)胞調(diào)節(jié)素（cellulin)及表皮調(diào) 節(jié)素（epiregulin;EPI)。在另一較優(yōu)選具體實(shí)例中，本發(fā)明的抗體與EGFR抗原的結(jié)合介 導(dǎo)效果細(xì)胞吞噬作用和/或殺死表達(dá)EGFR的細(xì)胞。
[0204] EGFR域結(jié)構(gòu)：成熟EGFR(SwissProt acc. #P00533)的細(xì)胞外部分由621個氨基酸 及四個受體域組成：域I包含殘基1-165,域II包含殘基166-312,域III包含殘基313-481 及域 IV 包含 482-621 (Cochran 等人 2004J immunol. Methods287, 147-158)。已提出域 I 及 域III有助于形成配體的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。域II及域IV為富含半胱氨酸層粘連蛋白樣 區(qū)域，其使蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定且含有可能的EGFR二聚界面。
[0205] 如本文中所使用的術(shù)語「抑制生長」（例如提及細(xì)胞）意欲包括當(dāng)使細(xì)胞與抗EGFR 抗體接觸時，與未與抗EGFR抗體接觸的相同細(xì)胞的生長相比，前者的增殖（細(xì)胞數(shù)目增加） 或代謝的可測量任何的減少，例如，抑制細(xì)胞培養(yǎng)物的生長至少約1 〇 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。
[0206] 如本文中所使用的術(shù)語「抑制結(jié)合」及「阻斷結(jié)合」（例如提及抑制/阻斷EGFR 配體與EGFR的結(jié)合）可互換使用且包含部分與完全抑制/阻斷。抑制/阻斷EGFR配體與 EGFR結(jié)合較優(yōu)選降低或改變在未抑制或阻斷的情況下EGFR配體與EGFR結(jié)合時存在的細(xì)胞 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常程度或類型。抑制及阻斷亦意欲包括EGFR配體在與抗EGFR抗體接觸時， 與未與抗EGFR抗體接觸相比，前者與EGFR的結(jié)合親和力的可測量任何的減少，例如，阻斷 EGFR 配體與 EGFR 的結(jié)合至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。
[0207] 術(shù)語「重組抗體」是用于描述由細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)的一抗體分子或若干分子，其中 該細(xì)胞或細(xì)胞系是經(jīng)包含不與該細(xì)胞天然相關(guān)的該抗體的編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
[0208] 【圖式簡單說明】
[0209] 圖1 :脾細(xì)胞分選（對于詳情請參見實(shí)施例1)。制作（描述）以下門：
[0210] ?門1 :活細(xì)胞（FSC/碘化丙啶圖）。（左下圖）
[0211] ?門2 :將漿細(xì)胞以CD43陽性/CD138陽性形式的門被圈選。（右下圖）
[0212] ?門 3 :雙峰辨別（doublet discrimination)(右上圖）
[0213] 圖2 :鼠類-mSymplex?PCR。用于擴(kuò)增及同源（cognate)連接來自單一細(xì)胞的重鏈 及輕鏈抗體基因的多重重疊延伸RT-PCR。對于詳情請參考實(shí)施例1。
[0214] 圖3 :鼠類全套克隆。通過重疊延伸拼接將來自單一漿細(xì)胞的編碼VH/\基因?qū)Φ?mSymplex?PCR產(chǎn)物池拼接至編碼人類κ恒定輕鏈的基因上。將編碼完全人類-小鼠嵌合 抗體的基因池插入表達(dá)載體中，繼而插入雙向啟動子盒（2XCMV)。
[0215] 圖4 :哺乳動物全長抗體表達(dá)載體00-VP-002的示意性代表圖。Amp及Amp pro， 氨芐青霉素（ampicillin)抗性基因及其啟動子；pUC起點(diǎn)，pUC復(fù)制起點(diǎn)；CMV，驅(qū)動輕鏈及 重鏈表達(dá)的哺乳動物啟動子；IGHV前導(dǎo)區(qū)，基因組人類重鏈前導(dǎo)區(qū)；Η填充片段，交換重鏈 可變區(qū)編碼序列的插入物；IGHG1，編碼基因組免疫球蛋白同種型G1重鏈恒定區(qū)的序列（序 列顯示于附錄2中）；兔Β-珠蛋白Α，兔β-珠蛋白polyA序列；IGKV前導(dǎo)區(qū)，鼠類κ前導(dǎo) 區(qū)；L填充片段，交換輕鏈編碼序列的插入物；SV40term，猿猴病毒40終止子序列；FRT，F(xiàn)lp 識別目標(biāo)位點(diǎn)；Neo,新霉素（neomycin)抗性基因；SV40poly A，猿猴病毒40poly A信號序 列。
[0216] 圖5 :450-620nm下吸光率差異的群分析。將上清液通過反應(yīng)性群，如克隆編號之 后的數(shù)字（1至4)所指示。深灰色表明代謝活性細(xì)胞數(shù)目減少，而淡灰色表明代謝活性細(xì) 胞數(shù)目增加。黑色表明上清液對于代謝活性細(xì)胞的數(shù)目無影響。
[0217] 圖6A-B :如競爭ELISA中所測定的抗EGFR抗體對所列針對特定EGFR域的參考抗 體的抑制程度。A)抑制計算。B)如下對抑制記分：25-49% :中度競爭（+) ;50-74% :強(qiáng)烈 競爭（++) ;75-100% :極強(qiáng)烈競爭（+++)。顯不顯著抑制（50-100% )的框填入灰色陰影。 艾比特思及維克替比以雙重復(fù)展示（四次獨(dú)立實(shí)驗）以說明鑒定的再現(xiàn)性。Ab2(225)為產(chǎn) 生艾比特思的鼠類前軀物。
