一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法，該方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。本發(fā)明還提供了所述板層角膜基質(zhì)支架在作為角膜基質(zhì)替代物中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法最大程度地減少了對角膜基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的破壞，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，板層結(jié)構(gòu)保留完整，提高了支架材料的生物相容性。
【專利說明】一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及角膜基質(zhì)替代物領(lǐng)域，具體地，涉及一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜位于眼球最表面，直接與外界接觸，容易受到損傷(物理、化學(xué))和感染，一旦發(fā)生病變則會發(fā)生混濁而影響視力，甚至致盲。常見的角膜病變有角膜炎、角膜潰瘍、圓錐角膜、角膜軟化癥和角膜變性等。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，目前全世界有角膜病盲患者近5000萬人，我國有約400萬人。角膜病嚴(yán)重影響了患者們的正常生活、工作與學(xué)習(xí)，生活上需要家人和社會的照顧，增加了家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也加重了全社會的負(fù)擔(dān)。角膜移植是角膜病盲患者恢復(fù)視力和復(fù)明的唯一希望，但由于我國角膜捐獻(xiàn)數(shù)量極其有限，全國每年能進(jìn)行的角膜移植手術(shù)目前僅有3000余例，致使絕大多數(shù)患者因得不到可用的供體角膜而無法重見光明。
[0003]目前，國內(nèi)外同類產(chǎn)品主要以羊膜、膠原及其他合成高分子材料用于角膜移植研究，但都存在不同的缺陷。羊膜相對較薄，僅適用于治療眼表淺度損傷。合成材料的透明性和穩(wěn)定性較差，在降解過程中降解產(chǎn)物可引起局部PH值下降，術(shù)區(qū)出現(xiàn)非特異性無菌性炎癥反應(yīng)率較高。膠原是組織工程常用的材料，但純膠原韌性差，易碎，降解過快，手術(shù)后一段時間內(nèi)就發(fā)生碎裂，無法達(dá)到復(fù)明的效果，因此目前仍停留在基礎(chǔ)研究階段。相比而言，異種角膜基質(zhì)材料來源豐富，具有與正常角膜基質(zhì)相似的組織結(jié)構(gòu)，移植之后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度不變。天然的角膜基質(zhì)層存在著某些生長因子，可促進(jìn)細(xì)胞的生長、繁殖和分化，而且免疫原性低，神經(jīng) 可以長入，有利于角膜知覺的恢復(fù)。此外，由于異種移植供體來源的動物，如豬，在生理上與人類具有高度相似性，故其組織或器官被認(rèn)為是理想的供體之一，以豬作為異種移植供體來源的研究比較深入，豬的組織器官(如心臟瓣膜、胰島細(xì)胞、凝血因子等)已用于人類疾病的治療，異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)已被批準(zhǔn)用于臨床。豬角膜基質(zhì)含有角膜細(xì)胞生長所必需的I型膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有良好的生物相容性，能夠成為有效的角膜基質(zhì)替代物。
[0004]異種移植供體來源的動物(如豬)的角膜基質(zhì)組織中含有自身固有的細(xì)胞，需經(jīng)過脫細(xì)胞處理才能獲得無免疫原性或免疫原性較低的角膜基質(zhì)替代物?，F(xiàn)有的角膜基質(zhì)替代物主要通過將動物源性角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理獲得，且酶消化一般采用含有胰酶的緩沖液進(jìn)行處理。這樣的方法對制備得到的角膜基質(zhì)替代物的膠原板層結(jié)構(gòu)破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較低，并不能完全滿足臨床移植的要求。
[0005]因此，研發(fā)一種能夠完全脫除異種移植供體來源的動物(如豬)角膜基質(zhì)中的細(xì)胞成分，對膠原板層結(jié)構(gòu)破壞極小，使所得角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整且膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規(guī)則且透光率較高的角膜基質(zhì)替代物的制備方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有方法對制備得到的角膜基質(zhì)替代物的膠原板層結(jié)構(gòu)破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較低，并不能完全滿足臨床移植要求的缺陷，提供一種膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規(guī)則且透光率較高的板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在制備板層角膜基質(zhì)支架時，采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行酶消化處理，并在酶消化處理之后干燥處理之前進(jìn)行超聲處理，不僅能夠完全脫除角膜基質(zhì)中的細(xì)胞成分，而且能夠最大程度地減少對角膜基質(zhì)膠原板層結(jié)構(gòu)的破壞，使所得角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整且膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規(guī)則、透光率高，與人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有理想的生物相容性，能夠最大程度地滿足移植要求。
