高分子量的夏枯草多糖及其制備方法與在免疫藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)高分子量的夏枯草多糖及其制備方法與在免疫藥物中的應(yīng)用。該方法將夏枯草粉與蒸餾水配成固液比為1:15～1:35，置于超聲場(chǎng)下，功率100～300W，頻率15～50KHz，時(shí)間10～30min，溫度25～40℃，然后物料泵入高壓場(chǎng)下，壓力100～500MPa，溫度100～130℃，時(shí)間10～30min；過(guò)濾，濃縮，脫蛋白，脫色，醇沉，冷凍干燥得粗多糖，經(jīng)柱層析純化得夏枯草多糖。本發(fā)明方法具有多糖產(chǎn)率高，分子量為1000～4000K道爾頓，是高分子量雜多糖，能夠顯著刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7分泌免疫因子，且對(duì)人體正常細(xì)胞基本無(wú)細(xì)胞毒性，同時(shí)具有抗癌活性，可開(kāi)發(fā)無(wú)副作用的免疫藥物或保健品。
【專利說(shuō)明】高分子量的夏枯草多糖及其制備方法與在免疫藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥工程和保健食品領(lǐng)域，具體涉及一種高分子量的具有免疫刺激活性的夏枯草多糖的制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]夏枯草(Prunella vulgaris L.),歐洲地區(qū)稱“self -heal”,俗名羊腸菜、燈籠頭、鐵色草、棒柱頭花、大頭花等，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗。夏枯草屬植物是一種多年生植物，廣泛分布于歐洲和中國(guó)，中國(guó)主要分布于江蘇、浙江、安徽及湖北等地，產(chǎn)4種及3變種，其中I種為引種栽培。其性寒，辛、苦、入肝、膽經(jīng)，具有清肝火、消腫止痛、清熱解毒等功效。夏枯草是一種藥食同源的草本，在中國(guó)民間，夏枯草作為食療滋補(bǔ)品被廣泛用于治療咽喉痛、減少發(fā)熱和促進(jìn)傷口的愈合等；作為中藥用于治療黃疸、肝炎、糖尿病及肺結(jié)核等疾病；在華南地區(qū)作為涼茶配方和營(yíng)養(yǎng)靚湯的成分之一。研究表明夏枯草富含許多重要的生物活性物質(zhì)，主要包括多糖、三萜及其苷類、留醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機(jī)酸及揮發(fā)油等，其主要藥理作用表現(xiàn)在降血壓、降血脂、抗病毒、抗菌、抗氧化、免疫刺激作用和抗腫瘤等方面。
[0003]天然植物多糖作為一類具有生物活性的大分子物質(zhì)，近年來(lái)得到廣泛的研究，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種生物活性。目前，發(fā)明專利CN1965894A公開(kāi)了一種具有免疫活性的夏枯草多糖組合物及其制備方法和應(yīng)用。然而國(guó)內(nèi)外未有可用作藥物的制備和使用的報(bào)道。而且，關(guān)于夏枯草多糖提取方法的報(bào)道主要采用傳統(tǒng)熱水浸提法，此種方法，由于植物細(xì)胞壁不易破壞，提取時(shí)間較長(zhǎng)，提取率低，造成能源和資源浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述情況，本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法及應(yīng)用，提供一種無(wú)毒副作用且具有較強(qiáng)免疫刺激活性的臨床藥物或保健品。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過(guò)篩，加入乙醇加熱回流，脫色和除去小分子醇溶性物質(zhì)，過(guò)濾處理得殘留物，殘留物重復(fù)加入乙醇加熱回流2~3次，在45~60°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥24~48h ；
[0008](2)將步驟⑴處理所得的夏枯草樣品與蒸餾水配成固液比為1:15~1:35，置于超聲場(chǎng)條件下，超聲輸出功率為100~300W，頻率為15~50KHZ，處理時(shí)間10~30min，溫度25~40°C ;然后將物料泵入高壓場(chǎng)中，壓力為100~500MPa，溫度為100~130°C，時(shí)間10~30min，然后5~1s內(nèi)減壓到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，將物料泵回超聲場(chǎng)中進(jìn)行超聲處理后，再進(jìn)行高壓處理，循環(huán)周期為3~5次；所述循環(huán)周期是指物料先超聲處理再進(jìn)行高壓處理的一次循環(huán)過(guò)程；離心分離得提取液，離心力4500~1000g,時(shí)間5~1min,在45~65°C下減壓濃縮到原體積的1/5~1/10，得多糖濃縮液；
