一種金納米顆粒在制備抗凝血劑或抗血小板劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種由取代嘧啶分子修飾的金納米顆粒在制備抗凝血劑或抗血小板劑中的用途。所述修飾金納米顆粒的取代嘧啶分子為2-巰基-4,6-二氨基嘧啶、2-巰基-4-氨基嘧啶或2-巰基4,6-二羥基嘧啶之中的一種或至少兩種的混合。本發(fā)明將沒有抗凝活性的取代嘧啶部分和沒有抗凝活性的金納米顆粒通過S-Au鍵相連，并首次應(yīng)用于抗凝領(lǐng)域，所得的取代嘧啶修飾的金納米顆粒取得了出乎意料的抗凝效果，且制備方法簡單，所述納米顆粒粒徑分布小，顆粒在水中分散性好，在正常劑量下不會引起出血副作用，可以用于制備抗凝血劑或抗血小板劑。
【專利說明】一種金納米顆粒在制備抗凝血劑或抗血小板劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種金納米顆粒的應(yīng)用，更具體地，涉及一種取代嘧啶修飾的金納米顆粒在制備抗凝血劑或抗血小板劑中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]靜脈血栓是人類因心血管相關(guān)疾病死亡的第三大殺手，而抗凝血藥物是目前最有效的預(yù)防和治療藥物(Mackman, N.，Nature2008，451 (7181)，914—918)。目前常用的抗凝血藥物肝素和華法林鈉等容易在使用過程中造成出血等副作用，且容易和其他事物和藥物發(fā)生相互作用，影響藥效的發(fā)揮，使用時(shí)需要對其進(jìn)行藥物監(jiān)測(Goldhaber，S.Z.；Bounameaux, H., Lancet2012, 379(9828), 1835-1846 ；Palareti,G.,et al., Lancetl996，348 (9025)，423-428)。人們一直想通過研制新型抗凝血藥物來解決傳統(tǒng)藥物中出現(xiàn)的問題，但是進(jìn)展緩慢，并且很難替代現(xiàn)有藥物(Apostolakis, S., et al., Cardiovasc.Ther.2011，29(6)，el2_e22)。
[0003]金納米顆粒具有很多優(yōu)點(diǎn)，例如尺寸可控，表面容易修飾，生物相容性好，目前被廣泛用于生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域(Boisselier, E.；Astruc, D., Chem.Soc.Rev.2009，38 (6)，1759-1782)。在金納米顆粒眾多優(yōu)勢中，其多價(jià)效應(yīng)尤其引人注意，已經(jīng)被應(yīng)用與很多藥物的研發(fā)和創(chuàng)新中。比如將一些抗癌藥物分子(腫瘤壞死因子或者紫杉醇)修飾在金納米顆粒表面，可以達(dá)到比原藥更強(qiáng)的抗腫瘤效果，并且可以逆轉(zhuǎn)某些腫瘤對這些藥物的耐藥性(Paciotti, G.F., et al., Drug Deliv.2004, 11 (3), 169-183 ；Paciotti, G.F.，et al.，Drug Dev.Res.2006，67 (I)，47-54)，這主要是因?yàn)榻鸺{米顆粒比表面積大，且容易修飾，所以可以連接很多藥物分子，提高藥物局部濃度，增強(qiáng)藥效。且金納米顆粒生物相容性好，尺寸較小，可靶向腫瘤組織，減少藥物毒副作用，且由于尺寸效應(yīng)不易被細(xì)胞排出，可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性。類似的現(xiàn)象也在抗生素藥物的研究中被發(fā)現(xiàn)，將萬古霉素連接在金顆粒表面可以逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性，降低最小抑菌濃度(MIC) (Gu, H.，et al., Nano Lett.2003，3 (9)，1261-1263)。不僅如此，某些無活性的小分子，比如一些抗菌藥物前體小分子，修飾在金顆粒表面也會發(fā)揮強(qiáng)大的抗菌作用，不僅可以對抗超級細(xì)菌，還不容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性(Zhao，Y.，et al., J.Am.Chem.Soc.2010，132(35)，12349-12356)。專利 CN102188383 公開了一種氨基嘧啶修飾的金納米顆粒，其可廣泛地用于抗菌藥物的制備。此外，某些抗病毒藥物的前體修飾在金顆粒表面可以抑制HIV-1病毒所造成的細(xì)胞融合(Bowman, M.C., et al., J.Am.Chem.Soc.2008，130(22)，6896-6897)。
