一種基于天然p-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑的制備及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于天然P-糖蛋白(P-gp)抑制劑構建的口服吸收促進劑的制備方法及其應用。其制備方法為：通過化學偶聯，將具有P-gp外排抑制作用的天然小分子接枝到殼聚糖衍生物上，合成了一種具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促進劑。其具有以下特征：(1)具有P-gp外排抑制作用的小分子與殼聚糖衍生物偶聯后，合成的偶聯物具有P-gp外排抑制功能，能夠通過抑制P-gp的外排促進藥物在胃腸道的吸收。(2)合成的偶聯物可以單獨作為高分子新藥。(3)合成的偶聯物具有兩親性，可以在水中自組裝形成膠束，包載疏水性抗腫瘤藥物，增加藥物水溶性，增加胃腸道對藥物的攝取，提高藥物生物利用度。本發(fā)明制備方法簡單，成本較低，適用于大規(guī)模連續(xù)生產。
【專利說明】-種基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑的 制備及其應用
[0001]
【技術領域】：本發(fā)明屬于生物醫(yī)學材料領域，具體涉及一種基于天然P-糖蛋白抑制 劑構建的口服吸收促進劑的制備方法及其在促進抗腫瘤藥口服吸收中的應用。
【背景技術】：
[0002] 隨著社會的城市化、工業(yè)化發(fā)展，環(huán)境污染及各類食品添加劑的增多，以及人們不 良生活方式和行為習慣的影響，惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類生命健康及帶給家庭、社會 沉重負擔的重大疾病之一。惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率呈逐年上升的趨勢。目前，化療的 給藥方式以靜脈注射為主，而由于受到藥物生物利用度低的限制，口服給藥發(fā)展較緩慢。
[0003] 口服給藥使用方便，順應性好，易于被患者接受，尤其需長期治療的疾病，口服給 藥是首選的給藥方式。但口服給藥易受到藥物的溶解性、滲透性、胃腸道環(huán)境、腸道P-糖蛋 白（P-gp)外排及肝臟代謝系統等影響。提高藥物的溶解度，確保藥物在胃腸道PH及各種生 物酶環(huán)境中穩(wěn)定，以及抑制P-gp外排是提高口服療效的有效方法。P-gp是由多藥耐藥基因 mdr-Ι的表達、位于細胞膜上的藥物外排泵，其大量存在于腸道上皮細胞及腫瘤細胞表面， 是抗腫瘤藥物口服生物利用度低、腫瘤治療中產生多藥耐藥性的主要原因。利用P-gp抑制 劑可以明顯減少腸道細胞對藥物的外排，可以提高體內血藥濃度。綜合以上，具有P-gp抑 制作用的口服吸收促進劑成為提高口服藥物生物利用度、增強抗腫瘤效果的有效方法。
[0004] 自然界中存在多種天然的P-gp抑制劑。槲皮素是廣泛存在于茶、洋蔥、紅酒及各 類果蔬中的天然黃酮類化合物。近年來體外實驗及動物實驗研究表明，槲皮素能顯著抑制 多種癌細胞的生長的同時，還競爭性抑制MDR家族，P-gp，MRPl和BCRP的數量，及細胞色素 P-450的CYP3A亞家族。槲皮素不僅可降低MDR細胞P-gp的表達量，并且可抑制P-gp的功 能，從而達到對P-gp的表達和功能的雙重抑制。研究顯示，槲皮素可以通過直接抑制P-gp 活性和表達，并對人宮頸癌KB-V1耐藥細胞株的P-gp進行抑制，從而提高了細胞對長春堿 和紫杉醇的敏感。槲皮素也被證明可通過有效地干擾信號通路而下調P-gp的表達。大黃 素屬蒽醌類衍生物，是寥科植物大黃、虎杖等中藥的有效成分，具有眾多生物活性，如抗菌、 抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫抑制等。大黃素可抑制多種腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡 并逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性。大黃素是活性氧生成器，通過產生活性氧和下調多藥抗性相 關蛋白I(MRPl)能提高順鉬對膽囊癌SGC-996細胞的靈敏度。大黃素逆轉腫瘤細胞多藥抗 藥性的作用與抑制核苷轉運及降低P-gp的功能和表達相關。大黃素通過下凋P-gp、凋亡抑 制蛋白和存活素增強了 A2780/taxol細胞對紫杉醇的敏感性。大黃素對QBC939ADM細胞的 多藥耐藥性有逆轉作用，其作用機理可能與人膽管癌細胞P-gp的表達有關，通過與化療藥 物競爭性結合P-gp的結合位點發(fā)揮療效。