[0009](3)在多糖濃縮液中加入Sevag試劑,多糖濃縮液與Sevag試劑的體積比為3:1~6:1,振蕩20~30min，離心分離糖液，離心力4500~1000g,離心時(shí)間5~1min,重復(fù)進(jìn)行10~20次；
[0010](4)將(3)中脫蛋白后的濃縮液加入到大孔樹(shù)脂，進(jìn)行靜態(tài)吸附，濃縮液與大孔樹(shù)脂的體積比為5:1~2:1，溫度35~50°C，時(shí)間4~6h，過(guò)濾得濾液；
[0011](5)在(4)中濾液中加入無(wú)水乙醇，邊攪拌邊加入，使乙醇體積濃度達(dá)到65~85%,O~5°C冷藏室中靜置12~24h，離心得沉淀的多糖，離心力4500~lOOOOg，時(shí)間10~15min,冷凍干燥得夏枯草粗多糖；
[0012](6)將粗多糖溶于蒸餾水，配制濃度為20~30mg/mL的多糖溶液，上樣于DEAE - S印harose柱，上樣量體積與柱體積的比為1:3~1:5，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速
0.5~2mL/min,分管收集,每管5~1mL,苯酹硫酸法檢測(cè)多糖,將糖反應(yīng)陽(yáng)性收集液合并，45~65°C下減壓濃縮，冷凍干燥得純化的夏枯草多糖；所述陽(yáng)性收集液為1/2最大吸光值范圍的收集液。
[0013]為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述乙醇體積濃度為95% ;所述過(guò)篩為過(guò)30~50目篩。所述步驟(3)中Sevag試劑為氯仿與正丁醇的混合液，其體積比為3:1~6:1。所述步驟(4)中大孔樹(shù)脂為大 孔樹(shù)脂D101，聚酰胺樹(shù)脂或大孔樹(shù)脂D354FD。所述步驟(6)制備的多糖分子量范圍為1000~4000K道爾頓。步驟(5)和(6)中所述冷凍干燥是在-50±5°C，0.08~0.1MPa真空度下干燥干燥24~48h，干燥后的樣品中水分的質(zhì)量百分含量低于4%。所述加入乙醇加熱回流為控制夏枯草粉與乙醇質(zhì)量比為1:3~1:6，溫度65~85°C，回流時(shí)間3~5h。
[0014]一種高分子量的夏枯草多糖，由上述制備方法制得。
[0015]所述夏枯草多糖在制備提高免疫力的臨床藥物和保健品中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明夏枯草多糖具有較強(qiáng)的免疫刺激活性，且對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，可作為提高免疫力的臨床藥物或保健品。本發(fā)明的夏枯草多糖以口服和注射給藥的形式使用，主要制成口服液、膠囊和注射針劑。
[0017]以上操作步驟如無(wú)特別說(shuō)明，均按本領(lǐng)域常規(guī)操作。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果:
[0019](I)相比傳統(tǒng)熱水浸提技術(shù)，本發(fā)明采用超聲和高壓循環(huán)處理技術(shù)來(lái)進(jìn)行多糖提取，提取時(shí)間短，提取率高，經(jīng)測(cè)定夏枯草多糖提取率提高20~45%，多糖產(chǎn)率為7~10%。
[0020](2)本發(fā)明的夏枯草多糖，分子量范圍為1000~4000K道爾頓，主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比百分含量范圍分別為20~25%，50~60%，5~9%和6~12%，主要以10~25%的I —和I — 6糖苷鍵，60~70%的I — 3糖苷鍵連接組成，而且存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支的高分子量的新型雜多糖。
[0021](3)本發(fā)明的夏枯草多糖由于含有較多的I — 3和I — 6糖苷鍵連接的高分子量葡聚糖，同時(shí)具有較多的分支結(jié)構(gòu)，所以能夠顯著刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.5分泌抗炎因子，包括一氧化氮NO,腫瘤壞死因子TNF - α和白細(xì)胞介素IL - 6,且對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.5無(wú)細(xì)胞毒性，同時(shí)具有抗癌作用，可用作非特異性免疫臨床藥物或保健品。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為實(shí)施例1產(chǎn)品的紫外光譜掃描曲線圖
[0023]圖2為實(shí)施例1產(chǎn)品的GPC譜圖
[0024]圖3為實(shí)施例1產(chǎn)品的紅外光譜圖
[0025]圖4為實(shí)施例1產(chǎn)品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.5分泌一氧化氮(NO)的影響。
[0026]圖5為實(shí)施例1產(chǎn)品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.5分泌腫瘤壞死因子(TNF - α )的影響。