[0004] 目前將金納米顆粒的多價(jià)效應(yīng)應(yīng)用在開發(fā)新型抗凝血藥物的研究還很少。人們將凝血酶、核酸配適體或者肝素連接在金納米顆粒表面，確實(shí)可用于提高抗凝參數(shù)，但是這種方法很難控制表面配體的數(shù)量，對其是否會造成出血也沒有進(jìn)行評價(jià)(Liao, Y.J.，et al.，Langmuir2012, 28 (24)，8944-8951 ；Hsu, C.L.，etal., Chem.Eur.J.2011, 17 (39)，10994-11000 ；Shiang, Y.C., et al., Adv.Funct.Mater.2010，20(18)，3175-3182)。
[0005]嘧啶這種小分子是很多治療性藥物的前藥，可以利用其合成抗菌藥以及抗凝藥物等(Lagorio, S.H.，et al., Eur.J.Med.Chem.2006, 41 (11), 1333-1338 ；Gangjee, A., et al., J.Med.Chem.2007, 50 (13), 3046-3053 ；Bruno, 0., et al., Bioorg.Med.Chem.2006, 14 (I)，121-130)。取代嘧啶可以被可控地連接于金納米顆粒表面，所得顆粒物理化學(xué)穩(wěn)定，并且可以發(fā)揮強(qiáng)大的抗菌作用(Zhao, Y., et al., J.Am.Chem.Soc.2010, 132(35)，12349-12356)。同時(shí)嘧啶也是目前在研究的一些抗凝藥物的合成前體，這些抗凝藥物在前期研究中顯示出了比現(xiàn)有藥物更為有效的抗凝活性，且不容易造成出血副反應(yīng)，但是合成過程過于復(fù)雜(Abdelhafez, 0.M., et al., Bioorg.Med.Chem.2010, 18 (10)，3371-3378)。因此，本領(lǐng)域急需尋找一種具有優(yōu)異抗凝效果、不造成出血副反應(yīng)且合成方便的新型抗凝藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明首次將取代嘧啶修飾的金納米顆粒應(yīng)用于抗凝血劑或抗血小板劑的制備，取得了出乎意料的抗凝效果。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種由取代嘧啶分子修飾的金納米顆粒在制備抗凝血劑或抗血小板劑中的用途。所述取代嘧啶分子修飾的金納米顆粒為取代嘧啶部分和金納米顆粒通過S-Au鍵相連所形成的納米顆粒。所述修飾金納米顆粒的取代嘧啶分子為2-巰基-4，6- 二氨基嘧啶、 2-巰基-4-氨基嘧啶或2-巰基-4，6- 二羥基嘧啶之中的一種或多種的混合。即所述納米顆粒中的金元素可結(jié)合一種取代嘧啶分子，也可通過其多價(jià)效應(yīng)結(jié)合兩種或更多上述取代嘧啶分子。單一氨基嘧啶分子修飾的金納米顆粒包含2-巰基-4，6-二氨基嘧啶修飾的金納米顆粒(簡稱Au_DAPT)，2-巰基-4-氨基嘧啶修飾的金納米顆粒(簡稱Au_APT)和2-巰基-4，6- 二羥基嘧啶修飾的金納米顆粒(簡稱Au_DHPT);混合氨基嘧啶分子修飾的金納米顆粒包含2-巰基-4，6- 二氨基嘧啶和2-巰基-4-氨基嘧啶共同修飾的金納米顆粒(簡稱Au_DAPT/APT)，2-巰基-4，6- 二氨基嘧啶和2-巰基-4，6- 二羥基嘧啶嘧啶共同修飾的金納米顆粒(簡稱Au_DAPT/DHPT)，2-巰基-4-氨基嘧啶和2-巰基-4，6- 二羥基嘧啶共同修飾的金納米顆粒(簡稱Au_APT/DHPT)和上述三種氨基嘧啶分子共同修飾的金納米顆粒(簡稱Au_DAPT/APT/DHAPT)。優(yōu)選地，所述修飾金納米顆粒的取代嘧啶分子為2-巰基-4，6- 二氨基嘧啶(簡稱Au_DAPT)。