[0008]因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。
[0009]第二方面，本發(fā)明提供了所述方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架。
[0010]第三方面，本發(fā)明還提供了所述板層角膜基質(zhì)支架在作為角膜基質(zhì)替代物中的應(yīng)用。 [0011]本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架，來源豐富，生物相容性及生物安全性好，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整；理化性能良好，角膜透光率為70% -80% ;機(jī)械強(qiáng)度高，能夠耐受手術(shù)縫線牽拉、韌性良好并能長期應(yīng)用于臨床，主要用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、疤痕、化學(xué)或熱燒傷等致盲性眼病，將病變處被損壞的角膜切除并將同樣尺寸的板層角膜基質(zhì)支架植入患者眼中，能夠達(dá)到構(gòu)建健康角膜組織、改善患者視力的效果。
[0012]本發(fā)明方法中，為了最大程度地使支架材料滿足移植要求，對各步驟的條件包括時間、溫度、酶種類選擇及酶濃度、超聲頻率及超聲時間等進(jìn)行了詳細(xì)周密的設(shè)計和嚴(yán)格反復(fù)的驗證。通過一系列實(shí)驗的優(yōu)化，使本發(fā)明的方法具有以下特點(diǎn):
[0013]I)本發(fā)明方法的工藝流程簡單可靠，周期短。
[0014]2)本發(fā)明方法采用的原料來源廣泛，成本低，使用方便。
[0015]3)本發(fā)明的方法，最大程度地減少了對角膜基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的破壞，膠原纖維排列整齊，無細(xì)胞殘留，前彈力層及基底膜都保留，便于上皮層的生長，提高了支架材料的生物相容性。
[0016]4)本發(fā)明方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架，通過自檢、型式檢驗驗證了該產(chǎn)品的安全性，結(jié)果顯示其機(jī)械性能、理化性能及生物學(xué)性能都滿足臨床移植的要求。
[0017]5)本發(fā)明方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架，適合用于基質(zhì)層異常角膜的臨床移植，使眾多角膜基質(zhì)異?；颊咧匾姽饷鞒蔀榭赡埽瑸榻M織工程角膜產(chǎn)業(yè)提供了重要的技術(shù)支持。
[0018]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖。
[0020]圖2是正常人角膜板層結(jié)構(gòu)的冰凍切片圖。
[0021]圖3是本發(fā)明對比例I制備得到的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖。
[0022]圖4是本發(fā)明對比例2制備得到的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0024]第一方面，本發(fā)明提供了一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其中，酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在無菌條件下切取角膜基質(zhì)片前，一般先將新鮮動物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS緩沖液可以為I XPBS緩沖液。
[0026]對于酒精和妥布霉素的濃度以及浸泡時間沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的濃度和浸泡時間。優(yōu)選情況下，酒精的體積百分濃度為70-80%，進(jìn)一步優(yōu)選為75% ;妥布霉素的濃度為30000-50000U/L，進(jìn)一步優(yōu)選為40000U/L ;浸泡時間為10_30s。
[0027]對于切取的角膜基質(zhì)片的直徑和厚度沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的角膜基質(zhì)片的直徑和厚度。優(yōu)選情況下，切取的角膜基質(zhì)片的直徑為8-10mm，厚度為200-600 μ mD
[0028]為了提高制得的板層角膜基質(zhì)支架和人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性，優(yōu)選情況下，動物為豬、?；蚝?，進(jìn)一步優(yōu)選為豬。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的方法，低滲溶脹處理的方法可以包括:將切取的角膜基質(zhì)片放在低滲液中浸泡至溶脹。對于低滲液沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的各種低滲液，為了能夠更好地脹破細(xì)胞膜和核膜，優(yōu)選情況下，低滲液為三蒸水。為了使角膜基質(zhì)片在低滲液中溶脹至合適的程度，優(yōu)選情況下，浸泡的時間為8-12h。