[0027]圖6為實(shí)施例1產(chǎn)品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.5分泌白細(xì)胞介素(IL-6)的影響。【具體實(shí)施方式】 [0028]結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施方式及形式不限于此。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)將夏枯草果穗干燥后，用粉碎機(jī)粉碎得到夏枯草粉，過(guò)30目篩，稱取300g，加入900g的95% (v/v)乙醇，65°C回流3h，過(guò)濾得殘留物，重復(fù)上述操作2次，殘留物在45°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥24h ；
[0031](2)稱取(I)中處理后的夏枯草粉200g，加入蒸餾水進(jìn)行水煮浸提，料液質(zhì)量比為1:15，置于超聲場(chǎng)條件下，超聲輸出功率為100W，頻率為15KHz，處理lOmin，溫度25°C;然后將物料泵入高壓場(chǎng)中，壓力為100MPa，100°C下lOmin，然后5s內(nèi)減壓到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，將物料泵回超聲場(chǎng)中進(jìn)行超聲處理后，再進(jìn)行高壓處理，循環(huán)周期為3次，離心處理分離提取液，離心力4500g,時(shí)間5min,在45°C下減壓濃縮到原體積的1/5,得多糖濃縮液；
[0032](3)在⑵濃縮液中加入Sevag試劑，使?jié)饪s液與Sevag試劑的體積比為3:1，振蕩20min,離心分離糖液,離心力5500g,時(shí)間5min,重復(fù)操作10次；
[0033](4)在(3)中處理液中加入大孔樹(shù)脂DlOl，進(jìn)行靜態(tài)吸收，使?jié)饪s液與大孔樹(shù)脂的體積比為5:1，溫度35°C，時(shí)間4h，過(guò)濾得濾液；
[0034](5)在⑷濾液中加入無(wú)水乙醇，邊攪拌邊加入，使乙醇體積濃度達(dá)到65%，4°C下靜置12h，離心1min得沉淀的多糖，離心力4500g，冷凍干燥36h，得夏枯草水溶性粗多糖，經(jīng)檢測(cè)得夏枯草粗多糖的提取率為7.53%。
[0035](6)純化:將粗多糖溶于蒸餾水，配制濃度為20mg/mL的多糖溶液，上樣于DEAE - Sepharose柱，上樣量體積與柱體積的比為1: 3，用蒸餾水溶液進(jìn)行洗脫，流速ImL/min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法檢測(cè)多糖，將糖反應(yīng)陽(yáng)性收集液合并，45°C下減壓濃縮，冷凍干燥36h得純化的夏枯草多糖，其產(chǎn)率3.12%，呈白色棉絮狀。
[0036]夏枯草多糖的鑒定:
[0037](I)樣品中多糖含量的測(cè)定:多糖含量％ =總糖含量/樣品質(zhì)量X 100?？偺呛坎捎帽椒?硫酸法進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)測(cè)定該夏枯草多糖中糖含量為98.5%。
[0038](2)溶解性測(cè)定:稱取1mg夏枯草多糖,置于1mL離心管中，加入5mL蒸懼水,鏇渦振蕩lOmin，在離心力1000g下，離心10分鐘，觀察離心管底部有無(wú)沉淀。觀察發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖溶液經(jīng)離心無(wú)沉淀，表明該夏枯草多糖的水溶解性較好。[0039](3)碘-碘化鉀反應(yīng)實(shí)驗(yàn):配制濃度為lmg/mL的夏枯草多糖溶液，加入1.2mL的碘試劑(含0.02%的I2和0.2%的KI溶液)，混勻后在300 - 700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明多糖樣品與碘試劑的反應(yīng)液在360nm處有最大吸收峰,而在565nm處無(wú)最大吸收，證明該夏枯草多糖存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分枝。
[0040](4)紫外光譜掃描:配制多糖濃度為lmg/mL的溶液，以蒸餾水為對(duì)照，然后在190 - 400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。如附圖1所示，該多糖樣品在260nm、280nm波長(zhǎng)處沒(méi)有紫外吸收，證明該夏枯草多糖不含蛋白質(zhì)和核酸。