[0008]所述取代嘧啶分子修飾的金納米顆粒中，取代嘧啶部分沒有抗凝活性，未取代的金納米顆粒也沒有抗凝活性，然而當(dāng)取代嘧啶部分中的巰基與金元素通過S-Au鍵相連時(shí)，所得的取代嘧啶修飾的金納米顆粒取得了出乎意料的抗凝效果。
[0009]所述金納米顆粒中金元素與取代喃唳分子的摩爾含量比為1:0.5~1:2。例如1:
0.5，1:0.75，1:1，1:1.5或1:2。對其中摩爾含量比不同的金納米顆粒進(jìn)行電鏡圖片掃描，經(jīng)分析可知當(dāng)Au和取代嘧啶的摩爾含量比過大時(shí)，所得的金納米顆粒粒徑較大，較易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象。當(dāng)Au和取代嘧啶的摩爾含量比為1:0.5到1:2時(shí)，金納米顆粒分散性較好，同時(shí)當(dāng)Au和取代嘧啶的摩爾含量比為1:1時(shí)，其表面分子密度最高，具有更好的抗凝效果。優(yōu)選地，所述金納米顆粒中金元素與取代嘧啶分子的摩爾含量比為1:1，粒徑為3nm左右。
[0010]所述金納米顆粒平均粒徑的范圍為I~10nm。當(dāng)所述金納米顆粒中金元素與取代嘧啶分子的摩爾含量比為1:1時(shí)，所述金納米顆粒平均粒徑的范圍為2.8~3.8nm。
[0011]本發(fā)明所述的取代嘧啶修飾的金納米顆粒，其制備方法包括以下步驟:將氯金酸與取代嘧啶溶解混合形成混合溶液；還原劑例如硼氫化鈉或抗壞血酸鈉還原上述混合溶液中的氯金酸形成取代喃唳修飾的金納米顆粒；純化氨基喃唳修飾的金納米顆粒。
[0012]本發(fā)明所述的金納米顆?？刹捎渺o脈注射、腹腔注射的給藥方式。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述金納米顆粒在小鼠中采用尾靜脈注射的給藥方式。所述金納米顆粒用于治療和/或預(yù)防血栓，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述金納米顆粒用于預(yù)防小鼠尾部血栓，在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述金納米顆粒用于預(yù)防小鼠肺栓。所述金納米顆粒單獨(dú)使用或與其它抗凝血劑或抗血小板劑聯(lián)合用藥，所述抗凝血劑或抗血小板劑為預(yù)防性抗凝血劑或抗血小板劑。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具備以下優(yōu)點(diǎn):
[0014](I)本發(fā)明將沒有抗凝活性的取代嘧啶部分，沒有抗凝活性的未取代的金納米顆粒通過S-Au鍵相連，并首次應(yīng)用于抗凝領(lǐng)域，所得的取代嘧啶修飾的金納米顆粒取得了出乎意料的抗凝效果。
[0015](2)較已知文獻(xiàn)報(bào)道的金納米顆粒，本發(fā)明所述的取代嘧啶修飾的金納米顆粒，制備方法簡單，納米顆粒粒徑分布小，顆粒在水中分散性好，能在4°C或-20°C保存至少一年，凍干顆粒仍可溶于水。
[0016](3)在正常劑量下，本發(fā)明所述的金納米顆粒不會引起出血副作用，克服了傳統(tǒng)抗凝藥物的一大缺點(diǎn)，是一種新型高效副作用小的抗凝血劑或抗血小板劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明所述的Au_DAPT的結(jié)構(gòu)。
[0018]圖2為本發(fā)明所述的Au_DAPT的透射電鏡圖片。
[0019]圖3為具有不同Au與DAPT摩爾含量比的金納米顆粒的電鏡圖片。
[0020]圖4為具有不同Au與DAPT摩爾質(zhì)量比的金納米顆粒連同對照DAPT、肝素、檸檬酸金的凝血時(shí)間測試圖。
[0021]圖5為金納米顆粒延長動物凝血時(shí)間圖。
[0022]圖6為金納米顆粒對小鼠APTT和PT的影響。
[0023]圖7為金納米顆粒對小鼠尾部血栓的影響。
[0024]圖8為金納米顆粒對小鼠肺栓塞的影響，其中(a)為不同組別的小鼠存活率，(b)為對照組和金納米顆粒組的肺部組織圖。
[0025]圖9為金納米顆粒是否導(dǎo)致動物出血圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0027]實(shí)施例1取代嘧啶修飾的金納米顆粒Au_DAPT的制備
[0028](I)配置反應(yīng)溶液
[0029]配置5mM氯金酸甲醇溶液:將4Img氯金酸溶于20mL無水甲醇；