黃芩素是黃芩的干燥根中提取的有效成分之一， 有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤等藥理作用。黃芩素在非細胞毒劑量時能逆 轉A2780/ADM對ADM的耐藥性，其逆轉作用可能與降低P-gp藥物外排功能、增加細胞內藥 物濃度有關。研究表明黃芩素衍生物4' -甲醚-黃芩素對絨毛膜癌耐藥細胞具有顯著的 耐藥逆轉作用，這種逆轉作用可能是通過降低耐藥基因表達、促進細胞凋亡實現的。白藜 蘆醇是存在于葡萄、花生和多種傳統中藥中的多酚類化合物，降血脂，抗炎，抗氧化，抑制腫 瘤細胞增殖、轉移和凋亡等生物學功能。白藜蘆醇的抗MDR活性則是通過干預一系列的細 胞內信號通路來實現的。白藜蘆醇能下調核轉錄因子HIF-I α和多藥耐藥基因 mdrl、MRPl 的表達，并有濃度依賴性，提示缺氧環(huán)境中白藜蘆醇可以下調多藥耐藥基因從而提高腫瘤 細胞對化療藥物的敏感性。白藜蘆醇通過下調mdrl/P-gp表達逆轉K562/ADM多藥耐藥細 胞的凋亡抑制。白藜蘆醇體外能誘導K562/A0 2細胞的凋亡，且呈一定的濃度依賴性，其作 用機制可能與逆轉mdrl mRNA基因表達有關。
[0005] 殼聚糖是一種含氨基的多糖，化學名為β-(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，是 天然多糖中唯一的堿性多糖，具有無毒、來源豐富、良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu) 點，作為生物材料在各領域中具有很大的吸引力，尤其在生物醫(yī)學領域有著極廣闊的前景。 殼聚糖及其衍生物也是一種較好的口服吸收促進劑。大量實驗證明殼聚糖具有黏膜黏附 性，并通過對細胞內的F-actin和緊密聯接蛋白ZO-I的重新分配調節(jié)對上皮細胞的緊密連 接，對藥物跨上皮黏膜細胞的透過有很強的促進作用。在作為藥物載體時，其可以控制藥物 釋放、延長藥物療效、降低藥物毒副作用。由殼聚糖和0-羧甲基殼聚糖組成的聚電解質復 合物能夠增強阿霉素在全部小腸段內的吸收，特別是空腸和回腸。羧甲基殼聚糖可以通過 剝奪粘著連接中的C a2+產生瞬間可逆的細胞旁通透性的增強，因此能夠作為一個吸收促進 劑使用，其在胃腸道中的促吸收作用比殼聚糖還高1. 7?3. 3倍。
[0006] 通過化學偶聯的方法，將天然的具有P-gp外排抑制作用的天然小分子接枝到殼 聚糖及其衍生物，合成了一種兩親性高分子偶聯物，該偶聯物由于構成材料的自身特點而 同時具有P-gp抑制作用、生物黏附作用以及對藥物跨上皮細胞調節(jié)作用，從而可促進藥物 在胃腸道的吸收，成為一種口服吸收促進劑。另外，由于該偶聯物具有兩親性，能在水中自 組裝成納米級聚合物膠束，可物理包載疏水性藥物，增強藥物的水溶性、在腸道中的滲透 性，并且其在胃腸道中可被腸道上皮細胞和M細胞內吞而被吸收，進而提高藥物生物利用 度，增強藥物療效。該系統具有高效、低毒及緩釋等特征，為抗腫瘤藥的口服給藥系統的發(fā) 展起到推動作用。
[0007] 根據以上設計思路，本專利通過化學偶聯的方法，將具有P-gp外排抑制作用的天 然小分子接枝到殼聚糖衍生物上，合成了一種具有P-gp外排抑制作用的兩親性偶聯物。該 偶聯物具有以下特征：（1)具有P-gp外排抑制作用的小分子與殼聚糖衍生物偶聯后，合成 的高分子偶聯物具有P-gp外排抑制功能，能夠通過抑制P-gp的外排促進藥物在胃腸道的 吸收。（2)合成的具有p-gp外排抑制功能的高分子偶聯物可以促進抗腫瘤藥物的口服吸 收。（3)將疏水性天然具有P-gp外排抑制功能的小分子物質接枝在殼聚糖衍生物的主鏈上 可以增加其溶解度，生成的高分子偶聯物可以單獨作為高分子新藥。（4)殼聚糖衍生物與疏 水性具有P-gp外排抑制作用天然活性小分子物質偶聯后，形成兩親性偶聯物，可以在水中 自組裝形成膠束，可以物理包載疏水性抗腫瘤藥物，增加藥物水溶解，促進抗腫瘤藥物等在 胃腸道的吸收，提高生物利用度。
【發(fā)明內容】
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[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服吸收促進劑。 通過化學偶聯的方法將具有P-gp外排抑制作用的天然活性小分子物質接枝到殼聚糖衍生 物的主鏈上。由于殼聚糖衍生物本身具有促進藥物口服吸收的作用，因此將天然的疏水性 的具有P-gp外排抑制作用的小分子接枝到殼聚糖衍生物的主鏈上形成的兩親性高分子偶 聯物，兼具P-gp抑制作用、生物黏附作用及腸道上皮細胞的調節(jié)作用，成為一種口服吸收 促進劑，既能增強了抗腫瘤藥物在胃腸道內的吸收，同時也能夠改善該類活性小分子物質 的溶解性，并且可以提高該類活性小分子物質的抗腫瘤活性和P-gp抑制作用。本發(fā)明使具 有口服吸收促進作用的殼聚糖衍生物和天然的具有P-gp外排抑制作用的小分子物質的應 用具有更廣闊的產業(yè)化前景。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服吸收促進 劑的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服吸收促進 劑在促進抗腫瘤藥物口服吸收的應用。