[0041](5)分子量的測(cè)定:多糖樣品的分子量用HPPC進(jìn)行測(cè)量，采用美國(guó)沃特斯有限公司的凝膠滲透色譜儀(Water Breeze GPC)，色譜柱為TSK -G5000PffXL和TSK -G3000PffXL串聯(lián)柱，流動(dòng)相為0.02moL/L磷酸緩沖溶液(PH6.0);流速0.6mL/min ;柱溫35°C，檢測(cè)器為2414型示差折光檢測(cè)器。如附圖2GPC圖譜所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得夏枯草多糖為平均分子量約為1700K道爾頓。 [0042](6)紅外光譜分析:取多糖樣品約2mg，通過(guò)與KBr混合壓片，放入傅里葉變換紅外光譜內(nèi)，在400 -^OOcnr1區(qū)間進(jìn)行掃描，采集樣品的紅外吸收?qǐng)D譜。如附圖3紅外光譜(IR)所示，多糖樣品在3422CHT1附近的寬峰是O-H鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，2925CHT1左右的較弱的峰是C - H鍵的伸縮振動(dòng)，在1422cm ―1附近均有很小的吸收峰是C - H的變角振動(dòng)峰，證明該夏枯草多糖是一種多糖類物質(zhì)。
[0043](7)單糖組成測(cè)定:多糖樣品首先經(jīng)過(guò)水解成單糖，再經(jīng)衍生化后生成糖腈乙酸酯衍生物，采用氣相色譜分析多糖樣品中的單糖組成，氣相色譜柱為TR - 5MS彈性毛細(xì)管柱，載氣為99.999%高純氦氣，升溫程序:初始柱溫100°C，保持2min，以5°C /min的升溫速度升至280°C，保持5min，流速lmL/min，進(jìn)樣量I μ L，分流比10: 1，進(jìn)樣口溫度250°C。結(jié)果表明該夏枯草多糖樣品含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾百分比含量分別為 24.2%, 55.9%, 1.9%,8.3%,9.7% ο
[0044](8)高碘酸氧化和Smith降解:多糖樣品經(jīng)過(guò)高碘酸氧化，然后再進(jìn)行Smith降解后，進(jìn)行衍生化處理制備糖腈乙酰酯衍生物。采用氣相色譜儀Agilent6890T進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜柱HP - 1701毛細(xì)管柱，檢測(cè)器溫度270°C ;汽化室溫度220°C，升溫程序:初始溫度180°C，以2V /min的升溫速度升至220°C，保持lmin，以5°C /min的升溫速度升至260°C ；載氣氫氣流速40mL/min,空氣流速為450mL/min,氮?dú)饬魉贋?5mL/min,不分流。結(jié)果表明夏枯草多糖含有23.5%的I —和I — 6糖苷鍵，13.1 %的I — 2和I — 4糖苷鍵及63.4%的I —3糖苷鍵。
[0045]綜上所述，本實(shí)施例的多糖是一種呈白色棉絮狀，多糖含量達(dá)98%以上，水溶性好，不含蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)，含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾百分比含量分別為24.2%,55.9%,1.9%,8.3%,9.7%，糖苷鍵由23.5%的I —和I — 6糖苷鍵，13.1%的I — 2和I — 4糖苷鍵及63.4%的I — 3糖苷鍵相連接，存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分枝的高分子量的新型雜多糖。
[0046]實(shí)施例2
[0047](I)將夏枯草果穗干燥后，用粉碎機(jī)粉碎得到夏枯草粉，過(guò)50目篩，稱取300g，加入ISOOg的95% (v/v)乙醇，85°C回流5h，過(guò)濾得殘留物，重復(fù)上述操作3次，殘留物在60°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥48h;[0048](2)稱取(I)中處理后的夏枯草粉200g，加入蒸餾水進(jìn)行水煮浸提，料液質(zhì)量比為1:35,置于超聲場(chǎng)條件下，超聲輸出功率為300W，頻率為50KHz，處理30min，溫度40°C;然后將物料泵入高壓場(chǎng)中，壓力為500MPa，130°C下30min，然后8s內(nèi)減壓到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，將物料泵回超聲場(chǎng)中進(jìn)行超聲處理后，再進(jìn)行高壓處理，循環(huán)周期為5次，離心處理分離提取液，離心力lOOOOg，時(shí)間lOmin，在65°C下減壓濃縮到原體積的1/10，得多糖濃縮液；
[0049](3)在⑵濃縮液中加入Sevag試劑，使?jié)饪s液與Sevag試劑的體積比為6:1，振蕩30min，離心分離糖液，離心力lOOOOg，時(shí)間lOmin，重復(fù)操作20次；
[0050](4)在(3)中處理液中加入大孔樹(shù)脂DlOl，進(jìn)行靜態(tài)吸收，使?jié)饪s液與大孔樹(shù)脂的體積比為2:1，溫度50°C，時(shí)間6h，過(guò)濾得濾液；
[0051](5)在(4)濾液中加入無(wú)水乙醇，邊攪拌邊加入，使乙醇體積濃度達(dá)到85%，4°C下靜置24h，離心15min得沉淀的多糖，離心力lOOOOg，冷凍干燥48h，得夏枯草水溶性粗多糖，經(jīng)檢測(cè)得夏枯草粗多糖的提取率10.13%。