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的方法，為了最大程度地減少對角膜基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的破壞，更好地驟縮驟脹細(xì)胞膜和核膜，進(jìn)而使細(xì)胞膜和核膜破損，優(yōu)選情況下，反復(fù)凍融的條件包括:冷凍時間為30-60min，冷凍溫度為-200~_50°C，融化時間為15_30min，融化溫度為30_40°C，循環(huán)次數(shù)為2-5次。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的方法，為了更充分地破壞核酸，完全脫除細(xì)胞，完整保留板層結(jié)構(gòu)，且使得膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，使制得的板層角膜基質(zhì)支架與人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有更好的生物相容性，優(yōu)選情況下，酶消化處理的條件包括=DNA酶與緩沖液的體積比為1:500-1500，RNA酶與緩沖液的體積比為1:1500-2500，溫度為30_40°C，時間為2_4h。對于緩沖液的種類沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的用于DNA酶和RNA酶的緩沖液，例如可以為Tris-Hcl緩沖液、Hanks緩沖液或IXPBS緩沖液。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法，為了使膠原纖維束更好地形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，優(yōu)選情況下，超聲處理的條件包括:溫度為20-40°C，超聲功率為200-500W,超聲時間為2-5h。超聲采用的超聲儀可以為本領(lǐng)域常用的各種超聲儀，只要能夠控制超聲儀的參數(shù)，使得溫度為20-40°C，超聲功率為200-500W，超聲時間為2_5h即可。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，該方法還可以包括:在酶消化處理之后超聲處理之前、超聲處理之后干燥處理之前將角膜基質(zhì)片進(jìn)行清洗。對于清洗的條件沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的清洗條件。優(yōu)選情況下，在搖床上用無菌三蒸水清洗3-5次，搖床的轉(zhuǎn)速為100-200rpm，每次清洗的時間為5_15min。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的方法，對于干燥處理的條件沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的各種條件。為了進(jìn)一步提高制得的板層角膜基質(zhì)支架的生物相容性，優(yōu)選情況下，干燥處理的條件包括:在無菌條件下，用20-37°C的空氣吹干或在20-37°C下烘干，干燥時間為2_5d。
[0035]對于滅菌的條件沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的各種滅菌條件。為了更好地去除制得的板層角膜基質(zhì)支架的抗原性，優(yōu)選情況下，滅菌的條件包括:采用鈷-60或電子束輻照滅菌，輻照劑量為20-30kGy。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法還可以包括將滅菌后的板層角膜基質(zhì)支架進(jìn)行復(fù)水處理。對于復(fù)水處理的條件沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的各種條件。優(yōu)選情況下，復(fù)水劑為生理鹽水、I XP BS溶液或DMEM培養(yǎng)液，復(fù)水時間為12_24h。
[0037]本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架。
[0038]本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架為動物源性脫細(xì)胞板層角膜基質(zhì)片，不含細(xì)胞成分，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，透光率為70% -80%。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的方法可知，本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架可以以干燥的板層角膜基質(zhì)支架和復(fù)水的板層角膜基質(zhì)支架這兩種形式存在。復(fù)水的板層角膜基質(zhì)支架是以干燥的板層角膜基質(zhì)支架為基礎(chǔ)，經(jīng)過復(fù)水處理得到的板層角膜基質(zhì)支架。
[0040]本發(fā)明還提供了板層角膜基質(zhì)支架在作為角膜基質(zhì)替代物中的應(yīng)用。
[0041]本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架可用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、疤痕、化學(xué)或熱燒傷等角膜病變。
[0042]實(shí)施例
[0043]以下的實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0044]以下實(shí)施例和對比例中，將用生理鹽水充分浸泡的角膜基質(zhì)支架材料，平整緊密地貼在比色皿內(nèi)壁，加生理鹽水，以不貼角膜基質(zhì)支架材料的比色皿加生理鹽水作為對照，采用紫外-可見光分光光度計(型號:UV-5300型，上海元析儀器有限公司)測定角膜基質(zhì)支架材料在不同波長下(400nm、500nm、600nm、700nm、800nm)的透光率,然后計算平均值。