[0218] 圖7 :在Biacore3000SPR機(jī)器上執(zhí)行的單表位定位循環(huán)的說明圖，其中樣品mAb 與四種不同參考抗體競爭結(jié)合EGFR胞外域。
[0219] 圖8A-B :如由使用SPR技術(shù)的競爭分析所測定的抗EGFR抗體對所列針對特定 EGFR域的參考抗體的抑制程度。A)抑制計算。B)如下對抑制記分：25-49%:中度競爭（+); 50-74% :強(qiáng)烈競爭（++) :75-1005^:極強(qiáng)烈競爭（+++)。顯不顯著抑制（50-100% )的格為 填入灰色陰影。標(biāo)記*的克隆1229在該Biacore鑒定中不結(jié)合。
[0220] 圖9A-B :通過抗EGFR抗體對的SPR競爭分析對抗EGFR抗體全套內(nèi)表位群的測定。 將抗體根據(jù)假定的EGFR域識別分組。將其中發(fā)現(xiàn)抗體組合結(jié)合重疊表位產(chǎn)生大于50%抑 制的格填入灰色陰影。將未進(jìn)行測定的格填成黑色。A)抑制計算。B)如下對抑制記分： 25-49% :中度競爭（+) ;50-74% :強(qiáng)烈競爭（++) ;75-100% :極強(qiáng)烈競爭（+++)。
[0221] 圖10A-B :如通過Biacore分析所測定的針對EGFR胞外域的參考抗體及抗EGFR抗 體的表位定位。A)針對EGFR細(xì)胞外域（ECD)的域I或域I/II的抗體的表位定位。B)針 對EGFR E⑶的域III的抗體的表位定位。
[0222] 圖11A-D :針對EGFR上的不重疊表位的抗體的寡克隆混合物的同時結(jié)合的研究。 A)依次添加針對域III、域I或未知特異性的抗體。單一樣品mAb對于不同mAb混合物或 單一 mAb測試的抑制值是顯示于填入陰影的框中。亦展示用于計算抑制的Ru最大值。B) 針對EGFR上的不重疊表位的六種不同樣品mAb與含有六種測試抗體的抗體混合物的競爭 分析。不包括測試樣品抗體的抗體混合物充當(dāng)陽性對照。單一樣品mAb針對不同mAb混合 物測試的抑制值是顯示于填入陰影的框中。亦展示用于計算抑制的Ru最大值。C)B中的分 析的相應(yīng)感應(yīng)圖說明抗體阻斷且在某些情況下抗體增強(qiáng)結(jié)合。D)對于六種mAb抗體混合物 測試針對域I、I/II及未知特異性的其它抗體。
[0223] 圖12A-B :通過對全長EGFR進(jìn)行抗體滴定及檢測與鏈霉抗生物素 HRP試劑結(jié)合的 經(jīng)生物素標(biāo)記的EGF配體來測定抗體介導(dǎo)的EGF配體阻斷。分別將艾比特思、維克替比及 西那格思IgG(帕利珠單抗）用作陽性及陰性對照。以測試抗體阻斷所識別的抗體表位之 后,通過添加用于檢測的0. 1 μ g/ml經(jīng)生物素標(biāo)記的EGF配體及二級鏈霉抗生物素 -HRP偶 聯(lián)物來觀測EGF配體競爭程度。
[0224] 圖13A-B :以指定抗體預(yù)處理對HN5細(xì)胞中EGF(50ng/ml)誘導(dǎo)的EGFR磷酸化的效 果。將圖中所指定的抗體（10 μ g/ml)與細(xì)胞一起培育30分鐘，隨后添加 EGF保持7. 5min。 標(biāo)記*的數(shù)據(jù)組顯著地不同于對照（(_) Ctrl)數(shù)據(jù)組（p〈0. 05)。A. 1208對EGFR磷酸化具 有顯著保護(hù)效果。B. 1277及1320顯著地防止EGF誘導(dǎo)的磷酸化。誤差線表示三個獨(dú)立實(shí) 驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0225] 圖14 :HN5細(xì)胞中磷酸化EGFR(pEGFR)及EGFR的細(xì)胞內(nèi)Western分析?；旌衔?表示992、1030與1042的最終濃度為10 μ g/ml的等摩爾混合物，其它抗體是以各10 μ g/ ml的濃度使用。添加50 μ g/ml EGF保持7. 5min，隨后固定以刺激EGFR磷酸化。誤差線表 示6個獨(dú)立（ctlr-)或3個獨(dú)立數(shù)據(jù)點(diǎn)（992、1030、1042、混合物或艾比特思）的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 992、1030、混合物及艾比特思對于磷酸化具有顯著（* = p〈0. 05)保護(hù)效果。
[0226] 圖15 :培育抗體對EGFR內(nèi)化的效果。數(shù)據(jù)是以自細(xì)胞表面所移除的受體相對于 初始染色的百分比的形式展示。誤差線對應(yīng)于SEM。
[0227] 圖16八-(：4431-呢細(xì)胞在不同濃度的抗體992、1030及1042及其混合物存在下由 與未經(jīng)處理的對照相比的代謝活性細(xì)胞百分比測量的生長曲線。1001為以類似同種型用作 陰性對照的非功能抗體。
[0228] 圖17 :A431-NS細(xì)胞在10μ g/ml抗體992U030及1042及其混合物及不同濃度 EGFR配體EGF存在下由450nm下的吸光率測量的生長曲線。1001為以類似同種型用作陰 性對照的非功能抗體。
[0229] 圖18 :A431-NS細(xì)胞在不同濃度的抗體992及992與結(jié)合存在于域1、11或III中 的不重疊表位的抗體的混合物存在下的生長曲線。1001為以類似同種型用作陰性對照的非 功能抗體。