[0052](6)純化:將粗多糖溶于蒸餾水，配制濃度為30mg/mL的多糖溶液，上樣于DEAE -Sepharose柱，上樣量體積與柱體積的比為1: 5，用蒸餾水溶液進(jìn)行洗脫，流速0.5mL/min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法檢測(cè)多糖，將糖反應(yīng)陽(yáng)性收集液合并，65°C下減壓濃縮，冷凍干燥48h得純化的夏枯草多糖，其產(chǎn)率4.82%，呈白色棉絮狀。其平均分子量約為1680K道爾頓，其它結(jié)果基本同實(shí)施例1。
[0053]實(shí)施例3
[0054](I)將夏枯草果穗干燥后，用粉碎機(jī)粉碎得到夏枯草粉，過(guò)40目篩，稱取300g，加入1200g的95% (v/v)乙醇，75°C回流4h，過(guò)濾得殘留物，重復(fù)上述操作2次，殘留物在55°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥30h ；
[0055](2)稱取(I)中處理后的夏枯草粉200g，加入蒸餾水進(jìn)行水煮浸提，料液質(zhì)量比為1:20，置于超聲場(chǎng)條件下，超聲輸出功率為180W，頻率為30KHz，處理20min，溫度30°C ;然后將物料泵入高壓場(chǎng)中，壓力為300MPa，115°C下20min，然后1s內(nèi)減壓到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，將物料泵回超聲場(chǎng)中進(jìn)行超聲處理后，再進(jìn)行高壓處理，循環(huán)周期為4次，離心處理分離提取液，離心力8000g，時(shí)間7min，在55°C下減壓濃縮到原體積的1/8，得多糖濃縮液；
[0056](3)在⑵濃縮液中加入Sevag試劑，使?jié)饪s液與Sevag試劑的體積比為4:1，振蕩25min,離心分離糖液,離心力6000g,時(shí)間8min,重復(fù)操作15次；
[0057](4)在(3)中提取液中加入大孔樹(shù)脂DlOl，進(jìn)行靜態(tài)吸收，使?jié)饪s液與大孔樹(shù)脂的體積比為3:1，溫度45°C，時(shí)間5h，過(guò)濾得濾液；
[0058](5)在(4)濾液中加入無(wú)水乙醇，邊攪拌邊加入，使乙醇體積濃度達(dá)到75%，4°C下靜置18h，離心12min得沉淀的多糖，離心力7000g，冷凍干燥40h，得夏枯草水溶性粗多糖，經(jīng)檢測(cè)得夏枯草粗多糖的提取率為8.89%。
[0059](6)將粗多糖溶于蒸餾7K，配制濃度為25mg/mL的多糖溶液，上樣于DEAE -Sepharose柱，上樣量體積與柱體積的比為1: 4，用蒸餾水溶液進(jìn)行洗脫，流速1.5mL/min,分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法檢測(cè)多糖，將糖反應(yīng)陽(yáng)性收集液合并，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥36h得純化的夏枯草多糖，其產(chǎn)率4.05%，呈白色棉絮狀。其平均分子量約為1770K道爾頓，其它結(jié)果基本同實(shí)施例1。
[0060]實(shí)施例4[0061]實(shí)施例1夏枯草多糖的免疫刺激活性實(shí)驗(yàn)
[0062]實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7
[0063]細(xì)胞培養(yǎng):將小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7分散于新鮮培養(yǎng)基中，并接種于培養(yǎng)瓶，置于37°C，5% (體積分?jǐn)?shù))CO2濃度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基為含有10% (以質(zhì)量百分比計(jì))胎牛血清，100 μ g/mL鏈霉素，100單位/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基。
[0064](I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打制備成單細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整約I X 16個(gè)/mL，即細(xì)胞懸浮液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1001117孔)，置于371:、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)調(diào)零組、實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。調(diào)零組為不含10yL細(xì)胞的空白孔，實(shí)驗(yàn)時(shí)只添加；實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組為含有100 μ L細(xì)胞懸浮液的孔。平板最外層邊緣加入無(wú)菌的PBS溶液，每孔200 μ L0