[0045]冰凍切片的方法為:將用生理鹽水復(fù)水的板層角膜基質(zhì)支架材料浸潤在OCT包埋劑中，在_80°C的環(huán)境中速凍30min，然后固定在樣品托上，修片，用冰凍切片機(jī)(型號:Thermo Cryotome FE型,美國賽默飛世爾科技公司)切片(厚度為10 μ m),烤片2h,采用H.E染色法進(jìn)行染色后，用光學(xué)顯微鏡(型號:CKX-41SF，日本奧林巴斯公司)進(jìn)行觀察。
[0046]實(shí)施例1
[0047]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法。
[0048](I)取豬眼球，并將新鮮的豬眼球用體積百分濃度為75%的酒精浸泡20s，在超凈臺內(nèi)，用角膜刀直接切取直徑為9mm，厚度為400 μ m的角膜基質(zhì)片；[0049](2)將切取的角膜基質(zhì)片放在三蒸水中浸泡IOh ；
[0050](3)將步驟(2)得到的低滲溶脹的角膜基質(zhì)片放在無菌的凍存管內(nèi)，反復(fù)凍融，冷凍時間為40min，冷凍溫度為_80°C，融化時間為20min，融化溫度為37°C，循環(huán)次數(shù)為3次；
[0051](4)將經(jīng)反復(fù)凍融的角膜基質(zhì)片放在含有DNA酶和RNA酶的Tris-Hcl緩沖液中進(jìn)行酶消化處理，DNA酶與Tris-Hcl緩沖液的體積比為1:1000，RNA酶與Tris-Hcl緩沖液的體積比為1:2000，在37 °C的恒溫箱中處理3h ；
[0052](5)將經(jīng)過酶消化處理的角膜基質(zhì)片在搖床上用無菌三蒸水清洗3次，搖床的轉(zhuǎn)速為150rpm，每次清洗的時間為IOmin ;然后將角膜基質(zhì)片置于超聲儀中，進(jìn)行超聲處理，超聲儀參數(shù)設(shè)定分別為:溫度為30°C，超聲功率為300W，超聲時間為3h ；
[0053](6)將經(jīng)超聲處理的角膜基質(zhì)片在搖床上用無菌三蒸水清洗3次，搖床的轉(zhuǎn)速為150rpm，每次清洗的時間為IOmin ;然后將角膜基質(zhì)片置于平皿中在超凈臺內(nèi)進(jìn)行吹干處理，吹干時間為3d，即得到干燥的板層角膜基質(zhì)支架，然后采用鈷-60輻照滅菌，輻照劑量為25kGy，保存?zhèn)溆茫?br>
[0054](7)將滅菌后的干燥的板層角膜基質(zhì)支架用生理鹽水復(fù)水24h，即得到可移植的復(fù)水的板層角膜基質(zhì)支架。
[0055]本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架的透光率為80%。
[0056]本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架(已脫細(xì)胞，放大倍數(shù)為40倍)的冰凍切片圖見圖1，正常人角膜板 層結(jié)構(gòu)(未脫細(xì)胞，放大倍數(shù)為40倍)的冰凍切片圖見圖2。將圖1和圖2比較可知，本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架具有與人角膜基質(zhì)細(xì)胞相同的結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整。
[0057]實(shí)施例2
[0058]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法。
[0059](I)取牛眼球，并將新鮮的牛眼球用含妥布霉素的I XPBS溶液(妥布霉素的濃度為40000U/L)浸泡30s，在超凈臺內(nèi)，用角膜刀直接切取直徑為8mm，厚度為200 μ m的角膜基質(zhì)片;
[0060](2)將切取的角膜基質(zhì)片放置于三蒸水中浸泡8h ；
[0061](3)將步驟(2)得到的低滲溶脹的角膜基質(zhì)片放在無菌的凍存管內(nèi)，反復(fù)凍融，冷凍時間為30min，冷凍溫度為-200°C，融化時間為30min，融化溫度為40°C，循環(huán)次數(shù)為2次；
[0062](4)將經(jīng)反復(fù)凍融的角膜基質(zhì)片放在含有DNA酶和RNA酶的I XPBS緩沖液中進(jìn)行酶消化處理，DNA酶與I X PBS緩沖液的體積比為1:1500，RNA酶與I X PBS緩沖液的體積比為1:2500，在30 0C的恒溫箱中處理4h ；
[0063](5)將經(jīng)過酶消化處理的角膜基質(zhì)片在搖床上用無菌三蒸水清洗4次，搖床的轉(zhuǎn)速為IOOrpm，每次清洗的時間為15min ;然后將角膜基質(zhì)片置于超聲儀中，進(jìn)行超聲處理，超聲儀參數(shù)設(shè)定分別為:溫度為20°C，超聲功率為500W，超聲時間為2h ；
[0064](6)將經(jīng)超聲處理的角膜基質(zhì)片在搖床上用無菌三蒸水清洗4次，搖床的轉(zhuǎn)速為IOOrpm，每次清洗的時間為15min ;然后將角膜基質(zhì)片置于平皿中在超凈臺內(nèi)進(jìn)行吹干處理，吹干時間為5d，即得到干燥的板層角膜基質(zhì)支架，然后采用鈷-60輻照滅菌，輻照劑量為20kGy，保存?zhèn)溆?；[0065](7)將滅菌后的干燥的板層角膜基質(zhì)支架用IXPBS溶液復(fù)水12h，即得到可移植的復(fù)水的板層角膜基質(zhì)支架。
[0066]本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架的透光率為70%。
[0067]本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖同圖1，即，本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架具有與人角膜基質(zhì)細(xì)胞相同的結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整。
[0068]實(shí)施例3