[0230] 圖19 :A431NS細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。以10倍稀釋液測試EGFR-混合物、個別單克隆 抗體、艾比特思及維克替比。使用Roche的ELISA試劑盒測量凋亡細(xì)胞的組蛋白-DNA復(fù)合 物。
[0231] 圖20 :向每組有10只裸Balb/C Nu/Nu小鼠的四個組接種1X106個A431NS細(xì)胞。 當(dāng)腫瘤為約100mm3時開始處理。如箭頭所指示，在實(shí)驗期間向各組注射lmg/ml抗體五次。 以數(shù)位測徑器（callipers)測量腫瘤直徑。結(jié)果是以平均腫瘤體積（+/-SEM)形式展示。
[0232] 圖21 :當(dāng)個別小鼠在圖20中所展示的實(shí)驗中被處死時，切除腫瘤且稱重。展示平 均值+/-SEM。星號表明顯著性為P〈0. 05。
[0233] 圖22 :A431_NS球狀體在10μ g/ml抗體1001、艾比特思、維克替比及結(jié)合不重疊 表位的三種抗體的混合物992+1030+1042存在下的生長。1001為以類似同種型用作陰性對 照的非功能抗體。
[0234] 圖23A-B :自來源于獼猴皮膚表皮的cDNA克隆的獼猴EGFR細(xì)胞外域的DNA(SEQ ID No. 100)及蛋白質(zhì)序列（SEQ ID NO. 101)。
[0235] 圖24 :所獲得的獼猴EGFR ECD蛋白質(zhì)序列（SEQ ID NO. 101)與自GENBANK登錄號 X00588獲得的人類EGFR ECD(SEQ ID N0108)的比對。亦展示一致序列（SEQ ID N0109)。
[0236] 圖25A-B :ELISA鑒定辨別結(jié)合人類或獼猴EGFR E⑶或兩者的交叉反應(yīng)性與物種 特異性抗體的實(shí)施例。
[0237] 圖26 :來自異種移植小鼠的四個實(shí)驗組中的每一者的代表性腫瘤切片的顯微照 片。在200倍放大率下，箭頭指向體內(nèi)A431細(xì)胞終末分化的集落（foci)。注意到在以三種 抗EGFR克隆的混合物（992+1030+1042)處理的腫瘤中具有顯著較大且較多終末分化的集 落（上面兩張圖）。
[0238] 圖27 :A)在添加10 μ g/ml對照抗體（利妥昔單抗（Rituximab)，抗CD-20)或992 與1024的抗EGFR抗體混合物之后24小時以40倍放大率采集的HN5球狀體的圖像。B)使 用軟件Image J對由細(xì)胞覆蓋的面積定量（*p〈0. 01)。
[0239] 圖28 :以未經(jīng)處理對照組的百分比形式展示四個處理組中內(nèi)披蛋白 (Involucrin)含量的圖〇#C3p〈0. 005,分別與艾比特思、維克替比及陰性對照組相比較）。
[0240] 圖29 :A)以60倍放大率采集的與10 μ g/ml Alexa-488標(biāo)記的艾比特思或 992+1024 -起培育2小時的HN5及A431NS細(xì)胞的圖像。B)以60倍放大率使用小針孔采 集的與10 μ g/ml Alexa-488標(biāo)記的艾比特思或992+1024 -起培育2小時的A431NS細(xì)胞 的圖像。
[0241] 圖30 :A)以60倍放大率采集的與10 μ g/ml Alexa-488標(biāo)記的艾比特思或 992+1024 -起培育指定時段的HN5細(xì)胞的圖像。
[0242] 圖31A-B :通過在ELISA中對A431-NS細(xì)胞及經(jīng)純化全長EGFR進(jìn)行連續(xù)抗體滴定 測定Fab992、1024及1030的抗原呈遞特異性。結(jié)合的Fab抗體是通過二級山羊抗人類Fab 特異性HRP偶聯(lián)物觀測。A)針對來自A431細(xì)胞的經(jīng)純化全長EGFR測試的Fab抗體。B) 針對表達(dá)于A431-NS細(xì)胞表面上的EGFR測試的Fab抗體。
[0243] 圖32A-B :通過在ELISA中對三聚甲醛固定的A431-NS細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)滴定測定抗 體992、1024、1030、艾比特思及維克替比的IgG及Fab片段的功能性親和力。結(jié)合的Fab及 IgG抗體是通過二級山羊抗人類Fab特異性HRP偶聯(lián)物觀測?？筊SV蛋白質(zhì)F抗體西那格 思是用作陰性對照抗體，且在所用ELISA鑒定中不展示任何結(jié)合。A) IgG抗體與A431-NS細(xì) 胞的功能性結(jié)合。B)Fab抗體與A431-NS細(xì)胞的功能性結(jié)合。
[0244] 圖33A-C :預(yù)先以結(jié)合不重疊表位的Fab片段飽和受體之后對IgG與A431-NS細(xì) 胞上的EGFR結(jié)合增強(qiáng)的測定。使指定Fab片段飽和在A431-NS細(xì)胞上所識別的EGFR表位 30min，之后連續(xù)滴定特定IgG抗體，且在添加或不添加 Fab的情況下結(jié)合的IgG是通過二 級小鼠抗人類Fc HRP偶聯(lián)物觀測。A)預(yù)先以或未以指定Fab片段飽和受體的情況下IgG992 與A431-NS細(xì)胞的結(jié)合特征。B)預(yù)先以或未以指定Fab片段飽和受體的情況下IgG1024與 A431-NS細(xì)胞的結(jié)合特征。C)預(yù)先以或未以指定Fab片段飽和受體的情況下IgG1030與 A431-NS細(xì)胞的結(jié)合特征。