[0065](2) 24h后，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，往調(diào)零組和空白對(duì)照組加入100 μ L新鮮培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入62.5、125、250、500、1000μ g/mL的不同濃度的多糖樣品10yL,陽(yáng)性對(duì)照組中加入100 μ L的脂多糖(LPS，50y g/mL)(藥液和陽(yáng)性對(duì)照均用不含血清培養(yǎng)基配制)，每個(gè)不同組分樣本設(shè)平行的5個(gè)孔。
[0066](3)繼續(xù)置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。分別用Elisa試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中一氧化氮NO，腫瘤壞死因子TNF- α和白細(xì)胞介素IL-6的含量。檢測(cè)方法采用NO測(cè)試盒(Α013 - 2)購(gòu)買自南京建成生物工程研究所；小鼠TNF - a ELISA試劑盒(EMC102a)，小鼠IL - 6ELISA試劑盒(EMC004)購(gòu)買自欣博盛生物科技有限公司。 [0067]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖4、5、6，與空白組相比，不同濃度的多糖能顯著刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7分泌抗炎因子NO，TNF - α和IL - 6，隨著多糖濃度的增加，細(xì)胞上清液中的NO，TNF - α和IL - 6含量也逐漸增加，當(dāng)多糖濃度為1000 μ g/mL時(shí)，細(xì)胞上清液中的NO，TNF - α和IL - 6含量分別為10 μ mol/L, 850pg/mL, 1600pg/mL。結(jié)果表明該多糖具有顯著的免疫刺激活性。其它實(shí)施例中的多糖樣品的免疫刺激活性與實(shí)施例1樣品相似。
[0068]實(shí)施例5
[0069]實(shí)施例1夏枯草多糖的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)-MTT法
[0070]細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)方法同實(shí)施例5。
[0071](I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7，吹打制備成單細(xì)胞懸液，加入新鮮培養(yǎng)基，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整約5 X 14個(gè)/mL，即細(xì)胞懸浮液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μL孔)，置于37°C、5% (體積分?jǐn)?shù))二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)調(diào)零組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。調(diào)零組不加細(xì)胞，加入100 μ L培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每孔加Λ 10yL細(xì)胞懸浮液。平板最外層邊緣加入無(wú)菌的PBS溶液，每孔200 μ L。
[0072](2) 24h后，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，往調(diào)零組和對(duì)照組加入100 μ L新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入62.5、125、250、500、1000μ g/mL的不同濃度的多糖樣品100 μ L，所有樣品均由培養(yǎng)基配制，每個(gè)不同組分樣本設(shè)平行的5個(gè)孔。
[0073](3)繼續(xù)置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每孔均加入10 μ L的MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μ L的DMS0，振蕩器上振蕩lOmin，在酶標(biāo)儀0D570nm處測(cè)量吸光值A(chǔ)，并計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算公式如下:
[0074]細(xì)胞存活率%=(As - Ao)/(Ac - Ao) X 100[0075]其中As為實(shí)驗(yàn)組的吸光值，Ac是對(duì)照組的吸光值，Ao是調(diào)零組的吸光值。
[0076]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，當(dāng)多糖樣品濃度低于250 μ g/mL，細(xì)胞存活率增加，表明低劑量的多糖樣品能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.5增殖，當(dāng)多糖濃度增加到1000 μ g/mL,細(xì)胞存活率大于90%，表明該多糖樣品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7基本沒(méi)有細(xì)胞毒性。其它實(shí)施例中的多糖樣品的細(xì)胞毒性與實(shí)施例1樣品相似。