[0011] 為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服 吸收促進劑，該口服吸收促進劑是在殼聚糖衍生物的羧基或經過衍生化形成的羧基上，通 過化學偶聯的方法，引入天然具有P-gp外排抑制作用的小分子物質，所形成的高分子偶聯 物可促進抗腫瘤藥物口服吸收，成為口服吸收促進劑，同時改善了天然活性小分子物質的 溶解性。由于在帶羧基的親水性殼聚糖衍生物的主鏈上引入了疏水基團，增強了其兩親性， 故該高分子偶聯物能在水性介質中自組裝成穩(wěn)定的納米膠束，可用作難溶性抗腫瘤藥物的 增溶載體或吸收促進劑，提高抗腫瘤藥物的生物利用度。
[0012] 所述的具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促進劑，其中天然具有P-gp外排抑制 作用的小分子物質，選自黃酮類槲皮素和黃芩素，蒽醌類物質大黃素，以及酚類物質白藜蘆 醇。
[0013] 所述的殼聚糖衍生物包括：帶羧基的殼聚糖衍生物（ο-羧甲基殼聚糖，N，0-羧甲 基殼聚糖，羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-0, N-羧甲基殼聚糖）。
[0014] 所述的具有P-gp外排抑制作用的口服吸收促進劑的制備使用下列方法：
[0015] 含有羧基的殼聚糖衍生物溶于水，將具有P-gp外排抑制作用的小分子物質溶于 適當的溶劑，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDOHCl)和N-羥基琥 珀酰亞胺（NHS)為活化劑，4-二甲氨基吡啶（DMAP)為催化劑，通過酯化反應將具有P-gp外 排抑制作用的小分子物質接枝到天然高分子物質上。
[0016] 所述的制備方法中，其中適當溶劑選自N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，四氫呋喃，二甲 基亞砜或者上述溶劑的混合溶劑。
[0017] 所述的基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服吸收促進劑，其中天然活性小分子 物質具有P-gp外排抑制作用，在增加藥物口服吸收利用度方面，尤其在促進P-gp底物藥物 的口服吸收方面，具有重要作用；高分子物質通過生物黏附及腸道上皮細胞的調節(jié)作用而 具有口服吸收促進作用；二者結合后從不同角度促進口服抗腫瘤藥物的胃腸道吸收。并且 可以解決小分子物質溶解度小、生物利用度低等問題。
[0018] 所述的基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服吸收促進劑的合成以及膠束的具體 制備方法如下：
[0019] -、基于天然P-gp外排抑制劑構建的口服吸收促進劑的合成
[0020] 將含有羧基的殼聚糖衍生物溶于水，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺 鹽酸鹽（EDC · HC1)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)為活化劑，以4-二甲氨基吡啶（DMAP)為 催化劑，活化天然高分子物質結構上的羧基；將具有P-gp外排抑制作用的小分子物質溶于 適當的溶劑后加入上述高分子物質水溶液中；控制反應條件至反應完全，適當溶劑沉淀，抽 濾得沉淀物，將沉淀物溶于水，探頭超聲分散、離心、過〇. 8 μ m的濾膜后置透析袋中，于水 中透析72h，透析后的產物再次近探頭超聲、離心、過0. 8 μ m的濾膜后，冷凍干燥，得基于天 然P-gp抑制劑構建的口服吸收促進劑。
[0021] 合成路線通式如下：
[0022]
【權利要求】
1. 一種基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑，其特征在于該口服吸收促 進劑是在殼聚糖衍生物的羧基上，通過酯化反應引入天然的疏水性具有P-糖蛋白抑制作 用的小分子，由于構成材料的自身特點而同時具有P-糖蛋白抑制作用、生物黏附作用以及 對藥物跨上皮細胞調節(jié)作用，從而可促進藥物在胃腸道的吸收，成為一種口服吸收促進劑。 并且該口服吸收促進劑具有兩親性質，在水性介質中可自組裝為納米膠束。所述天然具有 P-糖蛋白外排抑制作用的小分子物質，選自黃酮類槲皮素和黃芩素，蒽醌類物質大黃素，以 及酚類物質白藜蘆醇。