[0245] 圖34A-B :獼猴全長EGFR cDNA(圖34A ;SEQ ID N0102)及所編碼的蛋白質(zhì)（圖 34B ;SEQ ID N0103)。
[0246] 圖35 :A431NS中以1 μ g/ml指定抗體/組合獲得的細(xì)胞凋亡。以來自Roche的 ELISA試劑盒檢測組蛋白-DNA復(fù)合物。細(xì)胞凋亡程度是與陽性對照（最大細(xì)胞凋亡）有 關(guān)。
[0247] 圖36 :向Balb/C nu/nu小鼠注射1X106個A431NS細(xì)胞。當(dāng)腫瘤平均為約100mm3 時開始處理。小鼠接受17次抗體注射。第一次處理開始于第8日且最后一次在第34日。 抗體/組合物以每劑〇. 5mg或每劑0. 17mg注射。展示腫瘤體積的平均值+/-SEM。
[0248] 圖37 :A431NS增殖的抑制。X軸展示本發(fā)明的3種抗體的不同代表性組合。Y軸 展示呈未經(jīng)處理的對照（對照）的百分比形式的代謝活性。誤差線表示+/-SEM。對于其它 詳情請參見實(shí)施例6。
[0249] 圖38 :兩種不同劑量的992+1024混合物與艾比特思相比在A431NS人類腫瘤異 種移植物中的生長抑制效果。向BALB/c nu/nu小鼠接種106個A431NS細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到 100mm3的平均尺寸時（第8日），將小鼠隨機(jī)分成每組9只的組且開始處理。將指定抗體以 每劑0.5mg或每劑lmg注射，每周兩次總共9次注射。圖上的淡灰區(qū)域表明處理階段。開始 的虛線表示給定組中第一小鼠由于過度腫瘤尺寸而進(jìn)行安樂死的時間點(diǎn)。在第60日計算 每周2mg992+1024與每周2mg艾比特思及每周lmg992+1024與每周2mg艾比特思之間的統(tǒng) 計學(xué)顯著差異，其中除每周2mg992+1024組以外，所有組均終止。保留第60日之前排除的 動物的腫瘤尺寸，因此，該圖展示給定組中所有小鼠的累計腫瘤體積。展示平均值+/-SEM。
[0250] 圖39 :以992+1024抗體混合物、艾比特思或?qū)φ湛贵w處理（與圖38中所示相同 的實(shí)驗）的小鼠的存活率的Kaplan-Meyer圖。結(jié)果以經(jīng)處理小鼠的存活率百分比形式 呈現(xiàn)。當(dāng)對比992+1024與艾比特思時，觀察到高劑量（每周2mg，P = 0. 0008)與低劑量 (每周lmg，P = 0. 0004)組中小鼠存活率百分比之間的顯著差異。亦，當(dāng)與高劑量艾比特 思相比時低劑量992+1024顯著較佳（P = 0.0087)。使用對數(shù)等級檢驗（Log-rank test) (Mantel-Cox)計算統(tǒng)計學(xué)差異。
[0251] 圖40A-C :通過FACS分析進(jìn)行IgG992、1024及1320針對經(jīng)全長人類與獼猴EGFR 轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞的交叉反應(yīng)性的分析。結(jié)合抗體是以PE標(biāo)記的山羊F(ab'）2抗人類IgG FC 檢測。對表達(dá)EGFR的均勻細(xì)胞（SCC/FCS特性）執(zhí)行的門被圈選。結(jié)合是表示為InM濃度 下最大抗體結(jié)合％。
[0252] 圖41A-B :992(A)及1024⑶的重鏈與輕鏈的鼠類（chi)與人源化（hu)候選者 可變區(qū)的可變區(qū)氨基酸序列的Clustalw2比對。將如MGT所定義的⑶R區(qū)域加下劃線； 間隙由（_)表示，相同氨基酸由（*)表示，保守突變表示為（:），半保守突變表示為（.）。黑 體氨基酸表明在全人類框架變異體顯示降低的結(jié)合親和力的情況執(zhí)行回復(fù)突變?yōu)槌跏艰b 別出的鼠類殘基的氨基酸位置。序列ID如下編號：人源化992VH(SEQ ID N0104)。人源化 992VL(SEQ ID N0105)。人源化 1024VH(SEQ ID N0106)。人源化 1024VL(SEQ ID N0107)。嵌 合992VH(SEQ ID N040 的aa3-124)。嵌合992VL(SEQ ID No72 的aa3-109)。嵌合 1024VH(SEQ ID N041 的 aa3-120)。嵌合 1024VL(SEQ ID N073 的 aa3-114)。
[0253] 圖42A :992L1024的雙重可變域編碼基因的示意性代表圖；992L1024IGHV(751bp) 自5' AscI限制性位點(diǎn)開始表示，繼而為992IGHV、ASTKGP接頭、1024IGHV，且終止于3' Xhol 限制性位點(diǎn)，992L1024IGKV(1071bp)自5'NheI限制性位點(diǎn)開始表示，繼而為992IGKV、 TVAAP接頭、1024IGKV、IGKC且終止于3' Notl限制性位點(diǎn)。
[0254] 圖42B :1024L992的雙重可變域編碼基因的示意性代表圖；1024L992IGHV(751bp) 自5^8(：1限制性位點(diǎn)開始表示，繼而為102416狀431'1--接頭、99216狀，且終止于3111〇1 限制性位點(diǎn)，1024L992IGKV(1071bp)自5'NheI限制性位點(diǎn)開始表示，繼而為1024IGKV、 TVAAP接頭、992IGKV、IGKC且終止于3' Notl限制性位點(diǎn)。
[0255] 【實(shí)施方式】
[0256] 發(fā)明詳述
[0257] 抗體混合物