[0077]表1
[0078]
【權(quán)利要求】
1.一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過(guò)篩，加入乙醇加熱回流，脫色和除去小分子醇溶性物質(zhì)，過(guò)濾處理得殘留物，殘留物重復(fù)加入乙醇加熱回流2~3次，在45~60°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥24~48h ； (2)將步驟(1)處理所得的夏枯草樣品與蒸餾水配成固液比為1:15~1:35，置于超聲場(chǎng)條件下，超聲輸出功率為100~300W，頻率為15~50KHz，處理時(shí)間10~30min，溫度25~40°C ;然后將物料泵入高壓場(chǎng)中，壓力為100~500MPa，溫度為100~130°C，時(shí)間10~30min，然后5~1s內(nèi)減壓到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，將物料泵回超聲場(chǎng)中進(jìn)行超聲處理后，再進(jìn)行高壓處理，循環(huán)周期為3~5次；所述循環(huán)周期是指物料先超聲處理再進(jìn)行高壓處理的一次循環(huán)過(guò)程；離心分離得提取液，離心力4500~1000g,時(shí)間5~1min,在45~65°C下減壓濃縮到原體積的1/5~1/10，得多糖濃縮液； (3)在多糖濃縮液中加入Sevag試劑，多糖濃縮液與Sevag試劑的體積比為3:1~6:1，振蕩20~30min,離心分離糖液，離心力4500~1000g,離心時(shí)間5~1min,重復(fù)進(jìn)行10~20次； (4)將(3)中脫蛋白后的多糖濃縮液加入到大孔樹(shù)脂，進(jìn)行靜態(tài)吸附，濃縮液與大孔樹(shù)脂的體積比為5:1~2:1，溫度35~50°C，時(shí)間4~6h，過(guò)濾得濾液； (5)在(4)中濾液中加入無(wú)水乙醇，邊攪拌邊加入，使乙醇體積濃度達(dá)到65~85%，4~5°C冷藏室中靜置12~24h，離心得沉淀的多糖，離心力4500~lOOOOg，時(shí)間10~15min,冷凍干燥得夏枯草粗多糖； (6)將夏枯草粗多糖溶于蒸餾水，配制濃度為20~30mg/mL的多糖溶液，上樣于DEAE - S印harose柱，上樣量體積與柱體積的比為1:3~1:5，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速0.5~2mL/min,分管收集,每管5~1mL,苯酹硫酸法檢測(cè)多糖,將糖反應(yīng)陽(yáng)性收集液合并，45~65°C下減壓濃縮，冷凍干燥得純化的夏枯草多糖；所述陽(yáng)性收集液為1/2最大吸光值范圍的收集液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于，所述乙醇體積濃度為95% ;所述過(guò)篩為過(guò)30~50目篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中Sevag試劑為氯仿與正丁醇的混合液，其體積比為3:1~6:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中大孔樹(shù)脂為大孔樹(shù)脂D101，聚酰胺樹(shù)脂或大孔樹(shù)脂D354FD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(6)制備的多糖分子量范圍為1000~4000K道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于，步驟(5)和(6)中所述冷凍干燥是在-50±5°C，0.08~0.1MPa真空度下干燥干燥24~48h，干燥后的樣品中水分的質(zhì)量百分含量低于4%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量的夏枯草多糖的制備方法，其特征在于，所述加入乙醇加熱回流為控制夏枯草粉與乙醇質(zhì)量比為1:3~1:6，溫度65~85°C，回流時(shí)間3 ~5h。
8.一種高分子量的夏枯草多糖，其特征在于其由權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述制備方法制得。
9.根據(jù)權(quán)利要求 8所述夏枯草多糖在制備提高免疫力的臨床藥物和保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK104031171SQ201410220341
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】扶雄, 李超, 黃強(qiáng), 游麗君, 劉瑞海 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué), 廣州粵糖食品科技有限公司