2. 根據權利要求1所述基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑，其特征在于 所述的帶羧基的殼聚糖衍生物為〇-羧甲基殼聚糖，N，0-羧甲基殼聚糖，羧乙基殼聚糖、季 銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-0, N-羧甲基殼聚糖。
3. 根據權利要求1所述的基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑的制備方 法，其特征包括下列步驟： 將殼聚糖衍生物溶于水，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC ·Η(：1) 和Ν-羥基琥珀酰亞胺（NHS)為活化劑，以4-二甲氨基吡啶（DMAP)為催化劑，活化殼聚糖 衍生物結構上的羧基；將具有P-gp外排抑制作用的天然活性小分子物質溶于適當的溶劑 后加入上述殼聚糖衍生物水溶液中；控制反應條件至反應完全，適當溶劑沉淀，抽濾得沉 淀物，將沉淀物溶于水，探頭超聲分散、離心、過0. 8 μ m的濾膜后置透析袋中，于水中透析 72h，透析后的產物再次經探頭超聲、離心、過0. 8 μ m的濾膜后，冷凍干燥，得基于天然P-糖 蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑。
4. 根據權利要求3所述的基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑的制備方 法，其特征在于所述的適當的有機溶劑，優(yōu)選自N，N-二甲基甲酰胺，甲酰胺，四氫呋喃，二 甲基亞砜；所述的控制反應條件，優(yōu)選為冰浴反應10?60min，然后升至室溫，反應12? 72h，根據具有P-gp外排抑制作用的天然活性小分子物質對光的耐受性，選擇是否避光反 應；所述的濾液的適當的沉淀溶劑，優(yōu)選自丙酮，乙醇，甲醇；所述的天然活性小分子物質 與殼聚糖衍生物的適當比例優(yōu)選為1 : 〇. 5?2 ;所述的EDC · HC1和NHS的比例優(yōu)選為 1 : 0.5?3;所述的探頭超聲時間優(yōu)選為20?60min;所述的離心時間優(yōu)選為5?20min; 離心轉數優(yōu)選為2000?4000rpm ;所述的透析時間，優(yōu)選為1?4d。
5. 權利要求1所述的基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑，其特征在于可 作為藥學活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑、制備為高分子新藥、作為藥學活性或藥 理活性分子的載體。
6. 根據權利要求5所述的基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑的應用， 其特征在于：所述的藥學活性或藥理活性分子選自紫杉烷類、喜樹堿類、黃酮類、長春新堿 類、蒽醌類、鬼白毒素類、阿霉素類、維A酸類、環(huán)孢素類、二氫吡啶類、小檗堿類抗腫瘤藥物 中的任一物質或其衍生物。
7. 根據權利要求5所述的的應用，其特征在于：基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服 吸收促進劑在制備藥學活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑的質量濃度為〇. 1?90%， 優(yōu)選為〇· 1?35%。
8. 根據權利要求5所述的基于天然P-糖蛋白抑制劑構建的口服吸收促進劑的應用， 其特征在于：制備的藥學活性或藥理活性分子的口服吸收促進劑為口服給藥，劑型選自片 齊?、膠囊劑、丸劑、糖漿劑、顆粒劑、口服溶液劑；制備的高分子新藥為口服或注射給藥，劑型 選自片劑、膠囊劑、丸劑、糖漿劑、顆粒劑、口服溶液劑、注射劑、注射用凍干粉針；制備藥的 學活性或藥理活性分子的載體為口服或注射給藥，劑型選自片劑、膠囊劑、丸劑、糖漿劑、顆 粒劑、口服溶液劑、注射劑、注射用凍干粉針。
【文檔編號】A61K47/36GK104225612SQ201410214718
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權日:2014年5月21日
【發(fā)明者】姚靜, 周建平, 王曉穎 申請人:中國藥科大學