[0258] 在一具體實(shí)例中，本發(fā)明是關(guān)于包含能夠結(jié)合至少三個有區(qū)別的EGFR表位，較優(yōu) 選三個不重疊 EGFR表位的抗體分子的抗體組合物?？贵w的不重疊性質(zhì)較優(yōu)選使用經(jīng)不同 標(biāo)記的抗體在使用EGFR表達(dá)細(xì)胞的FACS分析中確定或通過使用利用經(jīng)捕獲或接合至流動 單兀表面的EGFR抗原的表面電楽共振確定。亦可使用如實(shí)施例中所述的基于ELISA的方 法。結(jié)合三個不重疊 EGFR表位的組合物可用于針對較寬范圍的EGFR依賴性癌癥類型，因為 與靶向一或兩個表位的單克隆抗體組合物相比，其較不易受EGFR構(gòu)形差異影響且不易受 突變影響。此外，結(jié)合三種不重疊 EGFR表位的抗體組合物與靶向較少表位的組合物相比可 提供優(yōu)良的功效。詳言的，該抗體組合物可對于體內(nèi)癌細(xì)胞終末分化提供優(yōu)良功效。圖37 結(jié)合三個有區(qū)別的hEGFR表位的有效抗體組合物的大量實(shí)施例說明該構(gòu)想的一般適用性。
[0259] 對于單克隆抗EGFR抗體療法而言，特定比例的患者將不能有效地對抗體治療起 反應(yīng)。對于一些患者而言，此可能歸因于該抗體的迅速清除或由于該抗體在患者中產(chǎn)生針 對該抗體的免疫反應(yīng)。對于一些患者而言，缺乏反應(yīng)可能由于其特定EGFR依賴性癌癥表達(dá) 某一構(gòu)形的EGFR，在該構(gòu)形中單克隆抗體不能結(jié)合其表位。此可能由于糖基化差異，由于域 缺失或由于突變和/或SNP。
[0260] 再者，對于一些癌癥而言，由癌細(xì)胞的配體產(chǎn)生引起的自分泌EGFR刺激具有重要 性，而在其它情況下，癌細(xì)胞表達(dá)EGFR無需配體刺激。對于后者癌癥類型而言，能夠抑制配 體結(jié)合的抗體可能無效。
[0261] 抗體能夠結(jié)合EGFR上的至少三個有區(qū)別的表位的抗體組合物將更廣泛適用，因 為所有三個表位相對于抗體所識別的表位均改變的可能性減少。此外，所有抗體均由患者 清除的可能性更小。最終，實(shí)施例展示在功能鑒定中，包含三種結(jié)合有區(qū)別的表位的抗體的 混合物，其優(yōu)于單克隆抗體且優(yōu)于包含兩種抗體的混合物。在誘導(dǎo)癌細(xì)胞的終末分化方面 已使用結(jié)合不重疊表位的三種域III抗體最明確地證明優(yōu)越性。該有效的抗體誘導(dǎo)癌細(xì)胞 終末分化先前未有報導(dǎo)，且在設(shè)計有效的基于抗體的癌癥療法方面代表顯著進(jìn)步。隨后的 結(jié)果證明類似或更優(yōu)良的結(jié)果可使用兩種抗體的特定組合獲得。
[0262] 為獲得改良的臨床功效及針對更寬范圍的EGFR依賴性癌癥類型的更廣泛的效 用，可增加組合物中的抗體數(shù)目。因此，該組合物可包含能夠結(jié)合四個不重疊表位的抗體。 該組合物可包含能夠結(jié)合五個不重疊表位的抗體。該組合物可包含能夠結(jié)合六個不重疊 表位的抗體。本申請案的實(shí)施例展示至少六種有區(qū)別的抗體可同時與EGFR結(jié)合（實(shí)施例 3)。此并不排除可能或甚至有利地通過謹(jǐn)慎選擇抗體來設(shè)計包含能夠結(jié)合多于六個（諸如 七個或八個）不重疊表位的抗體的組合物。
[0263] 在另一具體實(shí)例中，組合物包含一種以上結(jié)合一個表位的抗體分子，諸如兩種結(jié) 合不同但重疊的表位的抗體。包括結(jié)合重疊表位的抗體可為有利的，因為此提高表位被結(jié) 合的可能性。該可能性的一基本原理為：在一些患者和/或一些癌細(xì)胞中，表位可能由于構(gòu) 形變化或突變或SNP而改變。雖然此可能影響一種抗體的結(jié)合，但其可能不影響結(jié)合重疊 表位的另一抗體的結(jié)合。此外，存在以下風(fēng)險：該等抗體中的一者由于其被視為抗原而由患 者清除。通過包括兩種結(jié)合不同但重疊表位的抗體，減少清除兩種抗體中的一者之后果及 表位突變之后果。
[0264] 因此在一具體實(shí)例中，組合物包含兩種結(jié)合不同但重疊表位的抗體。在另一具體 實(shí)例中，組合物包含兩種結(jié)合相同表位的有區(qū)別的抗體分子。結(jié)合相同或重疊表位的抗體 可具有相同或不同的同種型。
[0265] 包含針對三個不重疊表位的抗體的抗體組合物因此包含四種、五種或六種有區(qū)別 的抗體分子以便兩種抗體結(jié)合兩個重疊表位或同一第一表位，兩種其它抗體結(jié)合兩種其它 重疊表位或同一第二表位，且兩種抗體結(jié)合兩種其它重疊表位或同一第三表位。當(dāng)然，組合 物可包含兩種以上（諸如三種或四種）能夠結(jié)合重疊表位或能夠結(jié)合同一表位的抗體分 子。因此，通過對于各表位具有一種以上抗體或通過具有結(jié)合重疊表位的若干抗體，包括于 組合物中的抗體總數(shù)可超過6種。保持抗體總劑量恒定，各抗體濃度由于包括于組合物中 的各其它抗體而降低。因此，預(yù)期對可包括于組合物中同時保持可接受的功效的抗體數(shù)目 存在限制。根據(jù)表面電漿共振結(jié)合研究及增殖鑒定的觀察結(jié)果且考慮到制造挑戰(zhàn)，預(yù)期該 限制（若存在）額外優(yōu)點(diǎn)可通過將抗體數(shù)目自6種增加至7種、8種、9種、10種或更多而獲 得。當(dāng)然，此并不排除該組合物包含多于10種抗體，諸如11種、12種、13種、14種、15種、 16種、17種、18種、19種或20種抗體或更多，諸如25種抗體或更多，例如30種抗體或更多， 諸如40種抗體或更多，諸如50種抗體或更多。