[0069]本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法。
[0070](I)取猴眼球，并將新鮮的猴眼球用體積百分濃度為80%的酒精浸泡10s，在超凈臺內(nèi)，用角膜刀直接切取直徑為10mm，厚度為600 μ m的角膜基質(zhì)片；
[0071](2)將切取的角膜基質(zhì)片放置于三蒸水中浸泡12h ；
[0072](3)將步驟(2)得到的低滲溶脹的角膜基質(zhì)片放在無菌的凍存管內(nèi)，反復(fù)凍融，冷凍時間為60min，冷凍溫度為_50°C，融化時間為15min，融化溫度為30°C，循環(huán)次數(shù)為5次；
[0073](4)將經(jīng)反復(fù)凍融的角膜基質(zhì)片放在含有DNA酶和RNA酶的Hanks緩沖液中進(jìn)行酶消化處理，DNA酶與Hanks 緩沖液的體積比為1:500，RNA酶與Hanks緩沖液的體積比為1:1500，在40°C的恒溫箱中處理2h ；
[0074](5)將經(jīng)過酶消化處理的角膜基質(zhì)片在搖床上用無菌三蒸水清洗5次，搖床的轉(zhuǎn)速為200rpm，每次清洗的時間為5min ;然后將角膜基質(zhì)片置于超聲儀中，進(jìn)行超聲處理，超聲儀參數(shù)設(shè)定分別為:溫度為40°C，超聲功率為200W，超聲時間為5h ；
[0075](6)將經(jīng)超聲處理的角膜基質(zhì)片在搖床上用無菌三蒸水清洗5次，搖床的轉(zhuǎn)速為200rpm，每次清洗的時間為5min ;然后將角膜基質(zhì)片置于平皿中在37°C烘箱內(nèi)進(jìn)行無菌烘干，烘干時間為2d，即得到干燥的板層角膜基質(zhì)支架，然后采用電子束輻照滅菌，輻照劑量為30kGy，保存?zhèn)溆茫?br>
[0076](7)將滅菌后的干燥的板層角膜基質(zhì)支架用DMEM培養(yǎng)液復(fù)水20h，
[0077]即得到可移植的復(fù)水的板層角膜基質(zhì)支架。
[0078]本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架的透光率為75%。
[0079]本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖同圖1，即，本實(shí)施例制得的板層角膜基質(zhì)支架具有與人角膜基質(zhì)細(xì)胞相同的結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整。
[0080]試驗例
[0081]對本發(fā)明實(shí)施例1-3制得的板層角膜基質(zhì)支架進(jìn)行生物學(xué)性能及生物安全性研究，檢測方法和結(jié)果見表1。
[0082]表1
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酶消化處理的條件包括:DNA酶與緩沖液的體積比為1:500-1500, RNA酶與緩沖液的體積比為1:1500-2500，溫度為30_40°C，時間為2—4h0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述超聲處理的條件包括:溫度為20-40°C，超聲功率為200-500W，超聲時間為2-5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述在無菌條件下切取新鮮動物眼球的角膜基質(zhì)片的方法包括:先將新鮮動物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡，再在無菌條件下切取角膜基質(zhì)片；所述酒精的體積百分濃度優(yōu)選為70-80%，所述妥布霉素的濃度優(yōu)選為30000-50000U/L，所述浸泡時間優(yōu)選為10_30s ;所述切取的角膜基質(zhì)片的直徑優(yōu)選為8-10mm，厚度優(yōu)選為200-600 μ m ;所述動物優(yōu)選為豬、?；蚝?，進(jìn)一步優(yōu)選為豬。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述低滲溶脹處理的方法包括:將切取的角膜基質(zhì)片放在低滲液中浸泡至溶脹，所述低滲液為三蒸水，所述浸泡的時間為8-12h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述反復(fù)凍融的條件包括:冷凍時間為30-60min，冷凍溫度為-200~_50°C，融化時間為15_30min，融化溫度為30_40°C，循環(huán)次數(shù)為2-5次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述干燥處理的條件包括:在無菌條件下，用20-37°C的空氣吹干或在20-37°C下烘干，干燥時間為2_5d ;所述滅菌的條件包括:采用鈷-60或電子束輻照滅菌，輻照劑量為20-30kGy。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述方法還包括將滅菌后的板層角膜基質(zhì)支架進(jìn)行復(fù)水處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述復(fù)水處理的條件包括:復(fù)水劑為生理鹽水、IXPBS溶液或DMEM培養(yǎng)液，復(fù)水時間為12_24h。
10.權(quán)利要求1-9中任意一項所述的方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架。
11.權(quán)利要求10所述的板層角膜基質(zhì)支架在作為角膜基質(zhì)替代物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/36GK104001214SQ201410230365
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】李青, 王寶泉, 彭艷婷, 王紅梅, 李海燕 申請人:青島中皓生物工程有限公司