[0030]配置IOmM的2_巰基_4，6_ 二氨基嘧啶溶液:將14mg的2_巰基-4，6- 二氨基嘧啶(DAPT)加入IOmL無水甲醇中，并加入200 μ L無水乙酸和50 μ L吐溫80，超聲溶解；
[0031] 配置60mM硼氫化鈉甲醇溶液:將12mg硼氫化鈉溶于3mL甲醇，即配即用；
[0032](2)還原反應(yīng)制得納米金顆粒
[0033]在冰浴下，將20mL氯金酸甲醇溶液和IOmL的2_巰基_4，6_ 二氨基嘧啶溶液混合放入50mL圓底燒瓶中，使用磁子攪拌IOmin ；
[0034]加快攪拌速度，滴加硼氫化鈉甲醇溶液，在2min之內(nèi)滴完，之后降低攪拌速度繼續(xù)在冰浴下攪拌lh，得到深紅色溶液；
[0035](3)純化 Au_DAPT
[0036]將得到的深紅色溶液通過旋蒸法除去甲醇，加入5mL純水，用截留分子量為14KDa的透析袋在純水中透析48h(每3-4h換一次水)；透析后的金納米溶液經(jīng)0.22m微孔濾器過濾除菌，得到的Au_DAPT水溶液可在4°C保存或凍干后_20°C保存。Au_DAPT的結(jié)構(gòu)和TEM圖見圖1和圖2。
[0037]實(shí)施例2取代嘧啶修飾的金納米顆粒Au_APT和Au_DHPT的制備
[0038]Au_APT (APT為2_巰基_4_氨基嘧啶)和Au_DHPT (DHPT為2巰基-4，6- 二羥基嘧啶)的合成方法與Au_DAPT相似，將DAPT換成等摩爾的APT和DHPT即可。
[0039]實(shí)施例3對具有不同金元素與取代嘧啶分子摩爾含量比的金納米顆粒的考察
[0040]分別制備Au和DAPT的摩爾含量比分別為1:0.125,1:0.25,1:0.5、1:1、1:2，分別對其進(jìn)行透射電鏡表征，如圖3所示。，當(dāng)Au和DAPT的配比為1:0.125到1:0.25的時(shí)候，部分金納米顆粒粒徑較大，較易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象。當(dāng)Au和DAPT配比為1:0.5到1:2的時(shí)候，金納米顆粒分散性較好，粒徑為3nm左右。
[0041]表1不同金納米顆粒的表面分子密度
【權(quán)利要求】
1.一種由取代嘧啶分子修飾的金納米顆粒在制備抗凝血劑或抗血小板劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述修飾金納米顆粒的取代嘧啶分子為2-巰基_4，6- 二氨基嘧啶、2-巰基-4-氨基嘧啶或2-巰基4，6- 二羥基嘧啶之中的一種或至少兩種的混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述修飾金納米顆粒的取代嘧啶分子為2-巰基-4，6- 二氨基嘧啶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述金納米顆粒中金元素與取代嘧啶分子的摩爾含量比為1:0.5~1:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述金納米顆粒中金元素與取代嘧啶分子的摩爾含量比為1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述金納米顆粒平均粒徑的范圍為I~IOnm0
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所 述的用途，其特征在于，所述金納米顆粒平均粒徑的范圍為2.8~3.8nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述金納米顆?？刹捎渺o脈注射或腹腔注射的給藥方式。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述金納米顆粒單獨(dú)使用或與其它抗凝血劑或抗血小板劑聯(lián)合用藥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述抗凝血劑或抗血小板劑為預(yù)防性抗凝血劑或抗血小板劑。
【文檔編號】A61P7/02GK103976958SQ201410231394
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】蔣興宇, 田月, 趙玉云, 張偉 申請人:國家納米科學(xué)中心