[0266] 雖然較優(yōu)選在本發(fā)明的抗體組合物中包括能夠結(jié)合至少三個不重疊 EGFR表位的 抗體，但使用能夠結(jié)合兩個不重疊 EGFR表位的抗體的特定組合亦獲得優(yōu)良結(jié)果。該等較 優(yōu)選「兩種抗體」組合物在下文中連同與如何設(shè)計本發(fā)明的抗體組合物有關(guān)的指導(dǎo)原則一 起進(jìn)行更詳細(xì)地描述。已發(fā)現(xiàn)與包含抗體992、1030及1042的三種抗體組合物相比，當(dāng) 使用僅具有兩種抗體（992及1024)的組合物時可獲得類似或甚至改良的功效。由于抗 體1024與1042屬于同一群且因此具有相同結(jié)合特異性，實(shí)際上，對于三種抗體組合物所 觀察到的包括對終末分化的效果的結(jié)果可歸因于該組合物中的僅兩種結(jié)合特異性（992及 1024/1042)。
[0267] 在一具體實(shí)例中，組合物中至少一種抗體結(jié)合域III表位，更優(yōu)選組合物包含至 少兩種結(jié)合域III表位的抗體，且組合物亦可包含三種結(jié)合域III表位的抗體。
[0268] 較優(yōu)選組合物包含至少一種結(jié)合域I表位的抗體且其可包含至少兩種結(jié)合域I表 位的抗體。
[0269] 較優(yōu)選組合物包含至少一種結(jié)合域II表位的抗體且可包含結(jié)合兩個域II表位的 抗體。
[0270] 組合物亦可包含如本文中所定義的結(jié)合域I/II表位的抗體。
[0271] 組合物可包含能夠結(jié)合域IV表位的抗體。
[0272] 較優(yōu)選組合物包含至少一種能夠抑制EGF結(jié)合的抗體分子。
[0273] 在另一較優(yōu)選具體實(shí)例中，組合物可包含能夠防止EGFR磷酸化的抗體。
[0274] 此外組合物可包含能夠增強(qiáng)EGFR的內(nèi)化/降解的抗體。
[0275] 在一較優(yōu)選具體實(shí)例中，組合物包含至少一種域III抗體及至少一種域I/II抗 體。在另一較優(yōu)選具體實(shí)例中，組合物包含至少兩種域III抗體及一種域I抗體。
[0276] 在另一較優(yōu)選具體實(shí)例中，組合物包含至少兩種域III抗體，諸如至少三種域III 抗體。
[0277] 組合物的抗體可為具有非人類可變鏈與人類恒定鏈的嵌合抗體。非人類可變鏈可 來自小鼠、大鼠、綿羊、豬、雞、非人類靈長類動物或其它合適動物。為獲得全人類抗體，抗體 可在具有人類抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生?？贵w亦可為所謂的人源化抗體，其中非人類 ⑶R序列已植入人類框架序列中。
[0278] 較優(yōu)選人類恒定鏈為IgGl或IgG2同種型。更優(yōu)選組合物中的所有抗體具有相同 同種型以便于制造。然而，在組合物中可有利地包括不同同種型的抗體。
[0279] 較優(yōu)選本發(fā)明的抗體組合物包含能夠與選自由以下EGFR組成的組的EGFR結(jié)合的 抗體：人類EGFR、突變?nèi)祟怑GFR及人類EGFR的缺失變異體。較優(yōu)選抗體能夠結(jié)合人類與 非人類靈長類EGFR兩者，以便其可在臨床實(shí)驗之前在相關(guān)毒物學(xué)研究中加以測試。較優(yōu)選 非人類靈長類動物為稱猴（食蟹猴，Macaca fascicularis)。
[0280] 為支持以上所確定的使用結(jié)合多個有區(qū)別的表位中的三個的抗體治療EGFR依 賴性癌癥的構(gòu)想，本發(fā)明的
【發(fā)明者】已鑒別、制造且表征一系列針對EGFR的嵌合小鼠/人 類抗體。該等嵌合抗體已個別地且以混合物形式與最新技術(shù)的單克隆抗體（以艾比特思 TM(ErbituXTM)及維克替比TM(Vectibi XTM)例示）進(jìn)行對比。
[0281] 表1展示個別嵌合抗體的概述及與其有關(guān)的特征?？贵w編號為貫穿本申請案所使 用的參考數(shù)字。特異性為抗體所結(jié)合的EGFR域，如實(shí)施例3中所證實(shí)。Λ EGFR為抗體與 EGFR突變體（EGFRvIII)結(jié)合的能力，如實(shí)施例1中所述。獼猴EGFR為抗體結(jié)合獼猴EGFR 的能力（實(shí)施例10)。EGF inhib為抗體抑制EGF結(jié)合的能力（實(shí)施例4)。增殖為抗體抑 制癌細(xì)胞系（A431及HN-5)增殖的能力（實(shí)施例6)。
[0282] 表1本發(fā)明的抗體
[0283]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗人類EGFR抗體或其抗原結(jié)合表位，其包含SEQ ID N0:50中的重鏈⑶R1XDR2 和⑶R3氨基酸序列及SEQ ID NO: 82中的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述抗體為人源化的。
3. 權(quán)利要求1的抗體或片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: 50的第3-118位氨基 酸的VH和含有SEQ ID NO:82的第3-113位氨基酸的八。
4. 一種抗體，其重鏈具有包含SEQ ID NO: 50的第3-118位氨基酸的VH和包含SEQ ID N0:91的氨基酸序列的恒定區(qū)，且其輕鏈包含SEQ ID N0:82的第3-220位氨基酸.
5. -種分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1至4中任一項的抗體的（1)重鏈或其 抗原結(jié)合部分，或（2)輕鏈或其抗原結(jié)合部分，或（3)所述兩者的核苷酸序列。
6. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自SEQ ID NO:34或66.
7. -種載體，其包含權(quán)利要求5或6的核酸分子。
8. -種宿主細(xì)胞，其包含編碼權(quán)利要求1至4中任一項的抗體的（1)重鏈或其抗原結(jié) 合部分，或（2)輕鏈或其抗原結(jié)合部分，或（3)所述兩者的核苷酸序列，其中所述宿主細(xì)胞 不在人類當(dāng)中。
9. 一種重組抗體組合物，其包含第一抗人類EGFR抗體分子和區(qū)別于第一分子的第二 抗人類EGFR抗體分子，其中所述第一抗EGFR抗體分子是權(quán)利要求1至4中任一項的抗體。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述第一和第二抗人類EGFR抗體分子不抑制彼此與人 類EGFR的結(jié)合。
11. 權(quán)利要求9或10的組合物，其中所述抗體分子的至少一種能夠增加其它抗體對人 類EGFR的最大結(jié)合能力。
12. 權(quán)利要求9至11中任一項的組合物，其中所述組合物中的第一抗體分子和第二抗 體分子的量分別為5 %和95%，或者分別為10 %和90%，或者分別為20 %和60%，或者分 別為30 %和70%，或者分別為40 %和60%，或者分別為45 %和55%，或者大約各50%。
13. 權(quán)利要求9至12中任一項的組合物，其中所述抗體分子結(jié)合有區(qū)別的EGFR表位。
14. 權(quán)利要求9至13中任一項的組合物，其中所述組合物除了所述第一和第二抗體分 子外不含有其它抗人類EGFR抗體分子。
15. 權(quán)利要求9至13中任一項的組合物，其還包含第三有區(qū)別的抗人類EGFR抗體分子
16. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述第三抗體分子導(dǎo)致所述第一和/或第二抗體分子 與人類EGFR增強(qiáng)的結(jié)合。
17. 權(quán)利要求15或16的組合物，其中所述抗體分子結(jié)合三種有區(qū)別的EGFR表位。
18. 權(quán)利要求13或17的組合物，其中所述表位不重疊。
19. 權(quán)利要求9至18中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子能夠抑制EGF結(jié)合。
20. 權(quán)利要求9至19中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子能夠防止EGFR的磷酸 化
21. 權(quán)利要求9至20中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子能夠增強(qiáng)EGFR的內(nèi)化 或降解。
22. 權(quán)利要求15至17中任一項的組合物，其包含至少一種其它抗人類EGFR抗體分子， 其中所述其它抗體結(jié)合第四有區(qū)別的表位。
23. 權(quán)利要求22的組合物，其包含至少一種其它抗人類EGFR抗體分子，其中所述其它 抗體分子結(jié)合第五有區(qū)別的表位。
24. 權(quán)利要求23的組合物，其包含至少一種其它抗人類EGFR抗體分子，其中所述其它 抗體分子結(jié)合第六有區(qū)別的表位。
25. 權(quán)利要求9至24中任一項的組合物，其包含至少一種域III抗體分子和至少一種 域I/II抗體分子。
26. 權(quán)利要求15至17和22至24中任一項的組合物，其包含至少兩種域III抗體分子 和一種域I抗體分子。
27. 權(quán)利要求9至24中任一項的組合物，其包含至少兩種域III抗體分子。
28. 權(quán)利要求9至27中任一項的組合物，其包含至少一種能夠增強(qiáng)至少一種其它抗體 分子與有區(qū)別的表位結(jié)合的抗體分子。
29. 權(quán)利要求9至28中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子為具有鼠類可變區(qū)與 人類恒定區(qū)的嵌合抗體。
30. 權(quán)利要求29的組合物，其中所述人類恒定區(qū)來自IgGl或IgG2。
31. 權(quán)利要求9至28中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子為人源化抗體。
32. 權(quán)利要求15至17中任一項的組合物，其中所述組合物除了所述第一、第二和第三 抗體分子外不含有其它抗人類EGFR抗體分子。
33. -種試劑盒，其包含權(quán)利要求9至32中任一項的組合物，其中所述抗體分子在一個 容器或在獨(dú)立容器中調(diào)配用于同時、依次或單獨(dú)給藥。
34. 權(quán)利要求9至32中任一項的組合物，其中所述組合物使得受體內(nèi)化。
35. 權(quán)利要求9至34中任一項的組合物，其中所述組合物能夠誘導(dǎo)體內(nèi)A431NS細(xì)胞的 終末分化。
36. 權(quán)利要求9至35中任一項的組合物，其中所述組合物能夠上調(diào)體內(nèi)腫瘤內(nèi)披蛋白 (involucrin)表達(dá)。
37. -種雙特異性結(jié)合分子，其包含SEQ ID NO:50中的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基 酸序列及SEQ ID N0:82中的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基酸序列。
38. 權(quán)利要求37的雙特異性結(jié)合分子，其中所述雙特異性結(jié)合分子為雙重可變域抗 體。
39. 權(quán)利要求37的雙特異性結(jié)合分子，其中所述雙特異性結(jié)合分子為雙特異性Fab片 段或雙特異性scFv。
40. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合 物、權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于在表達(dá)EGFR的細(xì)胞中降低 EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物組合物中的用途。
41. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于殺死表達(dá)EGFR的細(xì)胞的藥物 組合物中的用途。
42. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于在表達(dá)EGFR的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋 亡的藥物組合物中的用途。
43. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于抑制表達(dá)EGFR的細(xì)胞增殖的 藥物組合物中的用途。
44. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分化的藥物 組合物中的用途。
45. 權(quán)利要求44的用途，其中所述分化為終末分化。
46. 權(quán)利要求44的用途，其中所述分化伴隨有內(nèi)披蛋白表達(dá)增加。
47. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于誘導(dǎo)EGFR內(nèi)化的藥物組合物 中的用途。
48. 權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子在制備用于在受試者中治療癌癥的藥物組 合物中的用途。
49. 一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至4中任一項的抗體、權(quán)利要求9至32或34 至36中任一項的組合物、權(quán)利要求37至39中任一項的雙特異性結(jié)合分子和醫(yī)藥學(xué)上可接 受的稀釋劑、載劑或賦形劑。
50. 權(quán)利要求49的藥物組合物，其調(diào)配用于癌癥治療中的給藥。
51. 權(quán)利要求49或50的藥物組合物，其進(jìn)一步包括至少一種能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的化 合物。
52. 權(quán)利要求51的藥物組合物，其中所述化合物是選自由以下各物組成的組：視黃酸、 苯基丁酸鹽/酯、全反式視黃酸、活性形式維生素 D。
53. 權(quán)利要求49至52中任一項的藥物組合物，其進(jìn)一步包含至少一種化療化合物或至 少一種抗腫瘤化合物。
54. 權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述化療化合物是選自由以下各物組成的組：阿 德力霉素、順鉬、紫杉醇、阿霉素、拓樸替康、氟嘧啶、奧賽力鉬和伊立替康。
55. -種抗體組合物，其包含至少第一抗人類EGFR抗體分子和區(qū)別于所述第一分子的 第二抗人類EGFR抗體分子，其中： a) 第一抗人類EGFR抗體分子具有包含含有SEQ ID N0:40的第3-124位氨基酸的VH 的重鏈和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的恒定區(qū)，且具有包含SEQ ID NO:72的第3-216 位氨基酸的輕鏈；和 b) 第二抗人類EGFR抗體分子具有包含含有SEQ ID N0:41的第3-120位氨基酸的VH 的重鏈和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的恒定區(qū)，且具有包含SEQ ID NO:73的第3-221 位氨基酸的輕鏈。
56. -種分離的核酸分子，其包含編碼如下重鏈或其抗原結(jié)合部分、輕鏈或其抗原結(jié)合 部分或者所述兩者的核苷酸序列： (a) -種抗體，其包含SEQ ID N0:40中的重鏈CDR1、CDR2和CDR3及SEQ ID NO:72中 的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3 ;或者 (b) -種抗體，其包含SEQ ID N0:41中的重鏈CDR1、CDR2和CDR3及SEQ ID NO:73中 的輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3。
【文檔編號】A61K39/395GK104151430SQ201410211600
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2007年3月1日
【發(fā)明者】米克爾.W.佩德森, 盧西拉.斯泰納, 艾倫.詹森, 克勞斯.凱福德, 珀-約翰.邁杰, 羅伯特.卡爾森, 查爾斯.派克, 拉斯.S.尼爾森 申請人:西福根有限公司